免疫共沉淀技术精.ppt

《免疫共沉淀技术精.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫共沉淀技术精.ppt（16页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、免疫共沉淀技术第1页，本讲稿共16页定义及原理操作流程优点和不足注意事项应用及实例展望第2页，本讲稿共16页定义及原理u免疫共沉淀定义免疫共沉淀定义 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP)Co-Immunoprecipitation,CO-IP)也称免疫共吸也称免疫共吸附或免疫下拉技术，能够从细胞裂解物中特异性的分离并富附或免疫下拉技术，能够从细胞裂解物中特异性的分离并富集目标蛋白。集目标蛋白。CO-IP CO-IP是通过是通过抗原抗体之间的专一性抗原抗体之间的专一性作用为基础来研究作用为基础来研究蛋白质相蛋白质相互作用互作用的经典方法。也是确定两种

2、蛋白质在完整细胞内生理性相互作的经典方法。也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。用的有效方法。第3页，本讲稿共16页u基本原理基本原理 在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的偶联于加入与抗体特异结合的偶联于sepharose beads上的上的proteinA/G,与细胞中的抗体结合，形成一种复合物：与细胞中的抗体结合，形成一种复合物：目的蛋白目的蛋白/目的蛋白目的蛋白-抗目的蛋白抗体抗目的蛋白抗体-proteinA/G,经过经过变性凝胶电泳，复合物分开。变性凝胶电泳，复合物分开。最后通过免疫印迹或质谱检测

3、目的蛋白。最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。第4页，本讲稿共16页原原理理流流程程示示意意图图第5页，本讲稿共16页操作流程操作流程u免疫共沉淀实验流程免疫共沉淀实验流程(1)蛋白样品准备 （如果为细胞样品需先裂解）(2)抗原抗体结合反应(3)Protein A/G 与抗原抗体复合物结合 (4)免疫复合物与protein A/G 解离 （2%SDS煮沸处理）(5)分析鉴定 （Western Blot或质谱分析）第6页，本讲稿共16页u实验流程如图所示实验流程如图所示第7页，本讲稿共16页优点和不足优点和不足u优点优点1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物可以分离到天然状态的相互作用蛋白复

4、合物2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为影响。影响。u缺点和局限性缺点和局限性1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用不能够确定第三种蛋白的桥联作用第8页，本讲稿共16页应用及实例应用及实例应用领域：应用领域：免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用于免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和和MS质谱质谱分析鉴定准备样品。分析鉴定准备样品。应用范围应用范围:1.寻找新的相互作用蛋白寻

5、找新的相互作用蛋白2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用第9页，本讲稿共16页实例实例鼻咽癌细胞中鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白的相结合蛋白的分离和鉴定分离和鉴定P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症一半由于该基因突变失活基因是一种人体抑癌基因，人体癌症一半由于该基因突变失活1.抗抗P53抗体与抗体与HEN1和和HEN2细胞总蛋白进行免疫共沉淀。细胞总蛋白进行免疫共沉淀。2.SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物3.切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱分析，得到相应结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱分析，得到相应肽列标签肽列

6、标签4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究第10页，本讲稿共16页染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀 (CHIP)(CHIP)研究体内研究体内DNADNA蛋白质相互作用的重要工具。蛋白质相互作用的重要工具。它不它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA DNA 片段的结合片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。第11页，本讲稿共16页CHIPCHIP原理原理在活细胞状态下固定蛋白质在活细胞状态下固定蛋白质DNADNA复合物复合物将其随机切断为一定长度范围内的染色质小

7、片段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的目的蛋白结合的DNADNA片段片段对目的片断的纯化与检测对目的片断的纯化与检测第12页，本讲稿共16页操作步骤操作步骤一、固定一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。二、免疫沉淀二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。三、纯化与检测三、纯化与检测 经

8、蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.第13页，本讲稿共16页注意事项注意事项超声波破碎条件的选择抗体量的选择PCR反应条件的选择Input对照阳性对照：如组蛋白抗体阴性对照：阴性引物条件选择对照设置第14页，本讲稿共16页基因表达基因表达:反式因子和顺式作用元件之间反式因子和顺式作用元件之间相互作用。相互作用。真核生物的基因组真核生物的基因组DNADNA以染色质的形式存在。以染色质的形式存在。研究蛋白质与研究蛋白质与DNADNA在染色质环境下的相互作用在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。是阐明真核基因表达机制的基本途径。基因表达调控功能基因组学第15页，本讲稿共16页谢谢 谢谢！第16页，本讲稿共16页