《生物技术大实验》实验指导书dpd.docx

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1、生物技技术大实实验实实验指导导书前 言生物技技术大实实验是是为生物物技术专专业本科科高年级级学生开开设的综综合实验验课程，是是在普通通生物学学实验、生生物化学学实验、微微生物实实验、细细胞生物物学和遗遗传学实实验的基基础上的的综合实实验课程程。该实实验课程程偏重于于分子生生物学实实验教学学，通过过此实验验课程，学学生不仅仅学习到到最基本本的分子子生物学学技术，而而且学习习到前沿沿的生物物技术。分子生物物学实验验技术突突飞猛进进，日新新月异。分分子生物物学技术术的广泛泛应用，在在20世世纪下半半叶对生生命科学学的进步步产生了了举世公公认的巨巨大推动动作用，而而且对人人们的生生活和整整个社会会的发

2、展展亦产生生了巨大大的冲击击和影响响。分子子生物学学技术已已广泛渗渗透和应应用到生生物学、遗遗传学、细细胞学、微微生物学学、进化化学、肿肿瘤学、免免疫学、药药理学、发发育学、病病毒学、神神经生物物学、生生药学、法法医学等等与基础础医学和和临床医医学有关关的研究究领域。221世纪纪将更是是分子生生物学技技术快速速发展的的时期，由由此引起起的生物物技术革革命并将将更加深深刻地影影响社会会的发展展。学生基本本技能和和动手能能力的培培养都离离不开实实验室，离离不开实实验课上上的训练练，很多多理论上上的原理理都需要要到实验验课上去去验证，很很多理论论上的知知识都需需要到实实验课上上去实践践。而实实验课教

3、教材或实实验指导导书是开开好实验验课的基基本条件件之一。 虽然目目前的分分子生物物学实验验教材版版本众多多，但针针对本科科生的生生物技术术大实验验教材尚尚无出版版。为了了加强本本学科的的教材建建设，促促进本学学科实验验课的开开设，我我们参考考了国内内外最新新的有关关分子生生物学实实验技术术的专著著，根据据我校学学生的特特点及我我们自己己现有的的基础和和条件，特特选择了了部分实实验内容容，并结结合我们们的经验验与体会会，汇编编成了生生物技术术大实验验实验指指导书，以以供参考考。在使使用过程程中，可可根据不不同的层层次适当当增减。同同时，对对于新近近产生和和应用前前景广阔阔的生物物芯片技技术、RR

4、NAii技术和和蛋白质质组研究究等，限限于我们们目前的的条件，只只能作些些演示或或作为动动态给以以介绍，条条件一经经成熟，即即行开设设。由于分子子生物学学技术和和生物技技术的快快速发展展，加之之我们是是第一次次这样系系统地给给学生开开设生物物技术大大试验课课程，许许多工作作还处于于不断探探索的过过程中，难难免有不不妥和疏疏漏之处处，恳切切期望读读者提出出宝贵意意见，以以利不断断修正完完善。 编 者目 录实验一 质粒的的提取和和纯化. 3实验二 质粒DDNA的的电泳和和纯度检检测.6实验三 PCRR产物的的TA克克隆.9实验四 感受受态大肠肠杆菌细细胞的制制备.112实验五 重组组DNAA转化大

5、大肠杆菌菌.12实验六 PCRR扩增基基因特异异片段.155实验七 DNNA片段段的回收收及纯化化.119实验八 PCRR法快速速鉴定重重组载体体.222实验九 限制制性内切切酶酶切切法鉴定定重组质质粒.224实验十 外源基基因在大大肠杆菌菌中的表表达及其其检测.28实验十一一 RNNA的提提取及其其纯度检检测32实验十二二 逆转转录PCCR（RRT-PPCR）扩扩增基因因特异片片段.355实验十三三 DDNA探探针制备备.38实验十四四 SSoutheern印印迹杂交交441实验十五五 NNorttherrn印迹迹杂交444实验十六六 荧荧光原位位杂交（FISH）技术47实验十七七 外外源基

6、因因在哺乳乳细胞中中的表达达及其检检测.550实验十八八 生生物芯片片技术.553实验十九九 RRNAii技术56实验二十十 蛋蛋白质组组技术.558附录 基基因工程程基本技技术路线线.60实验一 质粒的的提取和和纯化实验目的的：了解解碱裂解解法制备备质粒的的原理，掌掌握质粒粒的小量量制备方方法。实验原理理：质粒粒DNAA的抽提提是基因因工程操操作中最最常用与与最基本本的技术术，现已已有多种种成熟的的方案可可供选择择。最常常用的有有利用碱碱性条件件下质粒粒DNAA与染色色体DNNA变复复性的不不同进行行分离的的碱法；利用酸酸性、低低离子强强度时超超螺旋在在水相中中，开环环、线型型分子在在酚相中

7、中进行分分离的酸酸酚法；利用羟羟基磷灰灰石在特特定的条条件下(8moolLL尿素，00.24mmolL磷酸酸缓冲液液pH6.88)只吸吸附双链链DNAA的羟基基磷灰石石法(在在上述条条件下染染色体DDNA均均成单链链，质粒粒DNAA保持双双链)等等。本实实验选做做的是碱碱法。1. 裂裂解细胞胞 裂裂解细胞胞是指通通过溶菌菌酶、去去污剂等等试剂破破裂细胞胞壁与膜膜的过程程。对于于不同的的菌要选选用不同同的方法法，通常常有煮沸沸法、非非离子型型去污剂剂法、碱碱性SDDS法(简称碱碱法)等等。三种种方法比比较而言言，非离离子型去去污剂法法较温和和，适用用于抽提提10kkb左右右的质粒粒；而煮煮沸法与

8、与碱性SSDS法法相对较较剧烈，只只能抽提提小于110kbb的质粒粒。常用用的离子子型去污污剂是SSDS、非非离子型型去污剂剂有TrritoonX-1000等。2分离离 即即将质粒粒DNAA和染色色体DNNA分离离。碱法法的分离离原理如如下：大大肠杆菌菌的染色色体约有有47000kbb长，在在处理细细胞过程程中都断断裂成不不同长度度的双链链DNAA片段。当当溶液的的pH调调到大于于12时时双链DDNA中中的氢键键被破坏坏，于是是染色体体DNAA的双链链分离成成单链；而超螺螺旋状态态的质粒粒DNAA仅仅是是氢键被被破坏，并并只发生生部分双双链解离离成单链链的变化化。再当当pH调调回中性性时单链链

9、DNAA互相缠缠绕且与与蛋白质质结合生生成网络络状大分分子，而而超螺旋旋的质粒粒发生复复性反应应后仍是是小分子子，通过过离心的的方法很很容易将将二者分分开，达达到分离离的目的的。3纯化化 细细胞裂解解液中的的杂质除除了染色色体DNNA外还还有各种种细胞壁壁、膜碎碎片、蛋蛋白质、脂脂质类物物质及RRNA。纯纯化的步步骤就是是有针对对性地将将它们去去除。RRNA可可用牛胰胰Rnasee A分分解除去去。蛋白白质可通通过酚、酚酚氯仿仿、氯仿仿异戊戊醇，使使蛋白质质变性剂剂而除去去，同时时，氯仿仿有强烈烈的溶脂脂倾向，对对于在除除去蛋白白质的同同时去除除脂质类类杂质很很有好处处。氯仿仿还能将将微量的的

10、、溶于于DNAA水溶液液的酚抽抽提掉，而而微量的的酚对于于以后的的酶切、转转化等过过程都会会产生不不利影响响。氯仿仿异戊戊醇的蛋蛋白质变变性能力力较弱，主主要用于于含酚试试剂处理理后的抽抽提。正确的去去除蛋白白质杂质质的过程程应该是是酚一酚酚+氯仿仿（(11:1)）一一氯仿（或或氯仿异戊醇醇24:1)，处处理，根根据实验验情况也也可考虑虑省略第第一或第第二步，但切记不可将氯仿（氯仿异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。实验内容容：试剂1.

11、LBB培养液液(1LL)细菌培养养用蛋白白胨 110g细菌培养养用酵母母粉 55gNaCll 110g用10mmolLNaaOH调调至pHH7.0，高高压蒸气气灭菌, 4贮存.2溶液液，可成成批配置置，灭菌菌后4贮存。葡萄糖50mmmolLTriss-C11(pHH8.0)25mmmolLEDTAA10mmmolL3溶液液(新鲜鲜配制)NaOHH0.2moolLL SDS114溶液液5mollL KAcc60mll冰醋酸11.55ml水28.55ml配制好的的溶液含3mmolL钾盐，55mollL 醋酸(pH44.8)卡那霉素素(Kaana): 550mgg/mll, 过过滤除菌菌.5重蒸蒸酚

12、 市售苯苯酚蒸馏馏纯化(收集11791811之间的的酚)后后，用TTE饱和和，使水水相的ppH在77.5以上上，4保存。6氯仿仿 异异戊醇(24:1)7无水水乙醇8RNNaseeA(110mggmll)93mmolL NaAAc(ppH5.2)10TTE 110mmmolL Triis-CC1(ppH8.0) 1mmmoIL EDTTA材料 含有质质粒(ppNTEE-EGGFP, pEEGFPPN3)的大肠肠杆菌DDH5aa.操作步骤骤 1挑挑取琼脂脂培养板板上的含含有pNNTE-EGFFP, pEGGFPNN3质粒粒的单菌菌落，接接种至55ml LB培培养液(含Kaana 50gmm1)，3

13、7振荡培养过夜。 2取取出1.5mll培养液液至1.5mll离心管管中，112 0000rrmiin离心心2miin，弃弃上清。 3将将细菌沉沉淀重悬悬于1000l预冷的的溶液工工中，强强烈振荡荡混匀。 4加加入2000l溶液，盖严严管盖，轻轻轻颠倒倒混匀55次，冰冰浴5mmin。 5加加入1550l预冷的的溶液，温和和振荡110s，冰浴浴5miin。 6112 0000rrmiin 室室温离心心5miin，取取上清至至一个新新的无菌菌的1.5m1Epppenddorff管中。 7加入等等体积酚酚氯仿仿(1:1)，振振荡混匀匀，122 0000rminn离心22minn，上清清转移至至另一个个

14、Epppenddorff管中。【注意】酚具有腐蚀性，操作时小心。 88加人人等体积积氯仿，振振荡混匀匀，122 0000rmin离离心2mmin，上上清转移移至另一一个Epppenndorrf管中中。 100加入入2倍体体积预冷冷无水乙乙醇-20沉淀110miin。 111122 0000rminn离心110miin，去去上清，沉沉淀用770乙乙醇洗涤涤一次，空空气中晾晾干。 122加入入20l TEE溶解质质粒DNNA，加加入RNNaseeA，终终浓度220gmm1 337水浴00.5h。13 经经0.7琼琼脂糖凝凝胶电泳泳，EBB染色后后观察抽抽提结果果。【注注意】EEB为致致癌物，操操作

15、时一一定要戴戴乳胶或或一次性性手套。 144将该该管质粒粒保存于于-200备用。注意事项项1该实实验成功功的标志志是把染染色体DDNA、蛋蛋白质与与RNAA去除干干净，获获得一定定得率的的质粒DDNA。去去掉染色色体DNNA最为为重要，也也较困难难，因为为在全部部提取过过程中，只只有一次次机会去去除染色色体DNNA，其其关键步步骤是加加入溶液液与溶液液时，控控制变性性与复性性操作时时机，既既要使试试剂与染染色体DDNA充充分作用用使之变变性，又又要使染染色体DDNA不不断裂解解成小片片段，从从而能与与质粒DDNA相相分离。这这就要求求试剂与与溶菌液液充分摇摇匀，摇摇动时用用力适当当，一般般来说

16、当当溶液加入时时可用力力振荡几几次，因因为此时时细菌还还没有与与碱和SSDS作作用，染染色体DDNA尚尚未释放放，不必必担心其其分子断断裂，加加入SDDS后，则则要注意意不能过过分用力力振荡，温温和混匀匀,但又又必须让让它反应应充分。加加入溶液液II混混匀之后后,一定定在冰上上放置,不要摇摇动,对对于溶液液溶液IIII,同样处处理! 2. 加入入溶液II之前,注意将将离心管管倒扣过过来,将将培养基基完全流流出. 2加乙醇醇沉淀DDNA时时，要把把离心管管加盖倒倒翻摇动动455次，注注意观察察水相与与乙醇之之间没有有分层现现象之后后，才可可以放在在冰箱中中去沉淀淀DNAA,以获获得更多多的DNN

17、A。 3乙醇沉沉淀DNNA离心心后，要要把离心心管四周周的上清清液抽干干或自然然挥发(可将离离心管倒倒置于滤滤纸上以以尽量让让管内液液体流出出)。否否则，用用TE缓缓冲液溶溶解DNNA时，既既困难又又不完全全。 4为了得得到纯净净的DNNA样品品和清晰晰的电泳泳条带，加加入1l RRNA酶酶，将管管置500水浴箱箱内300minn，消化化RNAA。 6抽提产产物经电电泳分离离、EBB染色后后，在紫紫外线灯灯下可观观察到三三个条带带，自前前往后分分别为：超螺旋旋、线性性及开环环质粒DDNA。【思考题题】碱法提取取质粒的的原理是是什么？【课外阅阅读】高纯度质质粒DNNA的提提取,参参阅Qiiage

18、en公司司说明书书,网站站:m实验二 质粒DDNA的的电泳和和纯度检检测实验目的的：掌握握DNAA琼脂糖糖电泳技技术，了了解紫外外分光光光度法测测定DNNA浓度度和纯度度的原理理。实验原理理：带电电荷的物物质在电电场中的的趋向运运动称为为电泳。其其中，凝凝胶电泳泳由于其其操作简简单、快快速、灵灵敏等优优点，使使它成为为分离、鉴鉴定和提提纯核酸酸的首选选标准方方法。 与蛋白白质分子子类似，核核酸分子子也是两两性解离离分子。在在pH33.5时时，碱基基上的氨氨基基团团解离，而而三个磷磷酸基团团中只有有第一个个磷酸解解离，整整个分子子带正电电荷，在在电场中中向负极极泳动；在pHH值为88.08.33

19、时，碱碱基几乎乎不解离离，磷酸酸全部解解离，核核酸分子子带负电电荷，向向正极移移动。不不同大小小和构象象的核酸酸分子的的电荷密密度大致致相同，在在自由泳泳动时，各各核酸分分子的迁迁移率区区别很小小，难以以分开。所所以采用用适应浓浓度的凝凝胶介质质作为电电泳支持持物，发发挥分子子筛的功功能，使使得分子子大小和和构象不不同的核核酸分子子泳动率率出现较较大差异异，达到到分离的的目的。值值得注意意的是，等等长度的的单链DDNA和和双链DDNA在在中性或或碱性凝凝胶中的的迁移率率大致相相等。 1影影响泳动动的四大大因素 (1)影响泳泳动的首首要因素素是电泳泳样品的的物理性性质：包包括电荷荷多少、分分子大

20、小小、颗粒粒形状和和空间结结构。一一般来说说颗粒带带电荷的的密度愈愈大，泳泳动速率率愈快；颗粒物物理形状状愈大，与与支持物物介质摩摩擦力越越大，泳泳动速度度越小。即即泳动率率与颗粒粒的分子子大小，介介质粘度度成反比比；与颗颗粒所带带电荷成成正比。在在检测未未知DNNA分子子量时，DDNA分分子的空空间构型型不同，即即使相同同的分子子量其迁迁移率也也不同。如如质粒DDNA存存在闭环环(型，CCC)，单单链开环环(型，OOC)和和线性(型，LL)。三三者之间间的迁移移速率，一一般为型型型，但但是有时时也会出出现相反反的情况况，因为为与琼脂脂糖浓度度、电流流强度、离离子强度度及溴乙乙锭染料料含量有有

21、关。当当胶浓度度较高或或电场强强度较大大时，型DNNA与型DNNA互换换位置，而而型DNNA总是是迁移最最慢。 (2)支持物物介质：DNAA的凝胶胶电泳常常使用两两种支持持材料：琼脂糖糖和聚丙丙烯酰胺胺凝胶。通通过这两两种介质质的浓度度变化调调整所形形成凝胶胶的分子子筛网孔孔大小，分分离不同同分子量量的核酸酸片段。琼琼脂糖凝凝胶的孔孔径大，可可以分离离长度为为1000bp至至近600kb的的DNAA分子；聚丙烯烯酰胺凝凝胶的孔孔径小，可可分离小小片段(55500bbp)DDNA，效效果最好好。因此此，选用用不同的的凝胶种种类和浓浓度可以以分辨大大小不同同的DNNA片段段。(3)电电场强度度：电

22、泳泳场两极极间单位位支持物物长度的的电压降降即为电电场强度度或电压压梯度。电电场强度度愈大，带带电颗粒粒的泳动动速率愈愈快，但但凝胶的的有效分分离范围围随电压压的增大大而减小小。在低低电压时时，线性性DNAA分子的的泳动率率与电压压成正比比。一般般凝胶电电泳的电电场强度度不超过过5Vcm；对于大大分子量量真核基基因组DDNA片片段的电电泳常采采用0.511.0VVcmm电泳过过夜，以以取得较较好的分分辨率和和整齐的的带型。电电压1000020000V，电电场强度度206000Vccm的电电泳为高高压电泳泳，必须须用聚丙丙烯酰胺胺做介质质。(4)缓缓冲液离离子强度度：缓冲冲液是电电泳场中中的导体

23、体，它的的种类、ppH值、离离子浓度度直接影影响电泳泳的效率率。Trris.C1缓缓冲体系系中，由由于Cll的泳动动速度比比样品分分子快得得多，易易引起带带型不均均一现象象，所以以常利用用TAEE、TBBE和TTPE三三种缓冲冲体系。缓缓冲液的的pH值值直接影影响DNNA解离离程度和和电荷密密度，缓缓冲液ppH值与与DNAA样品的的等电点点相距越越远，样样品所携携带电荷荷量越多多，泳动动速度越越快。DDNA电电泳缓冲冲液，常常采用偏偏碱性或或中性条条件，使使核酸分分子带负负电荷，向向正极泳泳动。缓缓冲液的的离子强强度与样样品泳动动速度成成反比，电电泳的最最适离子子强度一一般在00.0220.2

24、之间间。2指示示剂 电泳过过程中，常常使用一一种有颜颜色的标标记物以以指示样样品的迁迁移过程程。核酸酸电泳常常用的指指示剂有有是溴酚酚蓝，溴溴酚蓝呈呈蓝紫色色，分子子量为6670DDa，在在不同浓浓度凝胶胶中，迁迁移速度度基本相相同，它它的分子子筛效应应小，近近似于自自由电泳泳，故被被普遍用用作指示示剂。在在0.66，11，22的琼琼脂糖凝凝胶中，溴溴酚蓝的的迁移率率分别与与1kbb，0.6kbb和0.15kkb的双双链线性性DNAA片段大大致相同同。指示示剂一般般加在电电泳上样样缓冲液液中，为为了使样样品能沉沉人胶孔孔，还要要加入适适量的蔗蔗糖、聚聚蔗糖4400或或甘油以以增加比比重。3染色

25、色剂核酸需经经过染色色才能显显示出带带型，最最常用的的是溴乙乙锭染色色法。溴溴乙锭(ethhidiium broomidde，EEB)是是一种荧荧光染料料，这种种扁平分分子可以以嵌入核核酸双链链的配对对碱基之之间，在在紫外线线激发下下，发出出红色荧荧光。EEB-DDNA复复合物中中的EBB发出的的荧光，比比游离的的凝胶中中的EBB本身发发出的荧荧光强大大10倍倍，因此此不需要要洗净背背景就能能清楚地地观察到到核酸的的电泳带带型。通通常，可可以在凝凝胶中加加入终浓浓度为00.5gmm1的EEB，这这样在电电泳过程程中可以以随时观观察核酸酸的迁移移情况，这这种方法法适用于于一般性性的核酸酸监测。也

26、也可以在在电泳结结束后用用0.55gmm1的EEB溶液液染色110-115miin后进进行紫外外观察，由由于EBB在可见见光下易易分解，故故应存棕棕色瓶中中于4条件下下保存。注意：EB有潜在的致癌危险，操作时必须戴乳胶手套或一次性手套。实验内容容：试剂(1)质质粒pNNTE-EGFFP。(2)琼琼脂糖。(3)110mggmll溴乙锭锭溶液。(4)DDNA分分子量参参照物（marker）。(5)550TAEE电泳缓缓冲液。(6)110溴酚蓝蓝上样缓缓冲液。2器材材(1)恒恒温水浴浴(2)电电泳槽(3)电电泳仪(4)微波炉炉(5)紫紫外线检检测仪(6)移移液器；1000-10000l， 10-10

27、00l,00.5-10l操作步骤骤电泳(1) 称取1.0 gg琼脂糖糖，加入入1000ml11TAEE电泳缓缓冲液中中。(2) 加热或沸沸水浴后后使琼脂脂糖溶解解。(3) 凝胶冷至至60左右，加加入溴乙乙锭至终终浓度为为0.55gmm1。(4) 将琼脂糖糖溶液倒倒人模具具，凝胶胶厚度一一般为00.30.55cm，检检查有无无气泡。室室温下115330miin后，琼琼脂糖溶溶液完全全凝固。(5) 连接电泳泳槽与电电泳仪之之间的电电源线，正正极为红红色，负负极为黑黑色。(6) 取掉模具具两端的的胶布，放放入电泳泳槽，加加样孔在在负极端端。(7) 加入1TAEE电泳缓缓冲液至至电泳槽槽中，液液面高于

28、于胶面11mm，小小心取出出梳子。(8) 取5ll实验一一制备的的质粒DDNA，在在DNAA样品中中加入11100的上样样缓冲液液并混匀匀。(9) 用移液器器将DNNA样品品加入梳梳孔中。(10)接通电电源，DDNA样样品往正正极移动动。电压压选择为为355Vccm。注注意：长长度以两两个电极极之间的的距离计计算。(11)根据指指示剂迁迁移的位位置，判判断是否否终止电电泳；切切断电源源后，含含EB的的凝胶可可以直接接于紫外外线灯下下观察结结果或拍拍照记录录。浓度和纯纯度分析析：1 取110l DDNA 用TEE缓冲液液稀释至至1mll，混匀匀。以无无DNAA的TEE为空白白，测定定样品在在26

29、00nm和和2800nm波波长下的的光密度度吸收值值，每个个样品重重复3次次，取33次结果果的平均均值作为为最终结结果。2 换算算出ODD2600/ODD2800的比值值，较纯纯的DNNA，该该值在11.6-1.88之间。3 根据据双链DDNA 1 OOD2660nmm=50mg，计算算出样品品DNAA的浓度度，计算算公式为为所测的的OD2660nmm50/10（mg/ml）附录一、核核酸换算算数据dsDNNA10kbb=6.601106Dalltonn1 ODD2600nm=50mgssDNNA10kbb=3.301106Dalltonn1 ODD2600nm=40mgRNA10kbb=3.

30、451106Dalltonn1 ODD2600nm=40mg附录二、琼琼脂糖凝凝胶浓度度与线性性DNAA的最适适分辨范范围琼脂糖凝凝胶浓度度线性DNNA的最最适分辨辨范围（bbp）0.5%0.7%1.0%1.2%1.5%2.0%1，0000-330,0000800-12,0000500-1,0000400-7,0000200-3,000050-22,0000实验三 PCRR产物的的TA克克隆实验目的的：掌握握通过TTA连接接克隆PPCR产产物的原原理和方方法。实验原理理：通过过PCRR的方法法扩增目目的基因因片断的的过程中中，由于于往往不不清楚目目的基因因的DNNA序列列，获得得的目的的片断通

31、通常需要要通过TTA克隆隆的方法法，重组组到T-载体中中，通过过序列测测定清楚楚DNAA序列。由由于在PPCR过过程中，使使用的DDNA聚聚合酶不不同，往往往分为为2种情情况：（11）使用用不同的的Taqq酶，在在PCRR扩增循循环结束束后，加加上722 100分钟一一个过程程，Taaq酶可可以在扩扩增产物物的3末末端加上上A，因因此PCCR产物物回收纯纯化后可可以和TT载体直直接连接接。（22）使用用高保真真的DNNA聚合合酶，如如pfuu酶，由由于其不不能在扩扩增产物物的3末末端加上上A，得得到的DDNA序序列为钝钝端，因因此，需需要在回回收纯化化后进行行加A的的过程，通通常是以以PCRR

32、回收产产物为模模板，加加上一定定量的普普通Taaq酶和和反应液液，加入入dATTP（或或dNTTP）， 72 100分钟，然然后将加加A产物物直接用用于TAA连接。下图是大大连宝生生物公司司的T载载体及其其说明书书。pMD 18-T VVecttor是是一种高高效克隆隆PCRR产物 (TA Clooninng) 的专用用载体。它它是TaaKaRRa独自自研究开开发，由由pUCC18载载体改建建而成的的。在ppUC118载体体的多克克隆位点点处的XXbaII和SallI识别位位点之间间插入了了EcooR V识别位位点，用用EcooR V进行酶酶切反应应后，再再在两侧侧的3端添加加“T”而成成。因

33、大大部分耐耐热性DDNA聚聚合酶反反应时都都有在PPCR产产物的33末端端添加一一个“AA”的特特性,所所以使用用本制品品可大大大提高PPCR产产物的连连接、克克隆效率率。本制制品是以以最为常常用的ppUC118载体体为基础础研制而而成，所所以它具具有同ppUC118载体体完全相相同的功功能。此此外，本本制品中中的高效效连接液液Liggatiion Sollutiion I可以在在极短的的时间内内 (330分钟钟-1小时) 完成连连接反应应，大大大地方便便了实验验操作。另另外，本本制品中中还含有有Conntrool IInseert (5000 bbp)，可可用于CConttroll反应。用途

34、：克克隆PCCR产物物。对克克隆后的的PCRR产物用用M133 Prrimeers进进行DNNA测序序。互补和和蓝白筛筛选的原原理：许许多载体体（包括括pMDD18-T）都都具有一一段大肠肠杆菌半乳糖糖苷酶的的启动子子和编码码其N端端氨基酸酸（肽链）的的片断基基因。宿宿主具有有编码半乳糖糖苷酶的的C端基基因。当当二者产产物组合合在一起起，就具具有活性性酶的产产生，此此现象称称为互补。由由互补形形成的具具有功能能活性的的半乳糖糖苷酶,可以用用X-ggal显显色测定定出来，它它能将无无色的化化合物XXgall切割成成半乳糖糖和蓝色色底物。当当外源DDNA片片断插入入到多克克隆位点点后，就就会破坏坏

35、肽链的的阅读框框，从而而不能合合成与受受体菌内内的半乳糖糖苷酶相相互补的的活性肽链，而而导致不不能形成成功能活活性的半乳糖糖苷酶，因因此含有有重组质质粒载体体的克隆隆往往是是白色的的，而没没有插入入外源片片断的则则是蓝色色的。实验内容容：试剂pMD 18-T VVecttor试试剂盒，或或自己PPCR扩扩增回收收纯化的的片段，TT4DNNA链接接酶。IIPTGG，X-gall，LBB培养基基等。 2200mmg/mml的IIPTGG 过滤滤除菌 220mgg/mll的Xgall 溶于于二甲基基甲酰胺胺，避光光保存。操作步骤骤1. 在在微型离离心管中中制备下下述连接接反应液液，全量量为100 m

36、l。*取0.5 mll进行实实验也可可得到满满意的结结果。实实际操作作时，可可按实验验需要使使用适量量的T载体。2. 116反应300分钟 (过夜反反应也不不影响连连接效率率)。3. 全全量 (10ml) 转化化至JMM1099感受态态细胞 (1000 mll)中。4. 在在含有440ml 20mmg/mml的XX-Gaal、4ml 2000mgg/mll的IPTTG、50-1100mgg/mll Ammp的L-琼脂脂平板培培养基上上培养，形形成单菌菌落。计计数白色色、蓝色色菌落。5. 挑挑选白色色菌落，使使用PCCR法确确认T载体中中插入片片段的长长度大小小。注意事项项：1. LLigaat

37、ioon SSoluutioon II请于冰冰中融解解。2. 在进进行克隆隆时，VVecttor DNAA和Inssertt DNNA的摩摩尔比一一般为：1: 2 100。在本本制品中中， ppMD118-TT Veectoor 11 ml (500 ngg) 的的摩尔数数约为00.033 pmmol，Conntrool IInseert DNAA 1ml (50 ng) 的摩摩尔数约约为0.15 pmool。3. 克隆时时使用的的Inssertt DNNA片段段 (PPCR 产物) 尽量进进行切胶胶回收纯纯化，PPCR产产物中的的短片段段DNAA(甚至至是电泳泳也无法法确认的的非特异异性小片

38、片段)、残存存引物等等杂质都都会影响响TA克隆隆的效率率。4. 按照照本实验验操作进进行连接接后，直直接进行行转化时时的连接接液不要要超过220 mll。当进进行转化化的DNNA用量量较大或或准备进进行电转转化时，需需对连接接液进行行乙醇沉沉淀，纯纯化DNNA后再再进行转转化。55. 连连接反应应请在116下进行行，温度度升高 (26) 较难难形成环环状DNNA。6. 连接效效率偏低低时，可可适当延延长连接接时间至至数小时时。7. 感受受态细胞胞可使用用适合于于pUCC系列载载体的感感受态细细胞，如如：JMM1099，DHH5a等。相关问题题怎样提高高pMDD18-T VVecttor的的克隆

39、效效率?1. 纯纯化PCCR产物物。切胶胶回收的的PCRR片段最最好2. 除除去残存存的引物物等杂质质。3. DDNA片片段的立立体结构构、DNNA片段段的长短短都会影影响克隆隆效率。一一般情况况下，大大片段DDNA的的克隆效效率（连连接效率率与转化化效率）小小于短片片段DNNA，在在使用大大片段DDNA的的连接液液进行转转化时，建建议采用用电转化化方法。 PCR产产物难以以插入载载体，为为什么?1. 确确认PCCR反应应使用的的DNAA聚合酶酶在PCCR产物物的3端是否否附加了了A。有有些DNNA聚合合酶扩增增的PCCR产物物是平端端, 如如使用本本公司的的Pyrrobeest DNAA聚合

40、酶酶 (TTaKaaRa Codde: DR0005) 等扩扩增得到到的PCCR产物物不能直直接用于于TA克隆隆；PCCR产物物保存时时间不要要过长, 长时时间保存存的PCCR产物物会脱去去末端的的A碱基基。2. PPCR产产物中短短片段杂杂质DNNA太多多，这时时应切胶胶回收纯纯化DNNA片段段，回收收时PCCR产物物不要在在紫外线线下暴露露时间过过长。3. 确确认感受受态细胞胞的转化化效率，使使用的感感受态细细胞的转转化效率率最好大大于1008cfuu/mg pUCC1188 DNNA。4. 确确认Liigattionn Sooluttionn I的连接接效率是是否降低低，多次次反复冻冻融

41、会降降低的LLigaatioon SSoluutioon II连接效效率。5. 确确认抗生生素的浓浓度是否否过大。6. 最最好使用用新配制制的平板板培养基基。转化后的的菌落全全为蓝色色 (或淡淡蓝色)，为什什么?插入的PPCR片片段较短短（小于于5000 bpp)，且且插入片片段没有有影响llacZZ基因的的读框时时，平板板培养基基上出现现的菌落落有可能能呈现蓝蓝色。插入的PPCR产产物进行行测序时时，可使使用何种种引物?本制品的的载体来来源于ppUC118载体体。因此此，用于于pUCC18载载体测序序的引物物都可以以使用。实验四 感受态大肠杆菌细胞的制备 实验验五 重组DDNA转转化大肠肠杆

42、菌实验目的的 掌掌握CaaCl22制备感感受态大大肠杆菌菌的方法法和化学学转化法法。实验原理理 通通过冰冷冷的CaaCl22溶液处处理大肠肠杆菌，细细菌处于于0、CaaCl22低渗液液中，菌菌细胞膨膨胀成球球形，使使之处于于短暂的的“感受态态”，在这这期间，细细菌能够够摄取各各种不同同的外源源DNAA片段或或基因，使使受体细细胞获得得供体基基因的某某些性状状，质粒粒DNAA的转化化是重组组DNAA技术中中重要的的一环。常用的转转化方法法1化学学法转化化 包包括了CCaCll2、氯化化钙氯氯化铷、MMgCll2等方法法，所有有化学法法转化均均需制备备感受态态细胞。 通过化化学方法法，可人人工诱导

43、导细菌细细胞进入入感受态态，最经经典的是是CaCCl2法（119722年），其其原理是是细菌处处于0、CaaCl22低渗液液中，菌菌细胞膨膨胀成球球形，转转化混合合物中的的DNAA与钙离离子结合合形成抗抗DNaase的的羟基-钙磷酸酸复合物物粘附于于细胞表表面，经经42短时间间热冲击击处理，促促进细胞胞吸收DDNA复复合物；通过在在丰富培培养基中中恢复11h左右右，球状状细胞复复原，转转化子中中的抗性性基因得得以表达达；随后后将菌液液涂布于于含抗生生素的选选择性培培养基平平板上，转转化子可可分裂、增增殖，形形成菌落落。转化效率率是衡量量菌体处处于感受受态的细细胞多少少的指标标，一般般定义为为1

44、g环状状质粒DDNA在在感受态态细胞过过量的情情况下产产生转化化子的个个数。CCa2+处理的的感受态态细胞，转转化效率率可达11051006个转化化子g环化化DNAA。影响转化化率的关关键因素素：生长时时期：实实验发现现在对数数中期的的大肠杆杆菌易生生成感受受态。转转化时菌菌浓度应应控制在在不超过过1077mll。CaCCl2法0放置时时间的影影响：细细菌经00CaCCl2处理后后转化率率随时间间的推移移而增加加，244h达到到最高，之之后转化化率逐渐渐下降。化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上，联合其他二价金属离子(如Mn2+，CO2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化率提高1001000倍。质粒大小、构型的影响：通过构建相同复制起点的不同大小质粒进行转化时发现，从2kb到32kb的转化效率上升，此后到66kb转化效率线性下降。同时，开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75，线型质粒的转化率更要低1001000倍，线型转化率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解的原因。菌株基因型recA+与recA的影响：recA基因是rec系列中最主要的基因，编码同源重组蛋白。考虑到质粒DNA在recA+菌中存在与细