生物芯片的研究与开发fyvh.docx

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1、生物芯片片的研究究与开发发1.分子子印章法法DNAA芯片原原位合成成技术: 结合合组合化化学合成成与软光光刻微印印刷技术术的原理理，采用用成熟的的寡核苷苷酸固相相合成工工艺，在在预先制制作的弹弹性印章章上实现现空间寻寻址的核核酸原位位合成：将不同同的寡核核苷酸（或或多肽）合合成试剂剂涂抹在在凹凸不不平的印印章表面面并将其其压印到到基片特特定位点点进而进进行偶联联固定。开开发出高高密度基基因芯片片设计软软件，并并成功制制备位点点尺寸为为30微微米的高高宽比（大大于255）分子子印章；建立了了一套用用于高密密度基因因芯片制制备装置置，并成成功将软软光刻原原位合成成应用到到DNAA芯片和和肽核酸酸芯

2、片的的制备中中。合成成偶联效效率大于于97%，255个碱基基的寡核核苷酸正正确率大大于700%。制制备出6655336/ccm2阵列的的寡核酸酸芯片，杂杂交结果果表明该该芯片能能够有效效区分单单碱基错错配序列列。获得得美国专专利项项，中国国专利22项， 并有55项中国国专利处处于二审审中。在在Laiingmmur，中中国科学学等杂志志上发表表论文116篇。该技术已通过江苏省科学技术厅鉴定。如能建立分子印章法批量化生产的寡核苷酸微阵列芯片的原位合成试生产线，制备出高质量、标准化、低成本的寡核苷酸微阵列芯片来检测与分析基因表达谱、图1基于软光刻技术的高密度基因芯片制备装置。自行研制的用于高密度基因

3、芯片制备的实验装置（左图）；表面亲水处理的PDMS分子印章的电镜照片和全貌图（右图）基因突变变体、免免疫反应应、受体体结合、蛋蛋白质结结合、药药物分子子等非核核酸类的的分子识识别/结结合领域域，其应应用将遍遍及生物物、医学学的各领领域，如如基因组组研究、SSNP检检测、SSTR检检测、肿肿瘤研究究、药理理学研究究、药物物靶标研研究、药药物毒性性研究、病病原体研研究、医医学诊断断、病理理学组织织研究、微微生物与与发酵研研究等该芯片技术术获得了了中国发发明专利利和美国国专利，并并被Naaturre BBiottechhnollogyy 推荐荐。2.管盖盖基因芯芯片及其其检测系系统：管盖基因因芯片是

4、是将基因因探针固固定在特特制的管管盖内表表面，与与内置杂杂交贮液液池的EEppeendoorf管管一起构构建的基基因检测测器件。在在一个全全封闭的的管内，完完成基因因扩增，荧荧光标记记，芯片片杂交及及检等一一系列生生物化学学操作，实实现多基基因高通通量并行行检测。用用于管盖盖基因芯芯片的检检测分析析系统，它它包括光光学检测测平台、图图像采集集系统、图图像分析析系统及及结果报报告系统统。光学学检测平平台利用用尼康显显微镜光光学系统统，通过过电荷耦耦合器件件(CCCD)的的进行图图像采集集。管盖盖基因芯芯片杂交交后，经经过荧光光信号被被CCDD捕获，经通用串行总线（USB）传递给计算机。图像经过旋

5、转、去噪声点、图像分色、图2.左左图及中中图为管管盖芯片片实物，右右图为用用荧光显显微镜检检测的针针对多种种呼吸道道病毒检检测的杂杂交结果果。图3 管盖芯片检测仪杂交信号号判定、有有效性判判定及结结果输出出。我们们运用该该系统，对对于呼吸吸道十种病毒毒进行同同时检测测。实验验结果表表明，该该系统能能够准确确检测病病毒的杂杂交信号号并给出出检测结结果。基基于管盖盖型基因因芯片的的呼吸道道病毒检检测芯片片成功地地检测了了国家生生物制品品检定所所提供的的SARRS标准准品，并并在华大大基因中中心检测测了300多个SAARS样样本，取取得了满满意的结结果。该该成果已已通过了了江苏省省科技厅厅组织的的科

6、研成成果鉴定定。3.病毒毒及微生生物收集集器及一一体化检检测仪：病毒及微微生物收收集器是是能够对对空气中中的微量量化学物物质和病病原体（包包括病毒毒）进行行高效、快快速富集集和浓缩缩的新装装置。利利用病毒毒颗粒在在粘性表表面的黏黏附作用用和容易易洗脱的的特点，基基于鼻腔腔结构和和鼻黏膜膜机理的的气体吸吸附腔,通过抽抽气泵，将将空气中中的病毒毒颗粒吸吸入吸附附腔，粘粘附在黏黏膜表面面，然后后用蠕动动泵将洗洗脱液注注入腔内内，通过过超声震震荡器，将将黏膜和和病毒等等一起洗洗脱，储储于2mml的标标准冻存存管中。收收集管中中的洗脱脱液可收收集并集集中检测测。洗脱脱液中加加入了病病毒灭活活剂，保保证仪

7、器器的安全全使用。该该装置的的采气速速率为33升/分分。采气气时间为为1、110或330分钟钟。病毒毒收集在在小于00.5 ml的的溶液中中。通过过分散在在空气中中的灭活活甲肝病病毒和标标记蛋白白粉末试试验，病病毒颗粒粒的收集集效率在在90%以上。经经检索，在在国际上上尚没有有有效收收集和检检测病毒毒的装置置。基于于该成果果的国内内发明专专利已批批准，并并已申报报美国专专利。目目前，该该仪器把把收集和和毛细管管检测相相集成，开开发出可可以对各各种场所所里空气气中微小小物质进进行收集集、浓缩缩并可进进行有针针对性的的实时检检测。该该系统已已获20004年年国家重重点新产产品编号号20004EDD

8、10550099。病毒和和微生物物收集检检测器，可可用于空空气传播播的病原原学研究究、空气气消毒剂剂效果研研究、疫疫点空气气消毒效效果评价价、流行行期疫点点空气监监测和环环境中微微生物污污染的监监测，对对控制疾疾病的流流行具有有重要意意义. 适用于于大专院院校、研研究机构构、医院院、疾病病预防和和控制中中心及环环境监测测单位，以以及人口口密集的的地方空空气中病病原体以以及其它它生物物物质的检检测，防防止生物物恐怖等等领域，具具有较大大的应用用市场。4. 基基于抗体体微阵列列的细胞胞免疫芯芯片及其其一体化化检测仪仪：该技术通通过把细细胞表面面抗体制制备成微微阵列芯芯片，利利用细胞胞表面所所含有的

9、的抗原和和对应的的抗体之之间的特特异性反反应，捕捕获相关关的细胞胞，检测测细胞表表面的抗抗原组合合35。该该芯片可可以高通通量检测测组织、体体液中特特定细胞胞的表面面抗原谱谱的特点点。我们们研制的的细胞免免疫芯片片一体化化检测仪仪，由恒恒温孵育育部分、清清洗部分分和检测测部分组组成，可可以将样样本与芯芯片的孵孵育、清清洗、检检测、结结果输出出等自动动完成，提提高检测测结果的的准确率率。该检检测仪可可以用于于进行疾疾病的诊诊断、预预后效果果判断、环环境质量量的监测测等方面面。研制制了白血血病的免免疫分型型芯片，有有助于临临床分型型、判断断预后、指指导治疗疗。目前前免疫分分型是白白血病临临床治疗疗

10、及基础础医学研研究的一一个重要要手段。白白血病的的免疫分分型现在在仍以流流式细胞胞术（FFCM）方方法为主主，目前前一次最最多能检检测到66种抗原原。我们们研制的的细胞免免疫芯片片检测技技术，一一次可以以检测数数十种细细胞表面面抗原，而而且无需需标记。图6 细细胞芯片片检测仪仪5. 基基于凝胶胶基因芯芯片的SSNP检检测平台台：将丙稀酰酰胺修饰饰的核酸酸与丙稀稀酰胺单单体、过过硫酸胺胺等混合合后点样样于丙稀稀酰胺修修饰的玻玻片上，然然后置于于真空，在在引发剂剂汽化的的氛围下下促其发发生聚合合反应形形成凝胶胶并固定定于玻片片上。通通过该方方法，不不仅可以以固定合合成的、修修饰有丙丙稀酰胺胺的寡核

11、核苷酸及其其类似物物， 还还可以固固定修饰饰了丙稀稀酰胺的的PCRR产物。这这种在凝凝胶内三三维的固固定量比比平面的的固定量量成指数数级的提提高。杂杂交后，用用电泳替替代传统统的清洗洗方法,可以更更好地提提高信噪噪比和有有效地区区分完全全匹配的的序列和和错配的的序列。以以上方法法我们用于于疾病相相关的功功能SNNP的检检测上，由由于凝胶胶的固定定量大,可通过过多重PPCR一次固定定多个位位点的PPCR产产物。每每一位点点用一对对分别标标记Cyy3和Cy55的寡核核苷酸探探针与芯芯片杂交交，用电电泳方法法区分单单碱基错错配，通通过扫描描结果呈呈现的、黄黄、绿三三种颜色色很容易易将每一一位点的的S

12、NPP分型,使得SSNP的的检测更更加真实实可靠、简简便、低低廉。随随着人类类基因组组计划测测序任务务的完成成，SNNP的研研究成为为后基因因组计划划中重要要的组成成部分，特特别是与与人类的的生命代代谢、疾疾病相关关的SNNP，国国内外众众多的研研究所、医医学院，乃乃至大的的制药企企业都投投入大量量的财力力、人力力从事该该领域的的研究。我我们的SSNP检检测平台台由于可可靠、简简便、低低廉的优优势，在在众多的的SNPP检测方方法中更更具竞争争力。目目前已经经为江苏苏省人民民医院、南南京中大大医院、汕汕头大学学医学院院等多家家单位提提供服务务，均得得到满意意的结果果。6.硅烷烷化寡核核酸探针针:

13、DNA的的固定在在传感器器、DNNA固相相扩增（PPCR）、核核酸键合合、基因因芯片及及蛋白质质芯片等等生命科科学和医医学诊断断领域中中被广泛泛使用。因因此，合合成短片片段寡核核酸的修修饰具有有广泛的的市场。目目前核酸酸的修饰饰主要采采用进口口的亚磷磷酸酰胺胺试剂，按按照普通通DNAA合成的的方法固固相合成成。该试试剂我国国目前尚尚不能生生产，需需要进口口，且价价格昂贵贵；由于于亚磷酸酸酰胺试试剂的反反应活性性高，很很容易与与水等亲亲核试剂剂发生反反应而失失活，在在储存、运运输和使使用上十十分不便便，试剂剂浪费严严重。硅硅烷化寡寡核酸探探针是通通过硅烷烷化试剂剂合成的的修饰寡寡核酸，其其价格低

14、低廉。硅硅烷化试试剂是一一种种类类繁多、相相对活泼泼的化学学试剂。例例如氨基基硅烷、巯巯基硅烷烷、丙烯烯酰胺基基硅烷等等等，其其国产价价格大多多在500元/5500毫毫升左右右。硅烷烷化寡核核酸探针针具有传传统修饰饰寡核酸酸的性质质：产品品为无色色粉末，极极易溶于于水；在在200下能稳稳定一年年；产品品在碳酸酸盐等缓缓冲溶液液等中溶溶解点样样于醛基基等修饰饰的玻璃璃载片上上能得到到有效的的固定；固定的的核酸与与能够有有效的与与互补序序列杂交交。该技技术已获获20005年国国家新产产品编号号20005EDD10550199，核酸探探针已广广泛DNNA芯片片制备，固固相PCCR以及及各种检检测核酸

15、酸，蛋白白质分子子的及传传感器的的制备。随随着基因因芯片技技术的不不断成熟熟及其应应用领域域的不断断拓广，核核酸探针针的市场场需求量量将进一一步增加加。市场场将涉及及对疾病病，病原原体以及及其它生生物物质质的诊断断与检测测及分子子生物学学相关的的大专院院校、研研究机构构、医院院、疾病病预防和和控制中中心及环环境监测测等单位位，具有有较大的的市场。7.基因因甲基化化定量检检测技术术：本成果采采用Q-MSPP结合MMSP及及实定量量PCRR技术，同时具有有MSPP的特异异性和灵灵敏性以以及实时时PCRR的快速速和抗污污染等特特性，可可对微量量DNAA的甲基基化进行行精确定定量分析析。我们们利用该该

16、技术对对30例例骨肉瘤瘤组织及及相应的的正常组组织的55个基因因进行定定量甲基基化分析析。结果说说明，异异常甲基基化水平平与肿瘤瘤的病理理分期密密切相关关，它可可以作为为一个有有用的分分子标记记来协助助判断肿肿瘤的发发生程度度及预后后效果。本本研究的的结果撰撰写的文文章已被被美国癌癌症协会会主办的的权威杂杂志CCANCCER接接收。8.PCCR共聚聚焦生物物芯片扫扫描仪：本成果是是将基因因实时定定量扩增增技术与与基因芯芯片技术术进行有有机融合合，将探探针固定定在芯片片上，通通过基因因扩增的的同时水水解探针针原理来来实时监监测，实实现基于于基因芯芯片的基基因定量量检测。该该仪器设设计了高高精度的

17、的温度循循环控制制系统和和基因芯芯片的荧荧光多次次扫描技技术为一一体，通通过软件件的控制制，实现现对基因因芯片的的在片扩扩增过程程进行实实时图7 PPCR共共聚焦生生物芯片片扫描仪仪的监测，计计算出荧荧光的增增减变化化的标准准曲线。通通过待测测基因与与标准参参照体系系的对比比，从标标准曲线线上查找找实测样样品对应应的检测测探针的的荧光强强度变化化过程确确定待测测样品的的相对基基因含量量。该成成果的多多基因同同时定量量检测能能够在医医学、食食品及生生物安全全等方面面具有广广泛的应应用前景景。9.中药药材（石石斛）鉴鉴定特异异性gDDNA探探针的筛筛选与应应用本成果以以名贵中中药材石石斛为实实验材

18、料料，探索索了在全全基因组组内筛选选种特异异性探针针，并建建立了多多种特异异性探针针进行中中药鉴定定的gDDNA芯芯片新方方法，对对石斛样样本进行行了准确确鉴定。本本研究成成果是将将抑制性性差减杂杂交与基基于尼龙龙膜微阵阵列杂交交相结合合筛选种种特异探探针。即即先用抑抑制性差差减杂交交获得两两个品种种之间的的gDNNA差异异片段，然然后用这这些gDDNA差差异片段段与由所所有研究究品种的的gDNNA制备备成的微微阵列杂杂交筛选选到某一一个品种种的特异异性gDDNA片片段。研研究证明明了建立立的种特特异性ggDNAA探针的的筛选方方法是可可行和高高效的。该该研究成成果发表表在核核酸研究究和生生物

19、化学学和生物物物理学学方法杂杂志上上。用从从5种石石斛中筛筛选到的的14个个种质特特异性探探针点样样制备成成微阵列列成功地地对5种种常见的的石斛品品种其中中包括中中国药典典收录录的3种种石斛进进行了鉴鉴定。建建立了DDNA微微阵列鉴鉴别不同同的商品品石斛样样本、混混合材料料中的靶靶样本及及真伪，对对中药鉴鉴定具有有重要应应用价值值。10.用用于DNNA结合合蛋白表表达量检检测的双双链DNNA芯片片用来检测测NF-B对于不不同突变变序列的的结合亲亲和能力力的专用用生物芯芯片,是是根据基基因组中中不同基基因启动动子区的的NF-B p550 DDNA结结合序列列，设计计和制备备了包含含由311种单突突变的dds-DDNA探探针。该该芯片构构建了包包含有330种 NF-B 结合合序列的的ds-DNAA芯片，成成功地对对蛋白和和DNAA的结合合特性进进行了检检测，在在药物筛筛选等方方面具有有较好的的应用前前景。