第十二章体外试验与生物新技术bqxy.docx

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1、第十二章章体外试试验与生生物新技技术 在毒毒理学中中的应用用第一节 体外外试验 毒性试试验的目目的在于于获取一一定的数数据，为为社会需需要的外外源化学学物的安安全使用用做出判判断。过过去利用用整体实实验动物物模型或或称体内内试验(in vivvo ttestt)模型型所提供供的资料料，判断断外源化化学物及及其制品品和混合合物等对对人类健健康是否否具有损损害作用用。体外外试验模模型(iin vvitrro ttestt)在上上述过程程中也起起着重要要的作用用，尤其其是机理理研究方方面。但但是，在在毒理学学研究中中整体试试验研究究的观点点仍占主主导地位位。目前前，此种种观点已已发生变变化，因因为：

2、全世界界每年约约有千种种以上的的新化合合物作为为商品进进入人类类的环境境。而且且在现有有的化合合物中，还还有相当当数量没没有进行行必要的的毒理学学评价。在在此种情情况下，利利用经典典的整体体动物试试验取得得完整的的毒理学学资料极极为困难难。解决决此种问问题的重重要方向向是体外外试验。现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。所以体外试验在毒理

3、学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。 一一、概述述 (一) 分类类 毒性试试验的目目的是提提供一些些适当的的资料，以以便确定定有关化化学物的的毒理学学性质。在在有些情情况下，是是要决定定一种化化学物在在所预期期的条件件下使用用是否安安全，如如新药物物开发即即需要这这一评价价。在有有些情况况下，例例如新工工业品或或日用化化学品的的开发，必必须决定定一种新新化学物物的接触触安全限限量。了了解体外外毒性试试验在上上述毒理理学决策策过程中中有何意意义，对对于评价价体外

4、毒毒性试验验在毒理理学中的的地位极极有帮助助。可依依据体外外试验在在决策过过程中所所起的作作用将其其分为33类：筛选试试验。它它仅提供供决策过过程的最最初的资资料，还还需要进进行更权权威的试试验，无无论是整整体还是是体外试试验。附加试试验。它它可为协协作部门门或法律律部门的的最终决决策过程程提供有有用的资资料，如如机理的的研究，但但仅有它它是不够够充分的的。替代试试验。它它是在大大量实验验的基础础上，使使体外毒毒性试验验能替代代整体动动物试验验，以提提供更多多的信息息。 (二) 基本本原理 体外试试验的基基本原理理是所观观察到的的毒理学学效应均均是毒物物和或或反应活活性代谢谢产物在在敏感性性细

5、胞上上或敏感感细胞内内某一分分子靶部部位作用用的结果果。如将将敏感细细胞或某某分子靶靶部位例例如酶，在在体外条条件下，维维持其正正常的生生理功能能，并观观察外源源化学物物对其的的影响，即即将毒理理学中毒毒物中毒毒的启动动阶段，在在体外条条件下，观观察其对对外源化化合物的的反应和和外源化化学物对对它的作作用。基基于上述述原理，体体外试验验模型取取材范围围很宽，可可取哺乳乳动物的的离体脏脏器灌流流、脏器器切片温温育、细细胞培养养、亚细细胞器组组份以及及提纯的的某些酶酶分子或或DNAA分子等等等。 (三) 体外外试验的的优缺点点 体体外毒性性试验的的优点可可归纳在在表1221。表12-1 体外毒毒性

6、试验验系统的的优点能控制环环境因素素可排除相相互作用用的系统统如免疫疫系统、神神经内分分泌系统统的影响响每一剂量量水平可可利用大大量的生生物样品品，如细细胞，细细胞器等等试验间的的误差较较少可同时和和或反反复多次次取样可做成复复杂的互互相作用用的试验验系统，如如复合细细胞培养养等较为快速速和经济济需要较小小量的受受试化合合物产生较小小量的有有毒废物物可以利用用人体细细胞减少整体体动物的的使用 其中特特别值得得一提的的优点是是体外试试验的简简便和易易于利用用人体细细胞。体体外毒性性试验结结果可迅迅速得出出，将减减少了解解新化学学物毒理理学资料料所需的的时间，最最终可以以缩短从从新化学学物的合合成

7、到产产品进人人市场的的时间过过程。此此外，对对鉴定毒毒理学资资料有问问题的新新化学物物，可及及时终止止开发，减减少由资资源到产产品的投投入。在在毒理学学整体试试验中禁禁止直接接进行人人体试验验。但毒毒理学试试验的目目的是关关心人类类健康，目目前主要要是将动动物试验验结果外外推至人人类，物物种间差差异为其其不确定定因素之之一。在在体外试试验中，利利用人体体细胞组组织进行行试验，可可较好地地解决物物种差异异的问题题。 体外毒毒性试验验系统的的利用在在目前尚尚有不足足之处：体外到到体内外外推的问问题。体体外试验验是依据据毒性作作用的始始发阶段段及继续续发生的的分子与与细胞反反应，其其与整体体系统有有

8、差异，如如何将产产生体外外毒性的的体外浓浓度与相相应体内内剂量联联系的问问题是最最终未解解决的难难题。它它需要更更好的工工具预测性性毒物代代谢动力力学来解解决，其其关键在在于发展展有生理理学基础础的毒物物代谢动动力学模模型。另另一方面面，体外外毒性试试验中缺缺乏毒理理学反应应的调控控因素，如如细胞与与组织的的修复过过程和免免疫系统统的不同同类型细细胞间的的相互影影响等。假假如有了了更全面面的毒理理学过程程的基础础知识，可可设计更更符合整整体动物物模型的的体外系系统。但但现阶段段毒理学学作为一一个学科科的发展展尚缺少少许多重重要的资资料。体外毒毒性试验验难以预预测慢性性毒性。因因为，慢慢性毒性性

9、病理过过程的机机理所知知甚少，缺缺乏发展展体外试试验的理理论依据据，再者者，某些些体外系系统仍难难以达到到长期维维持生理理状态的的要求。 二、体体外试验验系统 (一) 脏器器灌流 1. 肝脏灌灌流 是毒理理学中研研究外源源化合物物对肝脏脏损伤及及代谢的的常见方方法。在在灌流液液中加入入外源化化学物，此此外要维维持灌流流液的ppH值、氧氧含量，还还要控制制适宜的的灌流液液流速。一一般是以以下腔静静脉和门门静脉为为插管灌灌流通路路，为此此应结扎扎肝动脉脉、上腔腔静脉，在在恒温条条件下灌灌流。有有报道用用肝灌流流方法研研究四氯氯化碳及及其氢取取代衍生生物三氯氯甲烷与与二氯甲甲烷对肝肝脏毒性性，结果果

10、发现随随着灌流流时间延延长(在在4h之之内)，灌灌流液的的上清液液中K+、谷丙丙转氨酶酶(SCCPT)、山梨梨醇脱氢氢酶(SSDH)、谷氨氨酸脱氢氢酶(GGDH)增加，说说明三种种化合物物对肝细细胞均有有损伤，而而以四氯氯化碳为为最，且且依氯原原子被氢氢取代肝肝毒减低低。需指指出肝灌灌流时间间不能过过久，以以4h之之内为宜宜，否则则肝细胞胞的功能能与生存存不能维维持。 2. 肠灌流流 利利用某一一部分小小肠体外外灌流可可以研究究一些化化合物的的吸收及及动力学学过程。如如用大鼠鼠，则在在麻醉下下切腹分分离一段段小肠，在在保持原原有血液液循环体体系下，将将肠两端端插管，清清洗净肠肠中内容容物，在在

11、恒温环环境中灌灌入灌流流液。例例如有人人研究锌锌的吸收收及其影影响因素素，以大大鼠回肠肠段为标标本，证证实锌吸吸收呈二二室模型型(肠腔腔为室、肠肠粘膜为为室)，苯苯丙氨酸酸能增加加肠腔与与肠粘膜膜之间锌锌的交换换，且加加速向血血流的清清除过程程。 3. 膈肌-膈神经经标本 取完完整的大大鼠膈肌肌-膈神神经置于于恒温灌灌流液中中，在在几小时时之内可可维持基基本正常常的神经经肌肉传传导。这这种标本本可用在在研究神神经毒物物对神经经传导功功能的损损伤及强强度。 (二) 脏器器切片 肝脏、肾肾脏、脑脑部及心心均可以以制备切切片。例例如，脑脑片和心心肌条等等是将组组织片置置于恒温温的孵育育液中进进行有关

12、关试验研研究，但但需注意意切片中中的细胞胞需保持持完好的的细胞基基质和细细胞之间间的交流流。切片片厚度一一般在2250m。不不同研究究期间有有别，如如肝切片片研究CCytPP-4550不应应超过88h，脑脑切片一一般在66h左右右。此系系统的优优点是保保持了细细胞之间间的结构构，其操操作也比比脏器灌灌流容易易。不足足之处是是切片内内的细胞胞易于缺缺氧，且且受试物物也不易易均匀到到达细胞胞内。 (三) 原代代细胞培培养 1. 肝肝细胞原原代培养养 肝肝细胞尚尚未建成成传代的的细胞株株系，多多用原代代培养。肝肝细胞原原代培养养期间细细胞不分分裂、不不增殖，但但发现基基因转录录是存在在的(培培养初期

13、期24hh在1或以上上)。细细胞原代代培养维维持生存存期12周，但但是CyytP-4500却在224228h活活性减少少50左右。据据报道人人肝细胞胞中CyytP-4500活性稳稳定性比比大鼠强强。 利用原原代培养养的肝细细胞可以以进行多多种毒理理学研究究。如研研究化学学物的肝肝脏毒性性，一般般认为，用用原代肝肝细胞培培养筛检检与鉴定定是否化化学物具具有肝脏脏毒性较较为可靠靠，与体体内试验验相符合合。有报报道以肝肝细胞损损伤后某某些酶释释放为指指征，研研究300个化学学物，结结果除少少数化学学物在肝肝细胞培培养中表表现毒性性比体内内试验低低之外，多多数化学学物内外外毒性符符合一致致。在体体外试

14、验验表现毒毒性较低低的化学学物有环环已酰胺胺(cyycloohexximiiolee)、溴溴苯(bbrommobeenzeene)和长春春新碱(vinncriistiine)等。 2. 巨噬细细胞 豚鼠或或大鼠都都可以肺肺灌洗方方法获取取肺巨噬噬细胞，小小鼠可用用腹腔灌灌洗获得得腹腔巨巨噬细胞胞，甚至至人也可可通过肺肺灌洗得得到。巨巨噬细胞胞可以用用于多种种体外试试验，例例如利用用巨噬细细胞的免免疫功能能检测外外源化学学物的免免疫毒性性，又如如利用巨巨噬细胞胞检测以以肺脏为为毒理学学终点的的外源化化学物的的中毒毒毒性和机机理。关关于后者者，有人人利用豚豚鼠肺巨巨噬细胞胞原代培培养纯化化后，研研

15、究二氧氧化硅(sillicaa，SiiO2)致矽矽肺的机机理。 3. 淋巴细细胞 多用小小动脉脾脾脏分离离淋巴细细胞或进进一步分分离T、BB淋巴细细胞进行行免疫毒毒理研究究。例如如研究镉镉的免疫疫毒性，证证明镉可可以抑制制淋巴细细胞转化化和抑制制白细胞胞介素-2的产产生，且且在一定定条件下下使淋巴巴细胞内内游离钙钙浓度增增加及钙钙调素(CaMM)活性性降低，此此为镉的的免疫毒毒性机理理研究提提供了线线索。 4. 脑细胞胞 分分离的新新鲜脑细细胞有助助于研究究外源化化学物对对神经系系统损伤伤的评价价与探讨讨其机理理如用小小鼠大脑脑皮质分分离、温温育后，研研究二价价阳离子子钙、镁镁、锌、镉镉等对皮

16、皮层神经经细胞的的损伤，发发现这些些离子随随着浓度度的增加加，脑神神经细胞胞的电泳泳迁移率率逐渐减减慢。 随着脑脑细胞技技术的发发展，还还可在温温育体系系中存在在外源化化学物情情况下，用用微电极极插入脑脑细胞，通通过电信信号的变变化，更更深入地地研究外外源化学学物对神神经细胞胞的功能能损伤。 5. 心肌细细胞 心肌细细胞用于于毒理学学研究的的报道目目前还较较少。用用新生112日日龄大鼠鼠心室肌肌分离心心肌细胞胞，原代代培养44天后，将将微电极极(直径径0.5umm)插入入细胞内内，研究究镉对心心肌的影影响。经经记录、分分析各心心肌细胞胞动作电电位参数数，结果果镉在55200mollL浓浓度下，

17、可可使心肌肌细胞动动作电位位及最大大除极速速率显著著降低，表表明镉对对心肌有有直接的的毒性效效应。 此外，将将分离的的心肌细细胞于培培养的224448h期期间，利利用膜片片钳的连连细胞电电压钳法法，描记记心肌细细胞上的的B型、LL型及TT型3种种Ca22通道道的单通通道活动动。当在在培养液液中加入入10mollL氯氯化镉之之后，BB型通道道开放时时间缩短短133、关闭闭时间延延长455.1、通道道开放概概率下降降55，L型型通道开开放时间间缩短440.77、关关闭时间间延长223.11、通通道开放放概率下下降500，而而对T型型通道无无影响。进进一步证证实镉对对心肌有有毒性效效应。 (四) 细

18、胞胞培养 有些脏脏器细胞胞建立了了传代培培养技术术，建成成有稳定定遗传特特征的细细胞株系系。有的的利用细细胞培养养技术建建立了特特殊的试试验方法法。 1. 肾细胞胞 由由于肾小小管，尤尤其是肾肾近曲管管是肾脏脏重要的的功能单单位，目目前已经经建立了了几种肾肾近曲管管细胞株株系用于于毒理学学研究。例例如19926年年Hulll等人人选育传传代培养养的LLLC-PPK1细细胞是来来源于HHamppshiire猪猪。据报报道此株株系细胞胞的各种种生物学学特征已已进行了了相当深深入的研研究(包包括激素素应答反反应、物物质转运运特征、细细胞的代代谢功能能和标志志等)。此此后又建建立了从从鼬(ooposs

19、summ)获得得的OKK株系、从从兔获得得的RCC-SVVI株系系。 近年国国内利用用3000次传代代培养的的LLCCPKll细胞系系对铅的的肾毒进进行了研研究，包包括铅对对细胞的的损伤、对对细胞膜膜脂流动动性的影影响、对对细胞膜膜相变温温度的影影响、脂脂质过氧氧化效应应、胞内内钙浓度度变化及及形态学学改变等等，这对对铅的肾肾脏毒性性机理提提供了依依据。 2. 胚胎细细胞 利用胚胚胎细胞胞体外培培养，筛筛检和研研究外源源化学物物的毒性性效应。例例如我国国用人胚胚肺纤维维母细胞胞传代培培养人胚胚肺二倍倍体细胞胞，已建建立了以以2BSS为代表表的株系系。此株株系在用用于筛检检致癌物物方面做做了一些

20、些工作。如如人胚肺肺二倍体体细胞在在10-7110-88mollL苯苯并(aa)芘长长达288388代传代代培养下下，电镜镜镜检发发现细胞胞核外形形不规则则、核膜膜深陷、出出现细桥桥(tiiny briidgee)伴分分叶核形形成、核核内胞浆浆包涵体体、核仁仁巨大或或多核等等细胞癌癌变特征征。 此外，人人胚主动动脉平滑滑肌细胞胞也可作作为标本本传代培培养研究究金属的的毒理。 近十年年来，毒毒理学相相继引入入啮齿类类动物的的着床前前全胚胎胎培养技技术(ppre-impplanntattatiion whoole embbryoo cuultuure)、着床床后全胚胚胎培养养技术(posst-ii

21、mpllanttatiion whoole embbryoo cuultuure)，以及及器官培培养如腭腭板培养养、胚胎胎枝芽体体外培养养等筛检检致畸化化学物均均取得一一些成果果。 (五) 组织织匀浆 取脏器器除血污污制备组组织匀浆浆，是用用物理学学方法使使细胞壁壁破坏，细细胞组成成成分与与细胞间间质混合合形成混混悬液。利利用匀浆浆为标本本主要是是研究外外源化学学物对细细胞酶系系统的毒毒理作用用。最常常使用的的是脑匀匀浆、肝肝匀浆，虽虽然肺、肾肾、肠等等脏器也也可制备备匀浆，但但是因纤纤维结缔缔组织或或肌细胞胞不易破破碎影响响匀浆的的质量。 文献中中有机磷磷化合物物对神经经系统AAchee抑制

22、的的强度及及特征，大大量工作作是通过过以脑匀匀浆为标标本，主主要是以以哺乳动动物、啮啮齿类和和昆虫的的脑完成成的。不不少外源源化学物物的代谢谢和以肝肝脏为靶靶器官的的外源化化学物的的毒性效效应特征征与机理理是通过过肝匀浆浆进行的的。现虽虽然不少少工作已已为其它它技术所所取代，但但是应用用匀浆作作为过筛筛与初步步研究还还是有用用的，主主要因其其制备方方法简单单、制备备周期很很短，且且不需复复杂的设设备。 (六) 亚细细胞组分分 将细胞胞中各亚亚细胞组组分分离离和纯化化，对于于深入研研究外源源化学物物的靶位位点、探探讨化学学物毒性性效应的的机理均均十分重重要。它它较组织织匀浆优优越，排排除了匀匀浆

23、中其其它因素素的影响响。现代代毒理学学中使用用最多的的亚细胞胞组分是是细胞膜膜、微粒粒体及线线粒体。 1. 细胞膜膜 人人与动物物红细胞胞分离后后低渗溶溶血，高高速低温温离心可可制得红红细胞膜膜(或称称血影，gghosst)。血血影为常常用的细细胞膜标标本。此此外肺巨巨噬细胞胞、肺细细胞、突突触小体体等均可可制备膜膜标本(先将细细胞匀浆浆破膜，低低温差速速离心、梯梯度离心心制备)。使用用细胞膜膜可以进进行很多多的毒理理试验，尤尤其是在在探讨化化学物中中毒机理理方面。 以红细细胞膜为为例，用用人工细细胞为标标本与00.1mmmollL铅铅作用仅仅5miin，红红细胞膜膜远紫外外色谱就就出现改改变

24、，表表明膜蛋蛋白的构构象发生生了变化化。 神经末末梢断裂裂脱落的的突触体体(syynapptossomee)具有有类似完完整细胞胞的功能能，除可可利用突突触体作作为标本本外，还还可进一一步制备备突触体体膜(ssynaaptoosomme mmembbranne)。实实验表明明对硫磷磷在510-99mollL水水平即可可抑制突突触体的的摄钙功功能，并并引起突突触体膜膜脂流动动性下降降。 近年来来为纯化化实验条条件，以以利于从从分子水水平研究究外源化化学物的的毒效应应机理，已已将人工工膜引入入毒理学学研究。所所谓人工工膜，即即是以正正常细胞胞膜的膜膜脂组分分，人工工合成后后用之在在定介质质中形成成

25、人工膜膜。 2. 微粒体体(miicroosomme) 尤其其是肝细细胞制备备的微粒粒体常作作为毒理理学研究究的标本本，这是是由于肝肝脏代谢谢酶系主主要存在在于肝细细胞内质质网，即即肝细胞胞的亚细细胞组分分分离后后的微粒粒体中。 有报道道TNTT在无氧氧而加人人NADDPH环环境下与与微粒体体温育，用用ESRR波谱仪仪检测出出硝基阴阴离子自自由基(Ar-NO22)；而而在有氧氧环境中中能迅速速与分子子氧反应应生成硝硝基化合合物与超超氧阴离离子(OO2 )。 3. 线粒体体(miitocchonndriia) 它是是细胞中中进行呼呼吸作用用的主要要场所。据据报道溴溴氰菊酯酯(deecammeth

26、hin)在体外外试验中中，对线线粒体呼呼吸功能能有明显显抑制作作用。又又据报道道镉对大大鼠肝细细胞线粒粒体Caa2+-AATPaase有有抑制作作用，且且使线粒粒体膜脂脂流动性性下降。 (七) 酶 外源化学学物对机机体的毒毒性效应应，往往往表现某某种或某某些酶的的活性变变化上，即即可以利利用标志志酶活性性的变化化反映化化学物所所损伤的的靶器官官。 在体外外毒理学学中则主主要是定定量研究究外源化化学物对对靶酶作作用的特特征、性性质和机机理。此此类研究究的基础础工作是是纯化酶酶，如获获得纯化化酶，可可在体外外精确地地控制各各种因素素，对纯纯化酶作作用的体体征、性性质和机机理进行行研究，如如细胞色色

27、素P-4500重组系系统。由由于酶的的提纯技技术复杂杂，故而而在一般般毒理学学研究中中多用脏脏器匀浆浆和亚细细胞组分分作为酶酶源。虽虽然这些些酶源标标本含有有多酶成成分，但但是只要要测定酶酶活性的的条件适适宜，完完全可以以得到良良好的结结果。 有报道道金属离离子Cdd2+、HHg2+、Pbb2+对一一些钙调调素依赖赖酶就具具有双向向效应，即即在低浓浓度时可可以激活活这些酶酶，而高高浓度时时又可抑抑制酶的的活性。 文献中早早已证明明有机磷磷化合物物的主要要靶酶是是AChhE。经经酶动力力学分析析，有机机磷化合合物与AAChEE底物AACh呈呈竞争性性；即有有机磷化化合物对对AChhE为竞竞争性的

28、的不可逆逆性抑制制物。但但是不同同结构的的有机磷磷化合物物对ACChE的的亲合力力可有很很大差别别。第二节 哺乳乳动物细细胞制备备和培养养一、概述述 到目前前为止，分分离的细细胞是毒毒理学中中使用最最广泛和和最深入入的体外外实验系系统。体体外系统统分离的的细胞包包括悬浮浮液中的的新鲜游游离细胞胞、原代代培养细细胞、细细胞株、细细胞系及及复合培培养的细细胞。在在毒理学学中以哺哺乳动物物细胞作作为实验验动物的的替代系系统日渐渐广泛，造造成这种种趋势的的原因有有三：一一是来自自公众要要求减少少实验中中使用动动物数量量的压力力；二是是非整体体动物实实验可显显著地减减少常规规整体动动物实验验所需的的高额

29、费费用；三三是人们们越来越越不满意意实验动动物与人人体结果果之间相相关性的的缺乏。利利用细胞胞，可更更严格控控制实验验条件，有有效地研研究毒性性作用的的生化机机理。表表12-2详细细列出细细胞在毒毒理学中中应用的的优缺点点。 表12-2 体外系系统细胞在在毒理学学中应用用的优、缺缺点 优点 改改善效率率，减少少费用 使使用实验验动物较较少 仅仅需少量量的受试试物 较较大程度度控制细细胞族的的性状 直直接控制制胞外基基质、化化学物浓浓度及接接触时间间 排排除可能能的混淆淆因素如如激素；神经系系统或免免疫系统统的影响响 可可从同一一实验体体系重复复取样 缺缺点 缺少整整个器官官的形态态学观察察 选

30、选择性丧丧失整体体器官特特异性功功能，如如毒性代代谢酶的的丧失 缺缺乏可能能的调节节影响因因素如激激素，神神经系统统或免疫疫系统， 一一般为静静态系统统，将导导致营养养物质的的逐渐减减少和代代谢终产产物的逐逐渐累积积。 多多为短期期试验，对对亚慢性性或慢性性毒性的的评估价价值不大大表12-3 毒理学学研究中中常用细细胞各种物种种的成纤纤维细胞胞淋巴母细细胞腹水瘤细细胞淋巴细胞胞角质细胞胞肝 细 胞肝癌细胞胞肾脏髓质质和皮质质细胞肺的各种种类型细细胞培养的背背根胶质质细胞培养的睾睾丸细胞胞膀胱细胞胞心脏细胞胞脊髓微血血管细胞胞脂肪细胞胞 由于哺哺乳细胞胞作为体体外实验验系统的的优越性性，在毒毒理

31、学中中，已有有许多不不同类型型细胞应应用于毒毒理学实实验。表表12-3为毒毒理学实实验中常常用的细细胞类型型，其中中有些细细胞可来来源于人人体组织织。利用哺乳乳动物细细胞进行行毒理学学体外实实验有两两种方法法：一是是建立正正在迅速速生长的的细胞株株，用以以观察受受试物对对整体细细胞的一一般毒作作用和正正在分裂裂组织的的毒作用用；二是是利用已已高度分分化的细细胞，无无论是原原代培养养或是特特定的细细胞株，研研究受试试物对已已分化成成熟的细细胞或其其功能的的特殊毒毒作用； 二、基本本技术（一） 仪器与设设备 1. 培培养箱 一般般来说，在在5CCO2，955空气气和999的相相对湿度度的条件件下，

32、许许多细胞胞可存活活。故细细胞培养养的关键键设备是是CO22培养箱箱。其基基本要求求：精确地地温度控控制调节节，一般般在土00.5，箱内内温度的的均衡可可依赖风风扇；CO2浓度调调节，利利用COO2传感器器监测箱箱内COO2浓度；使箱内内大气为为5CCO2，955空气气；箱内湿湿度，可可用水盘盘来维持持。有的的细胞培培养可以以不控制制CO22分压。例例如，原原代肝细细胞培养养，可用用LeiibovvitzzL-55介质，不不需COO2，而要要求敞开开培养瓶瓶，以供供给较高高的O22分压。 2. 冰箱和和冷柜 冰箱箱(4)用于于存放培培养介质质，冷柜柜(20)则存存放酶，(如胰蛋蛋白酶)和某些些

33、培养介介质如谷谷氨酸和和血清。 3. 显微镜镜 最最基本的的配置是是一台简简单的倒倒置显微微镜，用用作日常常观察培培养中的的细胞，以以便依据据细胞生生长状况况，进行行调整或或对污染染进行补补救或处处理。进进行进一一步的研研究，则则需要更更高级的的显微镜镜，例如如，相差差显微镜镜或荧光光显微镜镜，并附附有照相相装置或或摄影装装置。 4. 超净工工作台 在没没有无菌菌操作室室的条件件下；可可用超净净工作台台。它是是一无菌菌操作装装置，主主要是利利用鼓风风机，驱驱动空气气通过高高效滤膜膜净化后后，缓缓缓通过工工作台面面，使工工作部位位构成无无菌环境境。它具具有占地地面积小小，操作作方便等等优点，但但

34、它尚难难绝对除除去病毒毒类微生生物，而而且灰尘尘过多对对净化作作用不利利，故超超净工作作台最好好安置在在清洁无无尘的房房间。 5. 清洗和和消毒设设置：培培养中所所用玻璃璃器皿可可用电热热干燥箱箱消毒，要要求温度度1600以上，最最好使用用较大规规格的干干燥箱，如如650050005000mm。 器皿的的清洗可可用超声声波洗涤涤器。吸吸管的清清洗采用用虹吸原原理制成成的冲洗洗装置。金金属器械械如解剖剖刀、虹虹膜剪、镊镊子、尖尖镊、止止血钳等等可用高高压蒸汽汽消毒。 6. 培养器器皿 为了清清洗的方方便，塑塑料瓶皿皿正逐步步取代玻玻璃瓶皿皿。特制制的塑料料瓶皿具具有透明明、平滑滑、无毒毒性、有有

35、利于细细胞生长长的优点点。主要要的塑料料瓶皿有有；多孔培培养板，其其规格有有4孔、66孔、224孔及及96孔孔，它体体积小，适适于少量量细胞或或单个细细胞克隆隆的生长长；培养皿皿，规格格有直径径30mmm、60mmm及ll00mmm，与与玻璃培培养皿相相同，尤尤其有利利于集落落形成和和细胞转转化等试试验；培养瓶瓶，带有有螺旋盖盖塞，规规格有330mll、500ml、ll00mml及5500mml，适适于在CCO2培养箱箱中使用用；其它：冻存细细胞的塑塑料安瓿瓿及微量量加样器器头，后后者的规规格有2200100001和11l1100l二种种。 玻璃器器皿在实实验室仍仍不能完完全被塑塑料制品品取代

36、，除除培养皿皿和培养养瓶外，主主要还有有：吸管，它它包括刻刻度吸管管和移液液管，常常用规格格有l00ml，55ml和和lmll；玻璃瓶瓶，用于于配制各各种培养养液的储储贮存液液和血清清等，可可用生理理盐水瓶瓶或血浆浆瓶代替替，规格格有5000mll、2550mll和l000mll；离心管管，规格格有500ml、ll0mll和5mml，用用于细胞胞洗涤。 7. 液氮贮贮存器 贮存存细胞多多用液氮氮，液氮氮温度在在-1996，具有有经济、省省力和能能较好保保持细胞胞生物学学特性的的优点。液液氮贮存存器有225L和和50LL两种规规格，它它与液氮氮运输瓶瓶，或称称杜瓦瓶瓶不同，因因液氮贮贮存器一一般

37、每两两周需补补充一次次液氮。如如有需要要可配置置贮存器器和运输输瓶。 8. 水纯化化装置 细胞胞培养对对水的要要求较高高，通常常要求使使用三次次蒸馏水水配制各各种培养养液。对对玻璃器器皿也应应用纯水水清洗。但但是，在在细胞培培养中，不不宜使用用去离子子纯水，因因其不能能有效地地去除有有机物。 实验室室应配备备自动加加水石英英玻璃管管加热的的蒸馏器器，具有有蒸馏速速度快，使使用安全全等优点点。外购购蒸馏水水或去离离子，应应在本实实验室重重蒸后使使用。对对水质量量应经常常检测，如如pH和和电导系系数。同同一实验验尽量使使用同一一水源，避避免水质质量造成成结果的的差异。 9. 滤过消消毒装置置 培培

38、养介质质不能经经高压蒸蒸汽消毒毒，而需需通过孔孔径为00.222l的滤滤膜过滤滤消毒。滤滤过消毒毒装置由由抽气泵泵(水流流玻璃抽抽气泵或或真空泵泵)、安安全瓶、抽抽滤瓶和和滤器组组成。10. 一般设设备 离心机，用用于对细细胞悬液液离心处处理，以以达到细细胞洗涤涤、调节节细胞浓浓度等。 天平，包包括普通通台秤、扭扭力天平平和分析析天平，用用于配制制各种培培养液、酶酶消化液液及生理理盐水等等。 酸度计计，用于于准确调调整各种种介质及及生理盐盐水的ppH。 电磁搅搅拌器，微微量加样样器等。 (二) 培养养用液 指细胞胞培养中中所使用用的溶液液，如培培养液、消消化液、ppH调整整液、染染液及细细胞洗

39、涤涤液等。培培养液的的选择取取决于细细胞生长长的要求求，故它它是维持持细胞生生存和生生长所需需的基本本溶液，它它的主要要成分为为平衡盐盐溶液和和适应细细胞体外外培养的的各种溶溶液。 培养液液在制备备过程中中应严格格操作，避避免混入入杂质。应应特别注注意下列列问题：容器，应应仔细认认真清洗洗，必要要时须消消毒；水，三三次重蒸蒸蒸馏水水；严格选选择品质质优良的的药品；制备好好的培养养介质要要标明名名称、配配制日期期及配制制者；贮存与与消毒。 1. 平衡盐盐溶液 常用用的有HHankks液、EEaglle液及及磷酸盐盐缓冲液液 (PPBS)等。它它具有维维持渗透透压、控控制酸碱碱度平衡衡的作用用及供

40、给给细胞生生存所需需的能量量和无机机盐的成成分。它它是配制制各种培培养介质质的基础础溶液，也也是洗涤涤细胞的的溶液。 2. 小牛血血清 是细胞胞培养中中最常见见的天然然培养基基，它具具有丰富富的营养养物质，对对细胞附附着和保保护也有有明显的的作用。但但它有成成分较为为复杂、个个体差异异较大、来来源也有有一定的的限制等等不足。弥弥补个体体差异的的办法是是对血清清进行无无菌检测测和支持持生长能能力测定定后，混混合使用用。天然然培养基基除小牛牛血清外外，还有有鸡血浆浆、鸡胚胚浸出液液、水解解乳蛋白白和鼠尾尾胶原等等。 3. 合成培培养基 系依依据天然然培养基基的成分分，用化化学物质质模拟合合成的。如

41、如最简单单的MEEMEaglle培养养液，包包括122种必需需氨基酸酸、谷氨氨酸胺和和8种维维生素。根根据需要要可添加加某些成成分，如如碳水化化合物(葡萄糖糖、核糖糖、脱氧氧核糖及及丙酮酸酸钠等)、核酸酸的前体体物(嘌嘌呤和嘧嘧啶类化化合物)及氧化化还原剂剂，抗坏坏血酸、谷谷胱甘肽肽等。 如进行行无血清清培养，除除上述营营养成分分外，还还应加入入纤维连连结素、多多聚赖氨氨酸和胶胶原等成成分以促促进细胞胞贴壁。有有时，还还需要加加入酶的的抑制剂剂，如大大豆胰酶酶抑制剂剂。 为了防防止由于于操作不不慎所致致的污染染，可加加入抗生生素。常常用抗生生素有青青霉素、链链霉素及及庆大霉霉素等。 4. 消化

42、液液 进进行传代代细胞培培养时，为为了使细细胞脱离离生长表表面和细细胞离散散成单个个细胞，通通常使用用消化液液。常用用的消化化液有胰胰蛋白溶溶液(00.255或00.1225)和乙二二胺四乙乙酸二钠钠(Naa2-EDDTA)溶液(0.002)。 5. 其它 pHH调整液液，为了了营养成成分稳定定和延长长贮存时时间，配配制生理理盐溶液液，和培培养液时时，均在在临用前前加入NNaHCCO3溶液。常常用浓度度有3.7、55.6和7.4%。此此外，还还有HEEPESS溶液，是是一种氢氢离子缓缓冲剂，能能较长时时间保持持恒定的的pH值值范围。使使用终浓浓度为110115mmmolL。 染色液液：常用用的

43、有苏木精精-伊红红染色液液或称HH.E染染色；Gieemsaa染色液液。 固定液液：常用用的有中性缓缓冲福尔尔马林，相相当于110的的福尔马马林；Bouuin氏氏固定液液；醋酸甲甲醇，临临用前配配制，结结合Giiemssa染色色效果较较好；FAAA固定液液，由福福尔马林林、冰醋醋酸及880酒酒精组成成，用于于盖片单单层培养养的固定定。 (三) 消毒技技术 在细胞胞培养中中，消毒毒是最基基本的一一项工作作，它直直接影响响实验的的结果。消消毒措施施应在细细胞培养养的每个个环节严严格执行行。细胞胞培养的的微生物物污染，包包括细菌菌、真菌菌及病毒毒，它们们主要来来源于：操作者者的粗心心；操作作表面或或

44、周围的的环境；培养液液及培养养器皿的的灭菌不不彻底或或存放时时间过久久等。 对不同同的细胞胞培养所所用物品品，可采采用不同同的消毒毒灭菌的的方法。一一般有两两类：一一是物理理灭菌法法，即利利用紫外外线、干干热及微微孔过滤滤等；二二是化学学灭菌法法，即利利用化学学消毒剂剂。主要要消毒方方面法介介绍如下下： 1. 紫外线线 适适于消毒毒空气、操操作表面面及一些些不宜用用其它方方法消毒毒的物品品和培养养板等，使使用方便便，效果果较好。应应注意其其可产生生臭氧，影影响健康康。 2. 高压蒸蒸气消毒毒 它它适于金金属器械械、胶塞塞、布类类及某些些培养液液。一般般要求115磅压压力下220miin。或或者

45、更简简单的，煮煮沸消毒毒，其不不足是湿湿度大，不不易久存存。 3. 干热消消毒 适于玻玻璃器皿皿，消毒毒后器皿皿保持干干燥并便便于使用用贮存。加加温应到到1600，保持持90-1200minn。 4. 滤过消消毒 适于大大多数培培养用液液。选择择孔径为为0.222m的微微孔滤膜膜，过滤滤除菌效效果较佳佳。 5. 消毒剂剂 适适于操作作者的皮皮肤、操操作表面面和台面面、桌椅椅及墙壁壁等，常常用的消消毒剂有有来苏儿儿、新洁洁尔灭、过过氧乙酸酸及700酒精精。三、培养养细胞的的鉴定 对培养养细胞的的鉴定有有两个目目的：一一是观察察培养有有无变化化，以决决定是否否终止培培养，并并从冷冻冻贮存的的样品重重新建立立新的培培养细胞胞；二是是培养条条件(如如培养液液)变化化，对培培养细胞胞的影响响。因为为培养条条件的一一致性，对对于实验验结果的的可信性性有极为为