细胞生物学技术gyah.docx

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1、第二章 细胞生生物学技技术细胞生物物学的发发展是与与实验技技术的进进步密切切相关的的，细胞胞生物学学的每一一个重大大进展都都是由于于引入了了新的研研究技术术的结果果。光学学显微镜镜的发明明开创了了细胞学学，电子子显微镜镜的出现现使人们们对细胞胞结结构构的认识识深入到到超微结结构水平平。细胞胞化学和和分析细细胞学技技术可对对细胞的的各种成成分进行行定位和和定量的的分析，有有利于细细胞结构构与功能能的研究究。细胞胞培养技技术可将将细胞在在体外环环境中生生长，在在体外研研究细胞胞的结构构、功能能和生命命活动规规律，而而细胞工工程技术术则可人人为地将将细胞进进行改造造，以获获得具有有特定生生物学特特性

2、的细细胞。近近年来，分分子生物物学技术术的广泛泛应用，更更有力地地推动了了细胞生生物学的的发展。细细胞生物物学技术术种类很很多，包包括物理理技术、化化学技术术和实验验生物学学技术等等，本章章仅对主主要的细细胞生物物学技术术作简略略的介绍绍，对于于在细胞胞生物学学研究中中广泛应应用的分分子生物物学技术术，由于于篇幅有有限，本本书不作作介绍了了。第一节 显微微镜技术术显微镜技技术是细细胞学和和细胞生生物学得得以建立立和发展展的重要要工具，包包括光学学显微镜镜（liightt miicrooscoope）、电子显微镜(electron microscope )和扫描探针显微镜(scanning pr

3、obe microscope)三个层次的显微镜和相应的技术。在光学显微镜下看到的细胞结构称为细胞显微结构（microscopic structure），由于受到分辨率的限制，光学显微镜不能分辨直径小于0.2m的结构，如生物膜、细胞骨架和一些细胞器等。电子显微镜下则可以观察到这些光学显微镜下看不到的结构，称为细胞亚显微结构（submicroscopic structure）。随着电子显微镜分辨率的不断提高，再结合一些其他技术如扫描探针显微镜和X光衍射等，己使人们对细胞结构的认识达到分子水平。一般把细胞从亚显微水平到分子水平的结构统称为细胞超微结构（ultrastructure）。图2-11显示了

4、了不同分分辨率时时所看到到的拇指指表皮结结构，从从大体、显显微、亚亚显微、一一直到分分子、原原子水平平。参照前书书图参照照前书图图2-11图2-11 细细胞与原原子比例例图 （引自AAlbeertss等，220022）参照前书书图2-1一、 显微镜与与分辨率率人类最初初只是用用肉眼直直接观察察周围世世界，可可是人眼眼观察事事物的能能力是有有限的，一一般情况况下在225cmm的明视视距离内内，只能能分辨相相距0.100.2mmm的两两个物体体，如果果小于这这一距离离，人的的眼睛就就不能分分辨。117世纪纪英国人人Hoooke和和荷兰人人 Leeeuwwenhhoekk分别利利用原始始的光学学显微

5、镜镜发现了了机体的的细胞以以及许多多微生物物，观察察到了它它们的微微细结构构，使生生物学进进入了光光学显微微镜时代代，开创创了组织织细胞学学的微观观世界研研究。但但是不管管多么完完善的光光学显微微镜，它它的分辨辨率极限限为0.2mm，也就就是说不不能分辨辨出距离离小于00.2m的两两个点。220世纪纪30年年代，德德国的RRuskka发明明了电子子显微镜镜，突破破了光镜镜的局限限，其分分辨率可可达2nnm左右右，使人人们对于于细胞结结构认识识逐步深深入到超超微观世世界。220世纪纪80年年代IBBM苏黎黎世实验验室的BBinnningg等人发发明了扫扫描隧道道显微镜镜，分辨辨率达00.2nnm

6、左右右，可直直接观察察DNAA、RNAA等生物物大分子子及生物物膜等结结构。分辨率（resolution）是指区分开两个质点间的最小距离。对于任何显微镜来说, 分辨率都是最重要的性能参数。光学显微微镜的分分辨率与与光波波波长，物物镜数值值孔径有有关，可可用Abbbe公公式表示示： 00.611d = nnsinnqd为分辨辨率，为物镜镜与物体体间介质质折射率率,空气为为1，油油为1.5，为光束束进入物物镜的半半角，ssin小于(以极极值1代代入公式式)。代入公式式：d=0.610.55m11.50.22m因此在光光学显微微镜中，越短，分辨率越高；n和越大，分辨率也越高。nsin简称N.A，即表

7、示数值孔径，物镜上一般都标有 N.A值，N.A值越大，分辨率越高。从上述计计算中我我们可以以看出，光光学显微微镜分辨辨率受到到光波波波长的限限制，大大约等于于所用光光源的半半波长。这这是由于于光波具具有衍射射现象，当当光波波波长大于于物体二二倍时，光光波能绕绕过物体体前进，就就像没有有遇到物物体一样样，所以以在光镜镜下看不不清直径径小于波波长一半半的物体体。当物物体直径径小于2200nnm（00.2m）就就分辨不不清。电子显微微镜采用用波长短短的电子子射线作作为照明明源，电电子射线线的波长长约为可可见光波波长的十十万分之之一，约约等于00.00053nnm，但但由于电电子透镜镜相差的的存在，限

8、限制了电电镜的分分辨率，使使之不能能达到如如此高的的程度。目目前电镜镜的极限限分辨率率为0.2nmm左右，比比光学显显微镜极极限分辨辨率提高高了约110000倍，比比人眼分分辨率提提高了1100万万倍左右右。扫描探针针显微镜镜的制作作原理与与光镜和和电镜完完全不同同，如扫扫描隧道道显微镜镜是利用用量子力力学中的的隧道效效应原理理制作成成的，是是目前分分辨率最最高的一一类显微微镜。其其侧向分分辨率达达0.110.2nmm；纵向向分辨率率达0.01nnm。二、 光学显微微镜技术术光学显微微镜技术术是研究究细胞结结构最重重要的工工具，在在细胞生生物学领领域中应应用最为为广泛。近年年来，随随着多种种现

9、代生生物学技技术与光光镜技术术的结合合，使光光学显微微镜展示示出更新新的活力力。目前前光学显显微镜已已发展成成多种类类型，用用于各类类不同的的研究目目的。在在细胞生生物学中中常用的的有普通通光学显显微镜、荧荧光显微微镜、激激光共聚聚焦显微微镜、相相差显微微镜，以以及暗视视野显微微镜和微微分干涉涉差显微微镜。 （一）普普通光学学显微镜镜技术 普通通光学显显微镜（简简称光镜镜）是最最常使用用的显微微镜，主主要由三三部分组组成：聚聚光镜、物物镜和目目镜。光光镜采用用可见光光作光源源，分辨辨率为00.2m，放放大倍率率为10000倍倍，其他他几种显显微镜都都是在此此基础上上发展起起来的。 用于于普通光

10、光学显微微镜观察察的生物物样品必必须应过过一系列列的组织织处理并并制成11100m的切切片。常常规的样样品制备备方法是是：甲醛醛固定，酒酒精脱水水，石蜡蜡包埋，切切片，苏苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色，光镜观察。普通光学学显微镜镜能观察察染色的的生物标标本的结结构，主主要是因因为光线线通过染染色标本本时其颜颜色（光光波的波波长）和和亮度（光光波的振振幅）发发生变化化，人的的眼睛才才能观察察到。 （二二）荧光光显微镜镜技术荧光显微微镜（ffluooresscennt mmicrrosccopee）是以各种特定波长光源激发生物标本中的荧光物质，产生各种可见颜色荧光的一种显

11、微镜。荧光显微镜一般采用高压汞灯和弧光灯作为光源，在光源和反光镜之间放一组滤色片以产生特定波长的激发光，光谱一般从紫外到红外，从而激发各种荧光物质产生不同波长的发射光。利用荧光显微镜可研究荧光物质在组织和细胞内的分布，以达到对细胞的特定物质进行定性、定位和定量观察的目的。与生物学有关的荧光现象有三种： 自发发荧光 通过过激发光光会使物物体发出出荧光，如如叶绿素素、维生生素A等。 诱发发荧光 通过过诱导剂剂作用而而发的荧荧光，如如甲醛蒸蒸气处理理可诱发发细胞和和组织中中生物单单胺类产产生荧光光。 荧光光染料染染色荧光光 例例如吖啶啶橙可以以对细胞胞DNAA、RNAA同时染染色，显显示不同同颜色的

12、的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。荧光染料可和抗体共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原结合形成抗原抗体复合物，经激发后发射荧光进行抗原定位。由于荧光光显微镜镜技术染染色简便便、敏感感度高而而且图像像色彩鲜鲜明，所所以是目目前对特特异蛋白白质等生生物大分分子定性性、定位位的有力力的工具具。(三)相相差显微微镜技术术 相差差显微镜镜（phhasee coontrrastt miicrooscoope）是一种可以观察活细胞或未经染色的标本的显微镜。相差显微镜能够改变直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线以增大其明暗反差。因此可以观

13、察活细胞或未经染色的标本。相差显微微镜与普普通显微微镜的主主要区别别是在物物镜后装装有一块块“相差板板”，偏转转的光线线分别通通过相差差板的不不同区域域，由于于相差板板上部分分区域有有吸光物物质，所所以又使使两组光光线之间间增加了了新的光光程差，从从而对样样品不同同密度造造成的相相位差起起“夸大”作用。最最后这两两组光线线经过透透镜又会会聚成一一束，发发生互相相叠加或或抵消的的干涉现现象，从从而表现现出肉眼眼明显可可见的明明暗区别别。观察活体体细胞常常采用倒倒置相差差显微镜镜，它与与一般相相差显微微镜的不不同是光光源和聚聚光器装装在上方方，相差差物镜装装在载物物台下方方，便于于观察在在培养瓶瓶

14、中贴壁壁培养的的细胞，这这样可清清楚地分分辨细胞胞的形态态、细胞胞核、核核仁以及及胞质中中存在的的颗粒，甚甚至研究究细胞核核、线粒粒体等细细胞器的的动态。 （四）微微分干涉涉差显微微镜技术术微分干涉涉差显微微镜(ddifffereentiial intterffereencee coontrrastt ) 又又称Noomarrskii相差显显微镜，其其优点是是能显示示结构的的三维立立体投影影影像。与与相差显显微镜相相比，标标本可略略厚一点点，折射射率差别别更大，故故影像的的立体感感更强。微分干涉涉差显微微镜利用用的是偏偏振光，这这些光经经棱镜折折射后分分成两束束，在不不同时间间经过样样品的相相

15、邻部位位，然后后在经过过另一棱棱镜将这这两束光光汇合，从从样品中中厚度上上的微小小区别就就会转化化成明暗暗区别，增增加了样样品反差差并且具具有很强强的立体体感。微分干涉涉显微镜镜能使细细胞核及及较大的的细胞器器如线粒粒体等具具有较强强的立体体感，比比较适合合于显微微操作。目目前多用用于基因因注入、核核移植、转转基因动动物等生生物工程程的显微微操作。将将微分干干涉差显显微镜接接上录象象机，可可以观察察活细胞胞中的颗颗粒及细细胞器的的运动。（五）激激光扫描描共焦显显微镜 激光扫扫描共焦焦显微镜镜(laseer sscannninng cconffocaal mmicrrosccopee，LLSCM

16、M)，也也被称为为激光扫扫描细胞胞仪(laseer sscannninng ccytoometter，LLSC)。自220世纪纪70年年代问世世以来很很快得到到迅速发发展，成成为分子子细胞生生物学的的新一代代研究工工具。激光扫扫描共焦焦显微镜镜在显微微镜基础础上配置置激光光光源，扫描装装置，共扼聚聚焦装置置和检测测系统，整整套仪器器均由计计算机自自动控制制，专用软软件监控控和执行行各组件件之间的的切换。生生物医学学应用中中LSCCM的显显微镜以以倒置显显微镜为为主，便便于活细细胞检测测。与普通通光镜和和荧光显显微镜相相比有一一些明显显的优点点，其中中主要有有：（1）普普通显微微镜使用用的光源源

17、为卤素素灯，光谱范范围宽，成象时时样品上上每个照照光点均均会受到色色差影响响以及由由照射光光引起的的散射和和衍射的的干扰，影响成成象质量量。LSSCM的的光源为为激光，是单色色性好的的平行光光，基本消消色差，成象聚聚焦后焦焦深小，纵向分分辨率高高，可无损损伤地对对样品作作不同深深度的层层扫描和和荧光强强度测量量。（2）普普通荧光光显微镜镜分辨率率低，显示的的图象结结构为多多层面的的图象迭迭加，结构不不够清晰。LLSCMM结构上上采用双双针孔(pinhholee)装置置，形成物物象共扼扼的独特特设计(如图222所所示)。激光光通过聚聚光镜焦焦平面上上针孔形形成点光光源经物物镜在焦焦平面上上对样品

18、品进行逐逐点扫描描，样品上上每个照照射点，反反射后经经过物镜镜折射到到像焦平平面的探探测针孔孔处成像像，经空空间滤波波后，有效地地抑制同同焦平面面上非测测量光点点形成的的杂散荧荧光和样样品的不不同焦平平面发射射来的干干扰荧光光。每个像像点被光光电倍增增管(PPMT)或冷电电感藕合合器件(cCCCD)探探测器接接收。因因为光学学系统物物象共扼扼，只有物物镜焦平平面上的的点经针针孔空间间滤波才才能形成成光点图图象，扫描后后可得到到信噪比比极高的的光学横横断面，分辨率率比普通通光学显显微镜提提高1.4倍。LSSCM能能以0.1umm的步距距沿轴向向对细胞胞进行分分层扫描描，得到一一组光学学切片，不不

19、同焦平平面的光光学切片片经三维维重建后后能得到到样品的的三维立立体结构构，这种功功能被形形象地称称为显微CTT。（3）LLSCMM的高灵灵敏度、高高分辨率率和高放放大倍数数，减少了了光淬灭灭的影响响，提供了了普通光学学显微镜镜无法显显示的结结构信息息，并适适用于达达到毫秒秒级的快快速变化化检测。图2-22 激激光扫描描共焦显显微镜物物像共轭轭原理图图参照前书书图2-2LSCMM最常用用的功能能是荧光光检测、三三维重建建和显微微操作等等。其中荧荧光检测测覆盖的的内容极极为广泛泛，通过过多种荧荧光探针针或荧光光连接抗抗体，可对细细胞内离离子、ppH值、各各种蛋白白质分子子进行动动态测定定。另外外利

20、用激激光扫描描还可以以对细胞胞进行特特殊操作作，例如如光刀切切割法(cookkie-cuttter) 作粘粘附细胞胞分选(adheeredd celll sorttingg)，能能杀灭不不需要的的细胞，保保留所选选细胞亚亚群继续续培养；激光光光陷阱技技术（又又称为光光镊技术术）对目目标细胞胞进行非非接触式式的捕获获和固定定，并进行行精确操操作；激激光作为为光子刀刀可以用用来完成成细胞膜膜瞬间打打孔以及及对线粒粒体、溶溶酶体、染染色体和和神经元元突起的的切割等等显微细细胞外科科手术。三、电子子显微镜镜技术电子显微微镜技术术简称电电镜技术术，它包包括电子子显微镜镜(ellecttronn miic

21、rooscoope )和样品品制备技技术（tecchniiquees oof ssampple preeparratiion）两大方方面。电电子显微微镜的基基本原理理与光学学显微镜镜相同（图图23），但但光源和和透镜有有所不同同，电镜镜利用电电子束作作光源，电电磁场做做透镜，因因而最佳佳分辨率率可达11-2 ，放放大倍率率达1550万倍倍。样品品制备技技术是制制作电镜镜标本的的综合技技术，比比光学显显微镜制制片过程程更精细细和复杂杂。它包包括普通通样品制制备技术术（如超超薄切片片技术）和和特殊样样品制备备技术（如如电镜酶酶细胞化化学技术术）。第一台电电镜诞生生于19931年年，至今今已有770

22、余年年的历史史，经过过不断的的改进和和提高已已从最初初的一种种电镜发发展为多多种电镜镜，分辨辨率可达达到1。近年年来，随随着电镜镜计算机机的一体体化，使使新型电电镜的操操作更为为简便，图图像获取取更快捷捷，而且且电镜图图像在观观察过程程中可以以得到即即时储存存和统计计分析等等，大大大提高了了电镜的的使用效效率。电子显微微镜技术术是研究究细胞超超微结构构最重要要的手段段。广泛泛应用于于医学生生物学等等各个学学科，在在现代医医学科学学研究和和临床疾疾病的诊诊断中发发挥着重重要的作作用。图2-33 光学学显微镜镜和电子子显微镜镜结构原原理图参照前书书图2-3 （一）电电子显微微镜的种种类 电子子显微

23、镜镜是以电电子束作作光源、电电磁场作作透镜、具具有高分分辨率和和放大倍倍率的显显微镜。电电镜通过过收集、整整理和分分析电子子与样品品相互作作用产生生的各种种信息而而获得物物体的形形貌和结结构等。电电镜的类类型也是是利用电电子信号号的不同同和成像像的不同同而进行行分类。主主要分为为透射电电子显微微电镜、扫扫描电子子显微电电镜、分分析电子子显微镜镜和高压压电子显显微镜。1、 透射电子子显微电电镜 透射电子子显微电电镜（traansmmmissionn ellecttronn miicrooscoope），是是发展最最早、应应用最广广泛的电电镜，一一般所说说的电镜镜指的便便是透射射电镜。透透射电镜镜

24、主要用用于观察察组织细细胞的内内部结构构。透射电镜镜由三大大系统组组成，包包括镜体体系统、真真空系统统和电子子线路系系统。镜镜体系统统是电镜镜的主体体，结构构相当复复杂，又又分为照照明系统统、成像像系统和和观察记记录系统统。照明系统统由电子子枪和聚聚光镜组组成，电电子枪发发射电子子作为电电镜的照照明光源源。在电电镜中电电子射线线在几万万伏的加加速电压压作用下下产生了了短波长长高能电电子束，加加速电压压越高，电电子束的的波长越越短，电电镜的分分辨率就就越高。聚聚光镜则则将来自自电子枪枪的电子子束会聚聚在样品品上并可可调节照照明强度度等。成像系统统由样品品室、物物镜、中中间镜和和投影镜镜组成，是是

25、电镜具具有高放放大倍率率和高分分辨率的的关键部部位，主主要是借借助改变变各个透透镜的电电流来获获得不同同的放大大倍率。成成像系统统的总放放大倍率率是物镜镜、中间间镜和投投影镜放放大倍数数的乘积积。观察记录录系统包包括观察察室和底底片室。观观察室内内有一个个荧光屏屏，电子子束穿透透样品，带带有样品品信息的的电子经经成像系系统放大大投影到到观察室室的荧光光屏上，激激发荧光光屏发出出可见光光，透过过的电子子多荧光光屏亮，反反之则暗暗，荧光光屏的亮亮、暗程程度与样样品微细细结构一一一对应应，最终终产生具具有一定定反差的的影象。图图像的保保留可通通过荧光光屏下的的底片室室内的胶胶片感光光，使图图像拍摄摄

26、下来，也也可将图图片通过过探头输输送到计计算机中中经打印印机打出出图片。电镜有复复杂的真真空系统统和电路路系统以以维持镜镜筒的高高真空状状态和稳稳定的工工作条件件。2、 扫描电子子显微镜镜 扫描描电子显显微镜（scaanniing eleectrron miccrosscoppe）简称称扫描电电镜。扫扫描电镜镜利用二二次电子子信号成成像，用用于观察察样品表表面形貌貌，图像像具有立立体感。扫描电镜镜的光源源部分与与透射电电镜相同同，是由由电子枪枪产生电电子射线线经聚光光镜聚焦焦形成一束极极细的光光斑称为为电子探探针（eelecctroon pprobbe）。电电子探针针受扫描描发生器器控制，在在

27、样品表表面进行行逐点扫扫描，把把样品表表面的原原子外层层的电子子击出，形形成二次次电子，二二次电子子被二次次电子检检测器收收集、转转换、放放大、转转换到显显象管，由由于显象象管的荧荧光屏上上的画面面与样品品被电子子束照射射面呈严严格同步步扫描，逐逐点逐行行一一对对应，这这样就能能看出样样品表面面形貌。二次电子子发射越越多的地地方，在在像上相相应的点点就越亮亮，反之之则暗。由由于二次次电子产产生的多多少与电电子束入入射角度度有关，也也就是与与样品表表面的起起伏有关关，所以以荧光屏屏上得到到的图像像反应了了样品表表面的立立体形貌貌。3、 分析电子子显微镜镜 分析析电子显显微镜（anaalyttic

28、 eleectrron miccrosscoppe）简称称分析电电镜，是一种种带有特特殊附件件波谱仪仪（lenngthh diisapperssivee sppecttrosscoppe）或能谱谱仪（eneergyy diisapperssivee sppecttrosscoppe）的电子子显微镜镜。它可可以装配配在透射射电镜上上，也可可以装配配在扫描描电镜上上。当高高速运动动的电子子会聚成成电子束束（探针针）打到到样品上上时，所所激发出出来的XX射线波波长是和和样品内内所含元元素的原原子序数数密切相相关的。把把特征性性X射线根根据其波波长和强强度分别别加以收收集便可可推知样样品内包包含哪些些

29、成分及及各元素素的含量量。利用分析析电镜可可以在观观察样品品形貌的的同时了了解微小小区域（如如某一细细微结构构）内所所含元素素的种类类及其含含量，在在细胞超超微结构构水平上上对其内内部的化化学元素素成分进进行定位位、定性性、定量量分析。从而获知结构变化与其组成的元素变化的关系，它的分辨率很高，元素周期表上大部分元素都能分辨出来。4、 高压电子子显微镜镜 高压压电子显显微镜（higgh vvolttagee ellecttronn miicrooscoope）指加加速电压压在1220KVV以上的的透射电电子显微微镜，若若加束电电压在5500KKV以上上称为超超高压电电镜。目目前世界界上超高高压电

30、镜镜最高的的加速电电压可达达30000 KKV。高压电子子显微镜镜的主要要特点是是分辨本本领高，对对样品的的穿透能能力强，可可用于观观察较厚厚的样品品，整体体培养的的细胞不不需超薄薄切片即即可观察察内部的的三维微微细结构构，如微微丝、微微管等，在在偏振镜镜下可呈呈现三维维排列的的图象特特点。但但电镜体体积庞大大，价格格昂贵，难难以普及及。 （二）电电镜样品品制备技技术电镜样品品制备技技术较复复杂，种种类也较较多，分分为普通通样品制制备技术术和特殊殊样品制制备技术术。这里里简单介介绍几种种常用的的样品制制备技术术。1、 超薄切片片技术 超薄薄切片技技术（ulttrammicrrotoomy）是透

31、透射电镜镜样品制制备方法法中最基基本的一一种。由由于电子子束穿透透能力的的限制透透射电镜镜观察的的样品必必须很薄薄，普通通光镜切切片厚度度约35mm，而透透射电镜镜切片厚厚度则要要求在550880nmm左右。这这种薄切切片称为为超薄切切片。超超薄切片片技术包包括：取取材、固固定、脱脱水、浸浸透、包包埋、切切片及染染色。电镜样品品采用戊戊二醛和和锇酸双双重固定定，用酒酒精或丙丙酮脱水水，环氧氧树脂进进行包埋埋，超薄切片片机切片片，采用用重金属属如铀和和铅进行行染色以以增加细细胞结构构间的反反差。2、 负染色技技术 负染染色技术术（naggtivve sstaiin ttechhniqque）又称

32、称阴性染染色，是是透射电电镜样品品制备技技术中的的一种。此此技术是是指通过过重金属属盐在样样品四周周堆积而而加强样样品外周周的电子子密度，使使样品显显示负反反差，衬衬托出样样品的形形态和大大小。常常用的重重金属有有磷钨酸酸钠、醋醋酸铀等等。负染色技技术主要要用于细细菌、病病毒、噬噬菌体等等微生物物大分子子结构、亚亚细胞碎碎片以及及分离的的细胞器器等研究究工作。负负染色样样品不需需经过固固定、脱脱水包埋埋和超薄薄切片等等复杂操操作，而而是直接接对沉降降的样品品匀浆悬悬浮液进进行染色色。3、 冷冻蚀刻刻技术 冷冻蚀刻刻技术（ freeezee-ettchiing tecchniiquee）又称称冷

33、冻复复型，是是透射电电镜样品品制备技技术的一一种，是是将样品品经快速速冷冻断裂升华喷铂喷碳而而最终形形成一层层印有生生物样品品断裂面面立体结结构的复复型膜，然然后将生生物样品品腐蚀掉掉，用铜铜网将复复型膜捞捞起进行行透射电电镜观察察。冷冻蚀刻刻技术能能保持细细胞原来来的结构构，立体体感鲜明明，主要要用于生生物膜的的研究。4、 扫描电镜镜样品制制备技术术 扫扫描电镜镜适合于于研究生生物样品品的表面面特征，样样品制备备包括观观察面的的暴露、固固定、脱脱水、干干燥和导导电等。样品制备备采用戊戊二醛和和锇酸双双重固定定；乙醇醇或丙酮酮脱水。干干燥是扫扫描电镜镜样品较较重要的步步骤。由由于生物物样品柔柔

34、软多水水，大多多数的组组织含水水量在880%以以上，采采用自然然干燥，会会受表面面张力影影响使细细胞表面面收缩，形形态改变变。所以以多采用用液体CCO2临界点点干燥法法，在临临界状态态时表面面张力系系数为零零，也就就是分子子的内聚聚力等于于零时干干燥，细细胞不再再收缩，保保持了原原有的形形态。由由于干燥燥样品不不导电，因因而需要要在样品品表面镀镀一层薄薄薄的金金属膜使使样品导导电并增增加图像像的反差差和立体体感。四 、扫扫描探针针显微镜镜技术扫描探针针显微镜镜（sccannningg pprobbe mmicrrosccopee, SSPM）是二十世纪八十年代发展起来的一类新型的显微镜，它们都

35、是基于近场扫描原理，利用带有超细针尖的探针在样品表面扫描，获得样品的微观信息如表面形貌、电特性、磁特性和柔韧性等，具有原子尺度的高分辨本领，其侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm。扫描探针显微镜有很多种，主要包括扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope,STM）和原子力显微镜（atomic force microscope, AFM）等。 （一一）扫描描隧道显显微镜 扫描描隧道显显微镜是是扫描探探针显微微镜家族族中的第第一个成成员，是是由 GG Biinniig 和和H RRohrrer在在19881年发发明的，他他们因此此而获得得诺贝尔尔物理

36、学学奖。SSTM的的主要原原理是利利用量子子力学中中的隧道道贯穿效效应，其其核心部部件是一一个能在在样品表表面进行行扫描、与与样品之之间保持持一定偏偏压、其其直径为为原子尺尺度的探探针（图图2-44）。在在通常的的低电压压下，分分离的针针尖与样样品之间间（相当当于两个个电极）具具有很大大的阻抗抗，阻止止电流通通过，称称为势叠叠。当针针尖与样样品非常常靠近时时，其间间的势叠叠变得很很薄，电电子云相相互重迭迭，在针针尖与样样品之间间施加一一电压，电电子就可可以通过过隧道效效应由针针尖转移移到样品品或从样样品转移移到针尖尖，形成成隧道电电流。通通过记录录隧道电电流的变变化就可可以获得得样品表表面的微

37、微观信息息。STTM要求求样品表表面与针针尖具有有导电性性。图2-44 STTM工作作原理图图 STTM有两两种成像像模式：恒流模模式和恒恒高模式式。在恒恒流模式式中，SSTM通通过反馈馈系统不不断调节节针尖与与样品表表面每个个检测点点上的距距离，使使隧道电电流保持持一个不不变的恒恒值，测测定扫描描头上针针尖与样样品表面面的高度度变化就就可获得得样品表表面形貌貌等微观观信息。在在恒高模模式中，针针尖始终终保持在在样品上上方一个个恒定的的高度上上，隧道道电流随随着样品品表面形形貌等微微观特性性的改变变而变化化，通过过检测每每个测量量点上的的电流变变化来获获得样品品表面微微观信息息。在恒恒高模式式

38、中，扫扫描头不不需要上上下移动动，从而而加快了了扫描速速度。（二）原原子力显显微镜 原子力力显微镜镜是19986年年设计完完成的，它它主要通通过检测测针尖与与样品之之间的原原子间作作用力来来获得样样品表面面的微观观信息，因因此不要要求样品品具有导导电性。AAFM的的工作原原理是将将一个对对微弱力力非常敏敏感的微微悬臂一一端固定定，另一一端装上上探针，针针尖与样样品表面面轻轻接接触，针针尖尖端端原子与与样品表表面原子子间极微微弱的排排斥力使使微悬臂臂向上弯弯曲（图图2-55）。通通过检测测微悬臂臂背面反反射出的的激光光光点在光光学检测测器上的的位置变变化，可可以转换换成力的的变化，因因为反射射光

39、点的的位置变变化或微微悬臂弯弯曲变化化与力的的变化成成正比。微微悬臂的的弯曲是是多种力力的共同同作用结结果，其其中最普普遍的是是范得瓦瓦尔力，针针尖与样样品表面面微小的的距离变变化就能能产生不不同大小小的范得得瓦尔力力。通过过控制针针尖在扫扫描中这这种力的的恒定，测测量针尖尖纵向的的位移量量，就可可获得样样品表面面的微观观信息。图2-55 AFFM工作作原理图图 AAFM也也有两种种工作模模式：恒恒力模式式和恒高高模式。在在恒力模模式中，通通过精确确控制扫扫描头随随样品表表面形貌貌变化在在纵向上上下移动动，微持持微悬臂臂所受作作用力的的恒定，从从扫描头头的纵向向移动值值得出样样品表面面的形貌貌

40、像。在在恒高模模式中，扫扫描头高高度固定定不变，从从微悬臂臂在空间间的偏转转信息中中直接获获取样品品表面信信息。SPM具具有分辨辨本领高高、可连连续动态态地在各各种环境境中（真真空、气气体和液液体）检检测物体体微观信信息等特特点，很很快被应应用于生生命科学学研究。SSPM最最早应用用于研究究生物大大分子（DDNA和和蛋白质质等）的的结构与与功能，这这方面已已积累了了丰富的的资料。近近年来，在在其他方方面也展展开了积积极的才才探索，如如将AFFM用于于研究生生物大分分子之间间的相互互作用、研研究生物物结构的的纳米操操作、研研究活细细胞的结结构与功功能以及及用于医医学和药药物学研研究等。第二节 细

41、胞化化学技术术 细细胞化学学技术（cyttochhemiistrry）是在在保持细细胞结构构完整的的条件下下，通过过细胞化化学反应应研究细细胞内各各种成分分(主要要是生物物大分子子)的分分布情况况以及这这些成分分在细胞胞活动过过程中的的动态变变化的技技术，可可以通俗俗地说，这这类技术术让人们们在显微微镜下看看到细胞胞内大分分子的位位置。这这类技术术包括光光镜和电电镜水平平的酶细细胞化学学技术、免免疫细胞胞化学技技术、放放射自显显影技术术和原位位杂交技技术等。一、 酶细胞化化学技术术酶细胞化化学技术术（enzzymee cyytocchemmisttry）是通通过酶的的特异细细胞化学学反应来来显

42、示酶酶在细胞胞内的分分布及酶酶活性强强弱的一一种技术术。早期期的酶细细胞化学学工作是是在光学学显微镜镜下进行行的，称称为组织织化学（hisstocchemmisttry），随着着电镜技技术的发发展开始始用电镜镜观察酶酶的分布布，称为为电镜酶酶细胞化化学技术术（eleectrron miccrosscoppic enzzymee cyytocchemmisttry）。酶细细胞化学学技术对对研究细细胞器的的结构与与功能、细细胞的生生理与病病理过程程以及细细胞器的的相互关关系曾发发挥重要要作用。近近来酶细细胞化学学技术的的单独运运用大为为减少，但但是这一一技术的的原理导导致免疫疫组织化化学或细细胞化

43、学学技术的的诞生和和不断更更新，而而后者则则是研究究细胞中中大分子子定性和和定位最最简便有有效的手手段，正正得到极极为广泛泛的应用用。因此此有必要要了解酶酶细胞化化学技术术。 （一）酶酶细胞化化学技术术的原理理 显显微镜下下无法直直接观察察到细胞胞内的酶酶，通过过酶细胞胞化学反反应才能能间接地地反应酶酶的存在在位置。酶酶细胞化化学的原原理是：在一定定条件下下，使组组织细胞胞内的酶酶与其底底物相互互作用，形形成初级级反应产产物，再再用捕捉捉剂在酶酶的作用用部位进进行捕捉捉，使其其在显微微镜下可可见。这这一反应应过程所所示如下下：酶细细胞化学学反应初级捕捉捉剂最终终酶底物物 反应产产物 反应应产物

44、酶反反应捕捉反反应从上式可可见，酶酶细胞化化学反应应实际上上由两项项反应组组成。前前面的酶酶反应相相当于细细胞内自自然条件件下发生生的酶促促反应，后后面的捕捕捉反应应则是为为了使酶酶反应可可见而人人为造成成的。捕捉反应应的目的的是使酶酶反应产产物形成成在显微微镜下可可见的最最终反应应产物，即即最终反反应产物物在光镜镜下具有有鲜明颜颜色，在在电镜下下具有高高电子密密度。捕捕捉反应应主要有有金属盐盐沉淀法法、色素素形成和和嗜锇物物质生成成法。如如：金属属盐沉淀淀法将重重金属作作为捕捉捉剂，使使酶反应应产物直直接或间间接与之之结合生生成金属属盐沉淀淀。在色色素形成成和嗜锇锇物质生生成法中中，捕捉捉底

45、物在在酶作用用下转化化成色素素沉淀于于酶作用用部位，在在光镜下下可见；或者捕捕捉底物物转化成成嗜锇物物质，经经锇酸作作用后形形成高电电子密度度的锇黑黑，在电电镜下可可见。在生物化化学中，酶酶被分成成水解酶酶、氧化化还原酶酶、转移移酶、裂裂合酶、合合成酶和和异构酶酶六大类类。现以以水解酶酶为例介介绍如下下： 初级反反应：底底物被磷磷酸水解解酶作用用后分解解产生磷磷酸磷酸水解解酶底物 H3PO4最终反应应： 磷磷酸与金金属捕捉捉剂结合合形成反反应产物物磷酸铅铅（黑色色、高电电子密度度）捕捉剂（Pb2+） H33PO4 Pbb(POO4)2 （二二）实验验方法1、样品品制备 酶细胞化化学的一一个重要

46、要问题是是既要保保存好细细胞内酶酶的活性性，又要要保存好好细胞的的结构，因因此选择择适当的的固定剂剂种类、浓浓度、固固定的方方式和时时间是细细胞化学学技术的的一个关关键问题题。光镜镜样品固固定多选选用中性性福尔马马林或多多聚甲醛醛,4、244小时，常常规的石石蜡包埋埋切片可可以满足足相当一一部分酶酶的细胞胞化学要要求；电电镜样品品固定通通常用00.52戊二二醛或44多聚聚甲醛,4、2小时，再再切成551000m的厚片片用于细细胞化学学反应，反反应后经经常规的的锇酸后后固定，脱脱水、包包埋、超超薄切片片、至电电镜下观观察。冷冷冻切片片能较大大限度地地保存酶酶的活性性，因此此是光、电电镜酶细细胞化

47、学学技术中中常用的的方法。2、酶细细胞化学学反应酶细胞化化学反应应实际上上就是孵孵育反应应的过程程，孵育育液的成成分主要要有酶的的底物、捕捕捉剂，保保证孵育育液pHH 的缓缓冲液以以及有关关的添加加剂等。孵孵育的温温度和时时间可根根据不同同的酶和和组织通通过实验验而确定定。电镜镜酶细胞胞化学的的样品在在孵育反反应后需需经锇酸酸后固定定、梯度度乙醇脱脱水、环环氧树脂脂包埋和和超薄切切片，至至电镜下下观察。3、基本本实验过过程光镜样品品： 固固定（酶酶固定结构固固定） 冷冻冻切片 细胞胞化学反反应（酶反应应捕捉捉反应） 光镜观察 电镜样品品：固定（酶酶固定结构固固定）切组织织片细胞化化学反应应（酶反应应捕捉捉反应）脱水包埋超薄切片电镜观察二、 免疫细胞胞化学技技术免疫细胞胞化学技技