第三章 玻片标本的制作技术优秀课件.ppt

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1、第三章 玻片标本的制作技术第1页，本讲稿共61页 制作光学显微镜切片标本的方法有如下几种：徒手切片法：徒手切片法：采用本法制作切片，一般适用于植物材料。它只可制作一些临时性使用的玻片标本，而且切片的厚度不均匀，成功率较低。但是制片速度快，所以在植物组织形态结构的研究中，一直使用至今。其切片法方是：用自己的左手持要切片的植物组织，右手拿单面刀片或双面刀片从外侧向自己的怀中方向切片，把切出的每一张片子都放在培养皿中盛放的水里，然后在水面上挑选厚度均匀、完整的切片，放在载玻片上染色或其它处理后进行观察。第2页，本讲稿共61页 滑行切片法：滑行切片法：这种切片方法是用专门的滑行切片机对经过包埋的大块样

2、品进行切片，这种技术对生物组织要用火棉胶进行包埋。本方法可对大面积的组织进行切片，但切出的片子不能连成带状，只能一片一片的切。本种技术方法在植物木材的教学和研究中应用较多，动物材料的研究一般不用。因此在实验室内一般见不到滑行切片机。第3页，本讲稿共61页 冷冻切片法：冷冻切片法：这种切片法是用深低温冷冻介质（液体二氧化碳、半导体冷冻器或专用封闭冷冻切片装置）对经过固定或新鲜的生物样品冷冻之后，再用专用的切片机进行切片。本法具有出结果速度快，样品不需固定等特点。所以在医院的病理诊断室应用特别广，可在510分钟就可得到诊断结果。本法所使用的切片机冷冻装置，有用液体二氧化碳的，有用半导体冷冻装置的，

3、近年来又出现了一种封闭式冷冻切片机，它是将一套切片机安装在一个密闭的冷冻室内，室内的温度可达20度以下，使用非常方便。但也有它的缺点，主要是不能进行连续切片，切片的成功率较低。第4页，本讲稿共61页 石蜡切片：石蜡切片：在制作光学显微镜切片标本的技术中，石蜡切片技术是目前最常使用的方法，它可对几乎所有的生物样品进行切片，可制成永久保存的玻片标本，本技术程序复杂，操作技术水平要求高，在进行工作前必须做好充分的准备工作第5页，本讲稿共61页第6页，本讲稿共61页 滑行切片机第7页，本讲稿共61页 封闭式冷冻切片机第8页，本讲稿共61页 轮转式切片机（手摇切片机）第9页，本讲稿共61页一、实验前的准

4、备工作一、实验前的准备工作 1 1、器器材材：恒温培养箱、电炉子、石蜡切片机、水浴锅、解剖刀、解剖针、解剖剪刀、镊子等。有条件的可准备加热板和展片台。2 2、器器皿皿的的准准备备：解剖盘、培养皿、吸管、吸水纸、青霉素瓶、载玻片、盖玻片、酒精灯、台木、硬纸、标签纸等。3 3、试试剂剂的的准准备备：固定液、脱水剂、透明剂、染色剂、媒染剂、粘片剂、封片剂等等。第10页，本讲稿共61页 二、石蜡切片制作的基本步骤与方法二、石蜡切片制作的基本步骤与方法 制作石蜡切片一般需要经过取材 固定 清洗（水洗和酒精清洗）脱水 透明 透蜡（也称浸透）包埋 包埋块的修整与装台木 切片 粘片 展片 干燥 脱蜡 复水 染

5、色（分色和复染）脱水 透明 封片 贴标签。从上述 步骤可看出，制作石蜡切片技术程序复杂，对每一步都要认真对待，否则会造成结果不理想或失败。第11页，本讲稿共61页 一、取材一、取材 取材就是指从动物或植物体上以及其他载体上获取研取材就是指从动物或植物体上以及其他载体上获取研究和实验材料的过程叫取材。究和实验材料的过程叫取材。在石蜡切片中，取材是很重要的步骤，所取的动、植物材料必须新鲜而又要有代表性。不新鲜的或已腐败的材料制成的切片，不能反映材料的真实情况。1 1、取材的方法、取材的方法（1）、动物及离体培养细胞的取材：根据需要用锋利的刀片从动物的相应部位切取一块组织，如表面有污物需用生理盐水稍

6、加清洗，放入固定液中。组织块的大小要适中，动物组织块的厚度一般不超过3mm；离体培养的细胞可通过离心的办法收集细胞沉积团，然后放入固定液中。第12页，本讲稿共61页（2）、植物组织的取材：根据实验的要求，用利刀切取植物的根、茎或叶片，然后再切成适当的大小放入固定液中固定。2 2、取材的注意事项：、取材的注意事项：（1）、取材的动作要快，要在较短的时间内将取得的组织或细胞放入固定液中。（2）、取材过程中要尽量避免切割、夹持、挤压对组织、细胞造成的机械损伤，所以在切割时要采取一刀切断的办法，不能用拉锯式切割的方法。（3）、取材的部位必须准确，不需要的组织要尽量去除干净。第13页，本讲稿共61页（4

7、）、对时间要求严格的样品，一定要掌握好正确的取材时间。（5）、需要取对比样品时，一定要取相同一致的部位，如昆虫的触角的节段。二、固定二、固定 通通过过固固定定剂剂的的作作用用，将将组组织织、细细胞胞的的生生活状态时的结构完全保存下来的过程叫固定活状态时的结构完全保存下来的过程叫固定 1 1、固定的目的、固定的目的（1）、可防止组织细胞的自溶和腐败。（2）、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分沉淀并保存下来。第14页，本讲稿共61页（3）、使组织细胞不同的结构部分对光产生不同的折射率造成光学上的差异，增强光学观察质量。（4）、使组织变成适当的硬度，以便于后面的处理。只因如此，生物样品的固定是

8、石蜡切片制作技术中一个非常重要的步骤，根据不同质地的样品要用不同的固定液对其进行固定，只有这样才能获得较好的实验研究结果。2 2、固定剂的选择标准（条件）、固定剂的选择标准（条件）用作固定剂的化学物质必须具有凝固或沉淀蛋白质、脂肪等成分的作用；渗入组织的速度和能力要强；渗透力弱的要和渗透力强的固定剂混合使用，以取长补短成为较完善的固定液。总之，一种优良的固定剂应具备以下条件：第15页，本讲稿共61页（1 1）、能迅速渗入组织和细胞杀死原生质，以保持细）、能迅速渗入组织和细胞杀死原生质，以保持细胞的原始形态结构不发生变化。胞的原始形态结构不发生变化。（2 2）、不会使组织细胞发生收缩和膨胀。）、

9、不会使组织细胞发生收缩和膨胀。（3 3）、可以增强细胞内含物的折光系数；可增强媒染作）、可以增强细胞内含物的折光系数；可增强媒染作用和着色能力。用和着色能力。（4 4）、能使组织变成适当的硬度，可适于切片，但又不能）、能使组织变成适当的硬度，可适于切片，但又不能使材料变得太硬而松脆。使材料变得太硬而松脆。3 3、常用固定剂的种类及配方、常用固定剂的种类及配方 1 1）、固定剂的种类：）、固定剂的种类：在生物显微制片中所使用的固定剂可分为两大类，一类是单一固定剂（又称简单固定剂），它是由一种化学物质构成的，如酒精、甲醛（福尔马林）、冰醋酸、升汞和苦味酸都可以作为单一固定剂来使用。第16页，本讲稿

10、共61页 单一固定剂固定生物样品，只能对某些结构成分固定效果较好，而不能将所有的结构成分都保存下来。例如：酒精可以固定糖类物质，但不能固定脂类物质，因脂类物质可溶解于酒精，所以使用单一固定剂有它的局限性。在生物制片技术中常用的是第二种固定剂混合固定剂。它是由两种或两种以上的性质不同的化学物质混合在一起组成的，它们可彌补各自的不足，对生物样品固定后，可使细胞内的各种成分都得到保存和固定，更有利于保存组织细胞的原始形态结构。混合固定剂在配制和混合时，必须注意它们各自的物理和化学性质，氧化剂和还原剂不能混合使用，如戊二醛和锇酸。第17页，本讲稿共61页 2）、常用固定液的配方及其配制方法）、常用固定

11、液的配方及其配制方法（1 1）、单一固定液）、单一固定液 A A、酒精、酒精(C(C2 2H H5 5OH):OH):它是一种穿透速度快，易引起组织收缩的固定剂。作为固定液使用时，其浓度是70的水溶液，一般不宜用高浓度的酒精固定生物样品。B B、甲醛（、甲醛（HCHOHCHO）：）：甲醛是一种无色气体，它以3740的量溶于水后就称为福尔马林。甲醛是强还原剂，它不能与氧化剂混合使用，而且它又极容易被氧化成甲酸。常用的甲醛固定液是用福尔马林配制的，一般使用浓度为含纯甲醛45的水溶液。这种固定液穿透能力虽不如酒精强，它也会使组织硬化，但组织的收缩小。用福尔马林固定的样品有利于细胞核的染色，特别是动物

12、材料效果更佳。第18页，本讲稿共61页 C C、醋酸（、醋酸（CHCH3 3COOHCOOH）：醋酸是一种穿透能力很强的固定剂，但不会引起组织收缩、硬化；有些组织还会稍有膨胀。所以，它常与酒精、福尔马林混合使用，以缓解它们对组织的收缩能力。醋酸不能沉淀细胞质中的蛋白质，但对核蛋白固定效果较好。单独使用时其浓度为5的水溶液。D D、苦味酸三硝基苯酚，、苦味酸三硝基苯酚，C C6 6H H2 2(NO(NO2 2)3 3OHOH：它是黄色结晶，在空气中的干粉易燃烧和爆炸，所以在实验室内一般配成饱和水溶液低温保存。它在水中的溶解度为0.91.2%，也可溶于酒精、氯仿、苯及二甲苯中。它可沉淀细胞中所有

13、的蛋白质，对脂类和糖类无固定作用。第19页，本讲稿共61页 用苦味酸固定的样品，必须在70酒精中脱苦味酸的黄色，为加快去掉黄色，可向70的酒精中加几滴氨水或碳酸锂水溶液。E E、重铬酸钾（、重铬酸钾（K K2 2CrCr2 2O O7 7）：）：它是橙红色结晶，有毒。用于固定液的浓度为0.52.0的水溶液。它是强氧化剂，不能与还原剂长期混在一起。重铬酸钾在作单独使用时，对脂类有较好的固定作用，可以固定高尔基体、线粒体，但对核内物质保存能力很差；如果和醋酸混合使用，pH为4.6时，可以固定核内染色体，它不能固定蛋白质。用重铬酸钾固定的材料，应进行充分的流水冲洗。第20页，本讲稿共61页 F F、

14、升汞（氯化汞，、升汞（氯化汞，HgClHgCl2 2）：）：氯化汞是一种白色粉末，剧毒。它能固定蛋白质、核酸。升汞的穿透能力比醋酸慢，但比苦味酸、铬酸等快。用含升汞的固定液固定的样品，对酸性和碱性染色剂的染色效果都很好。经含升汞的固定液固定的样品，须经流水进行冲洗1224小时，而后还要在70酒精中加碘脱汞。G G、四氧化锇（、四氧化锇（OsOOsO4 4）也称锇酸：）也称锇酸：它是一种淡黄色结晶，空气中易升华，对粘膜有强烈的刺激作用，其水溶液呈中性，是一种强氧化剂。四氧化锇是脂类物质优良的固定剂，对高尔基体、线粒体均有较好的固定效果。第21页，本讲稿共61页 四氧化锇的穿透速度很慢。因四氧化锇

15、易与有机物发生作用变为黑色而失去效能，所以一般在使用时先用无离子水配成2的贮存液，用棕色瓶存于40C冰箱中，固定之前再用缓冲液稀释成1的浓度，固定时间不宜太长，一般是1.52小时，用四氧化锇固定的样品需用流水彻底清洗。（2)2)、混合固定液、混合固定液 混合固定液是两种以上的固定剂混合成一种固定液，常用的混合固定有：第22页，本讲稿共61页 A A、Carnoy Carnoy，s(s(卡诺氏卡诺氏)固定液固定液 100的酒精 3份 冰醋酸 1份 或者 100的酒精 6份 氯仿 3份 冰醋酸 1份 该固定液最适于细胞核内染色质的固定，是进行细胞核内物质研究的优良固定液。此液的固定速度快、固定的时

16、间短、不会引起组织的收缩。一般的植物根尖固定20分钟即可。用这种固定液固定的样品不需要专门进行清洗。第23页，本讲稿共61页 B B、FAA FAA（福尔马林醋酸酒精）混合固定液（福尔马林醋酸酒精）混合固定液 福尔马林 5ml 50或70的酒精 90ml 冰醋酸 5ml 此固定液适用于除单细胞及丝状藻类外的几乎所有的植物组织新鲜材料的固定。用本固定液固定样品的时间因材料的不同而异，一般样品固定的时间为512小时，固定后不需要清洗，可直接进入70的酒精中进行脱水。C C、Bouin Bouin，s(s(包音氏包音氏)固定液固定液 福尔马林 25ml 醋酸 5ml 苦味酸饱和水溶液 75ml第24

17、页，本讲稿共61页 这种固定液适用于所有动物材料和部分植物材料的固定。它穿透能力强，固定均匀，使组织的收缩小。小块的材料固定1几小时，大多数的材料需要固定1224小时。固定后的样品可直接放入70的酒精中洗涤并脱苦味酸的黄色。本固定液一定使用新鲜的，要求在用前现配。D D、Zenker Zenker，s(s(任克氏任克氏)固定液固定液 重铬酸钾 2.5g 升汞 5.0g 硫酸钠 1.0g 醋酸 5ml 蒸馏水 100ml 第25页，本讲稿共61页 配制时应先将升汞溶解于加热的蒸馏水中，然后再加入重铬酸钾和硫酸钠溶解，使用前再加入醋酸。本固定液是动物各种组织的优良固定液。E E、Nawashin

18、Nawashin，s s（纳瓦兴氏）固定液（纳瓦兴氏）固定液 1的铬酸水溶液 100ml 福尔马林 40ml 冰醋酸 10ml 该固定液可用于植物组织，如对植物根尖、花粉母细胞、染色体、组织的分裂细胞和卵细胞都有良好的固定效果。固定时间为1224小时，固定后的样品要用流水冲洗。第26页，本讲稿共61页 4 4、固定的方法、固定的方法 对不同的样品要用不同的固定液进行固定，当组织放入固定液中如果漂在上面（如植物叶片、茎等组织），应采用抽气的办法使组织沉于液体底部。在多数情况下，动物组织的固定要比植物组织的时间短一些，不同的材料，不同的固定液，所需的固定时间差别很大，固定时间短的需要几分钟，而长的

19、则需要1224小时。在固定时所使用固定液的量一定要充足，一般应掌握在所固定组织体积的1020倍。第27页，本讲稿共61页 5 5、固定的注意事项：、固定的注意事项：（1）、所用固定液一定要新鲜，保存时要放在40C环境中，不能见强光。（2）、有些混合固定液，某些组分需要在使用前才能加入，否则会发生不良反应，对这类固定液一定按要求配制和使用。（3）、所用固定液的量一定要充足，否则会使组织得不到充分固定，必要时中间应换几次新固定液。（4）、在样品的固定过程中，容器的盖一定盖紧，并在容器外面贴好标记，以免混杂。第28页，本讲稿共61页 三、清洗三、清洗 动、植物样品经过固定之后，当从固定液中取出，组织

20、的内、外存有多余的固定剂，必须进行彻底清洗，将残存在组织细胞内、外未起作用的固定液完全除去，才能进行以后的处理，否则有些固定剂会在组织内发生不良反应，产生沉淀或结晶，从而影响切片和染色。清洗时可按如下原则进行：清洗时可按如下原则进行：1、固定液是酒精、福尔马林或它们的混合液，一般不需清洗。若需清洗的应使用与固定液中浓度相近的酒精进行清洗。2、用含苦味酸的固定液固定的 材料，需用70的酒精清洗，并在 清洗时加几滴氨水加快脱去苦味酸 的黄色。3、用含汞的固定液固定的材料，应根据所用溶剂的性质，用流水或第29页，本讲稿共61页 酒精清洗，但在脱水至70酒精时需加碘酒脱汞。4、用含锇固定液或锇酸固定的

21、材料一定要用流水冲洗。在清洗时如果用酒精作为清洗液，要采用换洗法，即每隔一定时间换一次新液。如果用流水清洗，应将盛样的容器口用砂布扎紧，然后放在一个水槽中开水龙头流水冲洗法，这样可防止样品被水冲走，造成丢失。流水冲洗时间应等于或大于固定时间(清洗方法见上图)。四、四、脱水脱水 用脱水剂逐渐取代掉组织细胞内所有水分的过程叫脱水。1 1、脱水的目的及其脱水剂的种类、脱水的目的及其脱水剂的种类 （1 1）、脱脱水水的的目目的的：经过脱水剂的作用，将组织内的所有水分彻底去除干净，并使组织细胞变成适当的硬度，以便于以后对样品的处理。（2 2）、脱脱水水剂剂的的种种类类：脱水剂必须能与水以任何的比例混合，

22、常用的有两类。第30页，本讲稿共61页 非石蜡溶剂的脱水剂：非石蜡溶剂的脱水剂：这类脱水剂只能与水互溶，不能与包埋剂石蜡互溶。因此用这类脱水剂处理的样品，在透石蜡之前必须经过透明剂（二甲苯）的置换（透明）后，才能进行透蜡处理。这类脱水剂常见的有酒精和丙酮。脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：样品经过这类脱水剂处理后，不需要经过二甲苯的过渡，可直接进入样品的透蜡处理，因为这类脱水剂既可与脱水剂酒精互溶又能与包埋剂石蜡互溶,这类脱水剂常见的有正丁烷和二氧六环等。第31页，本讲稿共61页 2 2、脱水的方法及注意事项、脱水的方法及注意事项 1 1）、脱水的方法：）、脱水的方法：用脱水剂逐

23、渐取代组织中水分的过程叫脱水。常用的脱水剂有酒精和丙酮。最常用的是酒精。如果含水的样品直接进入高度酒精中，会造成组织收缩、变形、变硬和变脆，所以在脱水时一般采用逐渐脱水的方法。对大多数动、植物材料而言，可设如下浓度差进行脱水，50、70、80、90、100（两次）。在每一级中脱水的时间，视样品质地不同有较大差异，动物组织每一级脱水1020分钟；相同大小的植物组织脱水时间应增加12倍方可。第32页，本讲稿共61页 对一些含水量大，柔嫩的样品（如动物的胚胎）和要求精细的制片，脱水剂的浓度级差可适当增加，如从10、20、30、40、50 2 2）、脱水时的注意事项）、脱水时的注意事项 （1）、脱水应

24、在带盖的容器（如青霉素效瓶）中进行，要防止空气中的水分进入脱水剂。（2）、在更换脱水剂时，应防止样品在移动过程中受挤压和任何损伤。（3）、脱水到高浓度脱水剂，在更换液体时，应防止样品的自然干燥，因为脱水剂易挥发，会造成样品自然干燥。（4）、脱水一定要彻底，否则样品不易透明，最终造成透蜡不完全，切片失败。第33页，本讲稿共61页 至此请同学们注意：至此请同学们注意：如果制作的是植物样品的石蜡切片，因植物组织细胞与动物的有很大差别，它的组织内有木质纤维，细胞表面有细胞壁，细胞内有较大的液胞，这些特殊的结构不仅可阻止一些液体的浸透速度，而且经过脱水后很坚硬，如不对其进行软化，包埋的组织块其切削性能不

25、好，就不能切出理想的切片。因此，在制作纤维化程度较高的植物样品（如植物的幼茎、叶脉等）时，在固定洗涤结束后，一定要对其进行软化，其方法是用1020%的氢氟酸水溶液进行软化样品，软化的时间因样品的质地不同而异，对不同的样品需要进行试验摸索。一般情况下一些较幼嫩的植物茎，在15的氢氟酸水溶液中浸泡715天就可满足要求。另外，氢氟酸对金属和玻另外，氢氟酸对金属和玻璃容器有很强的腐蚀作用，在配制和处理样品时使用的容器一璃容器有很强的腐蚀作用，在配制和处理样品时使用的容器一定要用塑料的。定要用塑料的。第34页，本讲稿共61页 五、透明五、透明 1 1、透明的目的、透明的目的 在石蜡切片制作过程中，透明是

26、一个非常关键而重要的步骤，整个制片过程中需进行两次透明，一次是在样品经过脱水之后，必须对样品进行透明（置换）处理，这样才能保证包埋剂石蜡浸透到组织细胞的各个部位；第二次透明是在切片经过染色、脱水之后，也要对染色后的切片进行透明（可增强染色后切片的透明度和不同结构对照明光线的折射能力），才能进行封片。第35页，本讲稿共61页 对组织和细胞的透明其目的是：因脱水剂大都用酒精，它是非石蜡溶剂的脱水剂，所以脱水后的样品必须经二甲苯透明后，才能使包埋剂石蜡渗入到组织细胞的各个部位，凝固后起到良好的支撑作用，使组织块有良好的切削性能，以便切出厚度合适而均匀的切片。对染色后的切片透明的目的是：通过透明改变细

27、胞切片中个组成部分对入射光的折射性能，使视野中所观察到的结构图像衬度好、清晰度高。第36页，本讲稿共61页 2 2、常用透明剂及其种类、常用透明剂及其种类 透明剂应该是石蜡的溶剂，大部分不能与水互溶。常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油、冬青油等。目前在石蜡切片的制备中最常用的是二甲苯，其它透明剂只是在特殊需要时才使用，二甲苯既可用于动物组织及其切片的透明，也可用于对植物组织和切片的透明。第37页，本讲稿共61页 3 3、透明的方法、透明的方法 动、植物组织的透明，一般用逐渐提高透明剂的浓度，最终换入纯透明剂进行透明的方法，基本操作是：3：1的无水酒精：二甲苯；2：1的无水酒精

28、：二甲苯；1：1的无水酒精：二甲苯；纯二甲苯二次。在各级中处理的时间动物与植物样品有较大的差异，一般是20分钟到1小时，最长不能超过3小时。同样大小的植物样品，在每级中透明的时间要延长。第38页，本讲稿共61页 4 4、透明应注意的问题、透明应注意的问题 （1）、透明过程中要及时盖好容器的盖子，防止空气中的水分进入透明剂。（2）、在更换每级液体时动作要快，这样既可防止样品的自然干燥，也可减少周围空气中水分的进入。（3）、如果加入透明剂，变成不透明的雾状，说明样品脱水不彻底，应退后到纯酒精中重新脱水，然后再进行透明处理。第39页，本讲稿共61页六、透蜡（浸透）六、透蜡（浸透）在石蜡切片中，组织细

29、胞内的每个空间都是以石蜡凝固后来支撑的，只有这样才能切出理想的切片。所以，当组织细胞经过脱水和透明之后，应当将组织浸泡在不断提高浓度的液态石蜡中，用纯石蜡将组织内外的透明剂逐渐取代掉，并占居每个空间，这一过程叫透蜡（浸透）。切片样品必须经过彻底的透蜡，才能保证样品在包埋后能切出较理想的切片。第40页，本讲稿共61页 石蜡是在进行石蜡切片时常用的包埋剂，对各种不同的样品在包埋时选择不同硬度的石蜡是十分重要的。1 1、包埋剂的种类及其选择原则、包埋剂的种类及其选择原则 包埋剂就是一种支持剂，经它浸透和包埋凝固变硬后，使组织具有一定的硬度，也使组织细胞与包埋剂形成一个完整的整体，以便于在切片机上切片

30、。根据不同的切片方法，常见的包埋剂有石蜡、火棉胶、碳蜡（水溶性）和明胶等。第41页，本讲稿共61页 石蜡：石蜡：它是从石油中提炼的，是在生物医学界制作动、植物切片最常用的包埋剂。根据熔点的不同，石蜡可分为软蜡和硬蜡两种类。软蜡的熔点低（熔点在42度54度范围），一般分为42度50度；45度52度或48度54度等等不同熔点的。硬蜡的熔点较软蜡高（熔点在54度60度范围内），一般分为54度58度；56度60度或54度60度等等不同熔点。其它几种包埋剂在此不作介绍了。第42页，本讲稿共61页 石蜡的选择原则如下：石蜡的选择原则如下：A、所选用石蜡的硬度要与样品的硬度相近，样品较硬时要选硬蜡，反之则选

31、软蜡。B、根据所需切片的厚度来选择石蜡，需要切片较厚时，要用硬蜡；而需要8微米以下的切片，要用软蜡。C、根据季节的不同（室内温度的不同）来选择石蜡，这是十分关键的原则。对相同质地的样品，在夏季（室温较高）制作切片时，要用熔点高的石蜡（硬蜡）；而在冬季制片时，要用软蜡。但是无论什么季节，如果选用的石蜡太硬，切片很容易碎，不易切成连续的蜡带；如果选用的石蜡太软，则切片很容产生皱缩，粘片展片时很难展平。第43页，本讲稿共61页 根据经验通常室温在1525度时，选用5254度的石蜡；冬季室内无恒温设备时，用4648度的石蜡；夏季室温较高时，选用5658度的石蜡较好。如果选用的石蜡硬度不合适，也可在切片

32、时进行补救，方法是加温或降温。2 2、透蜡的方法、透蜡的方法 样品经过透明处理后，对动物组织而言，可换入透明剂与石蜡等量混合液中30几小时，然后在恒温培养箱或熔蜡炉内顺次换入纯石蜡I、纯石蜡II中各2小时即可。第44页，本讲稿共61页第45页，本讲稿共61页 植物组织的透蜡要比动物组织复杂而且用时也长。要采用逐渐提高石蜡浓度和逐渐提高温度增加石蜡在透明剂中比例的方法进行透蜡，必要时先用软蜡透蜡，再用硬蜡透蜡。其方法是：（1）、在250C下逐渐向透明剂中加石蜡，使石蜡达饱和状态透蜡2小时以上。（2）、在350C下再加石蜡至饱和状态透蜡26小时。（3）、在450C下再加石蜡至饱和状态透蜡612小时

33、。（4）、用熔点为54560C的纯石蜡I、纯石蜡II、纯石蜡III各透蜡23小时。一些植物样品的透蜡有时还要抽真空，以加快透蜡的速度，也可延长透蜡的时间。第46页，本讲稿共61页 3 3、透蜡的注意事项、透蜡的注意事项 （1）、透纯石蜡时熔化的石蜡温度不能太高，一般高于所用石蜡熔点的230C即可，温度过高会对样品造成热损伤。（2）、对不同质地的样品和室内温度的不同，正确的选择所用石蜡的熔点，熔点越高石蜡的硬度就越大。（3）、应正确的掌握透蜡时间，既要透蜡完全，也应尽量缩短透蜡的时间。透蜡时间越长，组织的硬度和脆性就增大，所以，必要时可采取抽真空的方法进行透蜡（一些植物组织常采用抽真空法进行透蜡

34、）。第47页，本讲稿共61页 七、包埋七、包埋 包埋就是在一定的容器内用包埋剂（纯石包埋就是在一定的容器内用包埋剂（纯石蜡）对经彻底透蜡的组织、细胞进行包被，蜡）对经彻底透蜡的组织、细胞进行包被，使石蜡冷却固化后与组织形成一体的块状结使石蜡冷却固化后与组织形成一体的块状结构的过程。构的过程。1、包埋前的准备工作：、包埋前的准备工作：在透蜡时间即将结束时，必须做好包埋前的各项准备工作。首先应叠好包埋容器（纸盒），准备好酒精灯；眼科镊子和吸管要提前放到熔蜡的温箱内预热；准备一盆冷水，用来冷却石蜡。第48页，本讲稿共61页 包埋盒的折叠方法：包埋盒的折叠方法：（1）、折AA，和 BB，；（2）、折C

35、C，和DD，（3）、折CE，与AE，折痕相叠，向外夹出EE，。同样折出FF，、GG，和HH，；（4）、使E，CE与E，IE两三角形相叠，并沿E，C和EI重叠的折痕向后转折。用相同的方法折其余的三只角；（5）、折EIJF向外，同样折GKIH向外，即叠成所需要的包埋用纸盒了。第49页，本讲稿共61页 2 2、包埋的方法：、包埋的方法：整个包埋过程应在熔石蜡的温箱门前进行。因为温箱内熔化的纯石蜡只高于熔点的23度，从温箱内取出就会凝固。首先把包埋纸盒内加入少量熔化的石蜡，然后用温箱内预热的镊子从最后一级纯石蜡内夹取一块组织放到包埋盒内，并调整好样品的方向和位置，再用液体石蜡加满包埋纸盒；将镊子在酒精

36、灯上加热，伸入包埋盒内在样品的周围转几圈，主要是为了赶出样品周围的气泡。这时即可用双手持包埋盒的两耳放入冷水表面，等包埋盒内的石蜡凝固后再松开手，使石蜡达到完全凝固即可取出备用。第50页，本讲稿共61页3 3、包埋时的注意事项：、包埋时的注意事项：1）、所用石蜡一定要纯，如从外观看有颗粒状杂质时，需熔化过滤后再使用。2）、新石蜡要经过多次的熔化凝固再使用，这样可赶出石蜡中的气体和水分。3）、包埋的样品一定要在包埋盒的两耳上做好标记，避免样品的混淆。4）、包埋过程中不要将液体石蜡弄得到处都是，因为石蜡不好擦洗。5）、如果用电炉子熔化石腊，一定要有人看守，而且温度不能太高，否则会引起石蜡的燃烧发生

37、火灾。6）、包埋用的液体石蜡温度不能太高，一般高于熔点的23度，温度太高会损伤样品。第51页，本讲稿共61页 八、切片、贴片和片展 1、切片机：样品包埋结束就要进行切片，所使用的仪器叫切片机，进行石蜡切片的叫石蜡切片机（有的书上也叫手摇切片机或轮转式切片机）。石蜡切片机的基本结构是由 样品臂、样品推进器、切片厚度 调节器、切片刀座、手摇轮和切 片机底座构成的。2、切片刀：石蜡切片所使 用的刀是金属材质的，刀口十 分锋利，根据切片刀的形状可分 为平凹型、双凹型和平楔型三种 类型（分别见右图A、B、C）。第52页，本讲稿共61页第53页，本讲稿共61页 切片刀的长度根据用途不同而异，一般情况下石蜡

38、切片刀的长度是12cm；滑行切片机用得到最长是1420 cm；冷冻器片机的刀是8cm。切片刀不锋利时需要磨，磨刀有两种方法，一种是人工磨刀法；另一种是用磨刀机磨。人工磨刀法需要有一定的专业技术水平，否则会把 刀磨坏的。其技术要点是：其技术要点是：刀在磨石上的运行速度、方向和刀口接触磨石的均 匀度及压刀的用力（见右 图所示）。磨石根据使用 的研磨介质可分为两种，一种是以水作为研磨介质的 叫水磨石；另一种是用甘油 作研磨介质的叫油磨石。第54页，本讲稿共61页 切片刀的研磨很用时间，一把在显微镜低倍物镜下观察有锯齿缺刻的刀，一个技术熟练的人磨，上班时间就磨刀大约需要一周时间。所以切片倒要好好保存使

39、用，要由专人负责管理。机械磨刀是用磨刀机，将要磨的刀夹到夹持器上，加上研磨膏，打开磨刀机电源，设定好刀的运行速度以及刀翻转的时间后，让其自己磨就可以了，到了时间取下刀就可以使用了。3、切片的步骤和方法、切片的步骤和方法 1）、包埋块的修正：）、包埋块的修正：将包埋有样品的石蜡块用单面或双面刀片进行修整。以准备切片的面和准备向台木上沾的面作为两个对应平面，将四个侧面修成相互对称而平行的面，并将切片面样品前端的石蜡在不损伤样品的前提下尽量去干净，样品四周留12毫米的石蜡。2）、将修好的组织块固定到准备好的台木上：）、将修好的组织块固定到准备好的台木上：台木是一块1.52cm见方的结构致密的优质木材

40、做成的，第55页，本讲稿共61页 新做的台木要用液体石蜡浸泡24小时，使其浸满石蜡，这样修好的组织块沾上后才 牢固。台木也可用金属 的代替，有个别的石蜡 切片机上配备有，但它 不如木质的好用（见右 图）。向台木上沾修好的组 织块的方法是，将已经浸 石蜡的台木放在桌子上，左手持修好的组织块，使底面与台木的上表面平行并尽量接触台木，右手拿一单面刀片，在酒精灯上烧热，快速放入台木与蜡块接触的之间，这时左手下压蜡块，右手迅速拉出热刀片，蜡块就沾到了台木上，然后再取一些碎蜡放到台木和蜡块接触的周边，用热刀片使之熔化，起到加固作用。第56页，本讲稿共61页 3）、）、向切片机样品夹持器上安装固定好待切片的

41、样品向切片机样品夹持器上安装固定好待切片的样品 将沾有样片的台木安装到样品夹持器上，并用固定螺丝固定好。4）、）、把切片刀安装到刀座上把切片刀安装到刀座上 在装刀时一定注意，不能用任何硬物损伤刀口，同时也要防止伤了自己的手。5）、调节刀的角度）、调节刀的角度 刀的角度一般调至1015度，刀座上有刻度指示。6）、调节切片厚度）、调节切片厚度 根据切片厚度的要求不同，用切片机上的厚度调节器，选择所需的厚度即可。一般情况下厚度在23微米的叫薄切片；12微米以上的为厚切片；常选厚度是810微米，这一厚度动物和植物材料都适用。注意：注意：虽然在切片机上选择了厚度，切出的片子的厚度可能与选择的不同，这是正

42、常的，第57页，本讲稿共61页 因为切片厚度要受室内温度、包埋块的性质以及诸多因素的影响，这就需要根据经验采取一定的措施来补救。7）、切片）、切片 切片的要领是：右手以均匀的速度摇切片机的手抡，摇的速度既不能太快也不能太慢；左手持一新的毛笔托住切出的切片，使之成为切片连成的带；当切片带到一定的长度时，右手停止摇轮；把切片带放到瓷盘内的硬纸上，使近切片刀的一面接触纸（切记不能放反了）；切好的片子要防止污染。4、贴片与展片、贴片与展片 1）载玻片与盖玻片的准备：盖玻片要清洗干净烤干或擦干备用。2 2）、粘片剂：）、粘片剂：A、蛋白甘油粘片剂蛋白甘油粘片剂 新鲜鸡蛋清 50ml 甘油 50ml第58

43、页，本讲稿共61页第59页，本讲稿共61页 防腐剂（水杨酸钠或石炭酸）1g 配制方法：配制方法：将新鲜蛋清（不能混入蛋黄）放入小烧杯内，用玻璃棒打成雪花状泡沫，置片刻过滤到量筒内，再加入等量甘油混匀；然后加入防腐剂，盛于小瓶中封好口，40C保存可使用几个月至半年。B B、明胶粘片剂、明胶粘片剂 明胶1g 蒸馏水100ml 石炭酸（苯酚）2g 甘油15ml 配制时先将明胶溶解于300C的蒸馏水中，然后加入石炭酸和甘油混合均匀，趁热过滤后贮存于玻璃瓶中备用。第60页，本讲稿共61页 3 3）贴片与展片的方法：）贴片与展片的方法：取干净载玻片，在上面加一点粘片剂于其中间，并用小手指涂均匀；然后在上面滴加12滴蒸馏水，用单面刀片割取23片切片，将靠纸的一面（近刀刃面）向下放在水上；然后放展片台上，由于水受热而使切片展平。如果没有展片台，可把带有切片的载玻片在火焰上间断的加热，观察到切片在水面上展平为止。然后用吸水纸吸去多余水分，置防尘处干燥24小时以上。第61页，本讲稿共61页