油浸镜的使用和细菌形态结构的观察hlkl.docx

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1、实验一 油浸浸镜的使使用和细细菌形态态结构的的观察Use of oill immmerrsioon oobjeectiive andd obbserrvattionn off moorphhoioogy strructturees llf bbactteriia一、油浸浸镜的使使用方法法图1 油浸镜原理示意图观察细菌菌时，须须用放大大倍数最最大的物物镜，即即油浸镜镜（Oiil iimmeersiion objjecttivee，简称称油镜）。其其原理如如图一所所示，当当光线从从标本经经过空气气进入镜镜头时，由由于介质质密度不不同而发发生光的的折射（散散光现象象），光光线不能能完全进进入物镜镜中

2、，致致使物象象显现不不清。若若在油镜镜与载物物玻片中中间加入入和玻璃璃折射率率（n=1.552）相相仿的香香柏油（nn=1.5155），则则不使通通过的光光线有所所损失，视视野亮度度增强，获获得清晰晰物象。(一)油油浸镜的的使用方方法1、双手手托显微微镜，轻轻拿轻放放。2、放好好后，用用绸布擦擦试显微微镜，同同时检查查显微镜镜有无问问题，有有问题立立即向老老师报告告。3、用低低倍镜调调整光线线，看染染色标本本时，要要求视野野达到最最亮的程程度。将集光光器升到到最高位位置，与与载物台台相平。将虹彩彩完全开开放。天然光光线用平平面反射射镜，人人工光源源用凹反反射镜。使使视野达达到最亮亮的程度度。4

3、、在标标本上滴滴一滴香香柏油，不不要多加加。用眼眼睛从侧侧面观察察，小心心转动粗粗调节器器，使油油浸镜头头缓慢下下降，浸浸入油中中，到几几乎或轻轻轻与玻玻片接触触为止。不不能过急急过重，以以免碰坏坏镜片。5、一面面从目镜镜观察，一一面用粗粗调节器器慢慢上上升油浸浸镜头，当当见到模模糊的物物象时，立立即停止止。再用用细调节节器调到到物像清清晰为止止。然后后，一边边移动片片子，一一边观察察，寻找找理想的的视野，仔仔细观察察。6、看完完后，先先将油浸浸镜头上上提，然然后取下下标本片片，再用用擦镜纸纸拭去镜镜头上的的香柏油油。必要要时，用用擦镜纸纸蘸少许许二甲苯苯擦拭镜镜头，然然后再用用另一小小块擦镜

4、镜纸拭去去二甲苯苯。7、最后后，降下下集光器器，竖起起反射镜镜，下降降镜筒使使物镜成成八字形形抵于载载物台绸绸布上，双双手托持持显微镜镜，放入入显微镜镜箱中。(二)注注意事项项1、不得得在直射射阳光下下操作显显微镜，以以免强光光损坏镜镜片。2、显微微镜的细细调节器器是精密密而脆弱弱的机件件，只能能做有限限的旋转转，因此此，不得得向一个个方向连连续旋转转数周。当当旋转时时感到有有阻力，则则表明已已达极限限，不能能再继续续向上方方旋转，必必须立即即退回，轻轻拿轻放放，防止止细调节节器因震震动而损损坏。3、显微微镜必须须保存于于干燥、无无尘的方方，以防防镜片发发霉损坏坏。二、细菌菌的基本本形态、特特

5、殊构造造的观察察细菌的基基本形态态（球菌菌、杆菌菌、螺形形菌）和和细菌的的特殊构构造（荚荚膜、鞭鞭毛与芽芽胞等）都都可以在在染色之之后，用用油浸镜镜观察(一)细细菌的基基本形态态观察注意观察察细菌的的形态、大大小、排排列和染染色性。1、球菌菌和杆菌菌（葡萄萄球菌和和大肠杆杆菌）革兰氏染染色标本本，葡萄萄球菌染染成紫色色，大肠肠杆菌染染成红色色。2、弧菌菌（霍乱乱弧菌）革兰氏染染色标本本，霍乱乱弧菌染染成红色色。(二)细细菌的特特殊构造造观察1、荚膜膜（肺炎炎球菌）Hisss氏荚膜膜染色法法，菌体体染成紫紫色，荚荚膜染成成淡紫色色或无色色。2、鞭毛毛（变形形杆菌）户田氏鞭鞭毛染色色法，菌菌体和鞭

6、鞭毛均染染成红色色。3、芽胞胞（破伤伤风杆菌菌）Moelllerr氏芽胞胞染色法法，菌体体染成兰兰色，芽芽胞染成成红色。三、细菌菌大小的的测定细菌及其其它一些些微生物物的大小小，通常常用测微微计来测测量，测测微计分分接目测测微计与与镜台测测微计二二种，接接目镜刻刻度是相相对的，在在同一接接目镜下下，它是是随着不不同放大大率的接接物镜而而改变相相对比例例，而镜镜台测微微计上所所刻的长长度是绝绝对的用用来校正正接目测测微计每每格所代代表的大大小。材料：光学显微微镜、接接目测微微计、镜镜台测微微计。方法：1、将接接目测微微计装入入接目镜镜内的横横隔上，刻刻度向下下，置镜镜台测微微计于镜镜台上。2、在

7、接接目镜下下寻镜台台测微计计的刻度度（这时时光圈宜宜小，因因光线暗暗才能使使刻度更更为清楚楚。需要要用那一一放大率率的接物物镜观察察标本，则则在校正正接目测测微计时时就用那那一个接接物镜头头。3、移动动镜台测测微计和和转动接接目测微微计使二二者刻度度平行，并并使二者者的起始始线相重重迭，数数出二条条重迭线线之间在在两个测测微计上上的格数数即可求求出接目目测微计计每格的的长度。接接目测微微计与镜镜台测微微计二个个重迭点点间的距距离越长长，则所所得的数数字越精精确。4、接目目测微计计每格长长度的计计算：镜台测微微度总长长度为11毫米，其其上刻有有10大大格，每每格划有有10小小格，所所以每小小格=

8、11/1000=110m（因因为1mmm=110000m）。例：今测测得高倍倍显微镜镜（油镜镜）的接接目测微微计500格相当当于镜台台测微计计7格，则则接目测测微计每每格长度度为：5、校正正后移去去镜台测测微计，将将细菌玻玻片标本本置于镜镜台上，找找到目的的物后，移移动接目目测微计计（或移移动标本本），测测定细菌菌长与宽宽各占儿儿格，求求得其大大小。细菌的大大小=测测得之格格数接目测测微计每每格长度度。6、实验验完毕后后，取出出接目测测微计，其其中如有有油腻或或手印，则则用擦镜镜纸拭净净。-133- 实验二 常用用培养基基的制备备和常用用热力灭灭菌器及及使用方方法Prepparaatioon

9、oof ccommmon cullturre mmediium andd stteriizattionn meethoods by heaat一、常用用培养基基的制备备培养基是是用人方方法将多多种营养养物质按按微生物物生长需需要配成成的一种种营养基基质。常常用的培培养基有有基础培培养基、营营养培养养基、选选择培养养基、鉴鉴别培养养基、厌厌氧培养养基等。其其制备步步骤大致致是：按按一定配配方称取取各种物物质、溶溶解、修修正pHH，分装装在一定定的容器器内，灭灭菌。使使用前保保证无菌菌状态。常常用的培培养基有有下列几几种，简简介其制制备方法法和用途途。(一)肉肉汤培养养基材料：肉膏 00.5gg蛋

10、白胨 1.0gNacll 0.5g蒸馏水 1000mll方法：1、将上上述材料料混合，加加热溶解解，放凉凉。2、用精精密pHH试纸试试酸碱度度，用110碳碳酸钠（NNa2CO3-）或11N氢氧氧化钠（NNaOH）矫矫正pHH为7.2左右右。过碱碱时可用用10醋酸或或1N盐盐酸矫正正。必要要时可用用比色箱箱或酸度度计更准准确地测测定酸碱碱度。3、分装装于试管管中或放放三角烧烧瓶中，用用15磅磅高压蒸蒸气灭菌菌20-30分分钟。待待用。用途：主主要用于于增菌和和观察细细菌在液液体培养养基中的的生长状状态（沉沉淀生长长、混浊浊生长和和表面生生长）。(二)营营养琼脂脂培养基基材料：合合成营养养琼脂 4

11、.8g（视视制剂说说明） 蒸蒸馏水 1000mll方法：混混合，加加热溶解解，勿需需调pHH。分装装于试管管和三角角烧瓶中中，一并并高压灭灭菌。灭灭菌后，将将试管倾倾斜放置置，冷却却后则成成斜面培培养基；三角烧烧瓶中的的培养基基趁热倒倒入灭菌菌平皿中中，冷却却后即成成琼脂平平板。用途：琼琼脂平板板用于分分离细菌菌等；琼琼脂斜面面用于细细菌纯培培养和菌菌种保存存等。(三)血血液琼脂脂培养基基材料：营营养琼脂脂培养基基 1000ml 脱脱纤维的的新鲜羊羊血或兔兔血 55-100ml方法：将将营养琼琼脂加热热溶化（或或高压灭灭菌后），待待冷即到到50左右时时，无菌菌操作将将羊血或或兔血加加入后混混匀

12、，分分别注于于无菌平平皿或试试管中，制制成血平平板或血血斜面。用途：供供培养要要求较高高的细菌菌。(四)半半固体培培养基材料：合合成半固固体培养养基 1.00g（视视说明） 蒸蒸馏水 1100mml方法：混混合，加加热煮沸沸溶解，分分装于小小试管中中，高压压灭菌后后，直立立，使之之凝固成成高层。用途：供供测定细细菌的动动力和保保存菌种种。(五)蛋蛋白胨水水培养基基材料：蛋蛋白胨 11.0gg NNacll 00.5gg 蒸蒸馏水 1100mml方法：1、按量量称取后后混合加加热溶解解。2、矫正正pH为为7.22-7.6。3、分装装后高压压灭菌。用途：蛋蛋白胨水水中不含含糖类，常常用于制制备糖发

13、发酵培养养或用检检查细菌菌的靛基基质反应应等。二、常用用热力灭灭菌器及及其使用用方法（示示教）高温能使使微生物物蛋白质质凝固变变性，故故高温能能杀灭所所有的病病原微生生物。在在医学实实践中常常用下述述热力灭灭菌。(一)干干烤箱（干干热灭菌菌器）干烤箱是是用两层层金属板板制成的的箱子，中中间充以以石绵，箱箱底有热热源（电电炉），并并附有温温度计和和自动调调节器。灭灭菌时，打打开通气气口，加加热到880时，关关闭通气气口，加加热到1160-1700时，保保持两小小时，即即可灭菌菌。最高高温度不不得超过过1800，超过过1800则棉塞塞和包装装纸会被被烤焦。灭灭菌后，待待温度下下降到440以下，再再

14、开箱取取物，防防止玻璃璃器材因因骤冷而而破裂。耐高热和和干烤的的玻璃器器材、磁磁器等常常用此法法灭菌。如如培养细细菌用的的试管平平皿、吸吸管等，经经清洗和和晾干之之后，进进行干热热灭菌。为为了使灭灭菌后的的器材保保持无菌菌状态，烧烧瓶和试试管要塞塞上棉塞塞，平皿皿和吸管管要放入入特制的的筒内或或用纸包包好再行行灭菌。(二)流流通蒸汽汽消毒器器实验室常常用的流流通蒸汽汽消毒器器，其原原理和一一般的蒸蒸锅相同同。消毒毒时，用用流通蒸蒸汽（1100）蒸330分钟钟，可消消毒用过过的细菌菌培养物物和病人人的衣物物等。110030分分钟，不不能灭尽尽芽胞，达达不到灭灭菌的要要求。一一些不耐耐高热的的含糖

15、或或牛奶培培养基，可可用流通通蒸汽消消毒器进进行间歇歇灭菌，即即每天110030分分钟，连连续进行行三天；不加热热时，把把培养基基放在室室温中，使使其中的的芽胞发发育成繁繁殖体，于于次日加加热时将将其杀死死。(三)高高压蒸汽汽灭菌器器高压蒸汽汽灭菌器器是一个个能密闭闭的耐高高压的金金属圆简简，附有有加水、贮贮水、排排水、加加热、排排汽活门门、安全全活门和和压力计计等装置置。小型型的手提提式高压压蒸汽灭灭菌器，结结构简单单，使用用方便。高压蒸汽汽灭菌器器的使用用方法如如下：1、先向向筒内注注水，然然后把要要灭菌的的物品装装入内筒筒，再把把盖拧紧紧，打开开排气活活门，开开始加热热。2、水沸沸腾后，

16、排排气活门门开始排排出气体体，待筒筒内冷空空气全部部排出后后，关闭闭排气活活门。此此时筒内内压力逐逐渐上升升。3、待筒筒内压力力达到所所需磅或或公斤数数时，调调节热源源，维持持一定时时间，一一般是115磅（温温度为1121.3）200-300分钟，即即可达到到灭菌的的目的。4、达到到灭菌所所需时间间后，关关闭热源源，自然然放凉，待待压力表表指针下下降到“0”时，方方可开盖盖取物。使用高压压灭火器器灭菌，是是最有效效而又迅迅速的方方法。凡凡不怕高高热的普普通培养养基、药药品、手手术器械械、外科科敷料等等，均可可用此法法灭菌。为为保证灭灭菌效果果和安全全。器内内要加入入足量的的水，装装入的物物品不

17、要要过挤，冷冷空气必必须排尽尽，注意意压力表表的工作作情况，防防止因压压力表失失灵而造造成事故故。实验三 细细菌的培培养法和和细菌的的分布Bactteriial cuultuure annd Baccterriall ddisttribbutiion一、细菌菌的培养养法根据培养养基的物物理性状状（液体体、固体体、半固固体）的的不同，培培养方法法也不同同。常用用的培养养方法有有：平板板培养法法、斜面面培养法法、高层层培养法法和液体体培养法法。材料：琼脂平板板、琼脂脂斜面、半半固体高高层和肉肉汤培养养基，大大肠杆菌菌、枯草草杆菌的的培养物物等。方法：1、平板板培养法法（分离离培养法法）：临临床上常

18、常用的检检验标本本，如粪粪、痰、脓脓汁等中中常混有有多种菌菌。欲从从病人标标本中检检出某种种病原菌菌时，必必须先将将各种菌菌分开，获获得纯菌菌，然后后再做进进一步鉴鉴定，这这样才达达到目的的。琼脂脂平板面面积大，通通过一定定的方法法进行培培养，则则可达到到分离各各种细菌菌目的。平平板培养养法种类类很多，现现将三段段划线法法介绍如如下：将接种种环火焰焰灭菌后后，取检检查材料料，反复复涂于平平板上端端。将接种种环火焰焰灭菌后后，把涂涂于平板板上端的的材料，划划线于“1”区。将接种种环火焰焰灭菌后后，把“1”区部分分材料划划线于“2”区。将接种种环火焰焰灭菌后后，把“2”区部分分材料划划线于“3”区

19、。划线完完了后，盖盖好平板板，灭菌菌接种环环。于盛琼琼脂的底底面玻璃璃上注明明日期和和姓名，放放37培养118-224小时时。2、斜面面培养法法：斜面面培养基基不易污污染，常常用于培培养纯种种细菌（纯纯培养）。先将接接种环灭灭菌，然然后挑取取平板上上弧立菌菌落上的的细菌。拔去斜斜面培养养基的棉棉塞，试试管口经经火焰灭灭菌，将将沾有细细菌的接接种环伸伸入管内内，自下下而上划划一直线线，然后后将接种种环再自自下而上上，连续续平行划划线。接种后后，管口口在火焰焰上灭菌菌，塞好好棉塞。灭菌接接种。在在试管上上写好菌菌名，日日期。37培养118-224小时时。3、液体体培养法法：用于于增菌，并并可观察察

20、细菌的的生长状状态和检检查生化化反应。用灭菌菌接种环环取少许许纯菌。按无菌菌操作要要求，将将沾有细细菌的接接种环伸伸入液体体培养管管中，在在稍高于于液面的的管壁上上，轻轻轻研磨，使使细菌落落入液体体培养基基中。接种后后，管口口在火焰焰上灭菌菌，塞好好棉塞。灭菌接接种环，在在试管上上做好标标记。37培养118-224小时时。4、半固固体培养养法（穿穿刺培养养法）：常用以以检查细细菌运动动或检查查细菌发发酵能力力。用灭菌菌接种环环（白金金针）取取少许纯纯菌。按无菌菌操作要要求，将将沾有细细菌的接接种针，从从半固体体培养基基的正中中刺向管管底，但但不到底底，留有0.5厘米米左右。然然后，按按原线抽抽

21、出。同同上。二、细菌菌的分布布细菌种类类繁多，繁繁殖迅速速，分布布广泛。不不论空气气、土壤壤、水、食食物、各各种物体体和器械械的表面面，以及及动物和和人体与与外界相相通的腔腔道中都都有细菌菌存在。因因此，了了解细菌菌在自然然界及正正常人体体中的分分布，对对于在医医疗实践践与某些些科学实实验中树树立无菌菌观念有有着重要要的意义义。(一)空空气细菌菌的检查查材料：普普通琼脂脂平板。方法：将将普通琼琼脂平板板置于室室内不同同地方，打打开盖子子，暴露露于空气气中5-10分分钟，盖盖好，放放37温箱，培培养244小时。结果：观观察平板板上菌落落的数目目。(二)土土壤中细细菌的检检查材料：地地表土壤壤，肉

22、汤汤培养基基。方法：取取少量土土壤放入入肉汤培培养基内内，377培养224小时时。结果：观观察细菌菌生长状状况。(三)手手指等的的细菌检检查材料：普普通琼脂脂平板。方法：将将手指、钱钱币、衣衣物等直直接涂于于琼脂平平板上，注注意勿将将琼脂表表面弄破破，377培养224小时时。结果：观观察平板板上细菌菌生长的的情况。(四)口口腔中细细菌的检检查材料：血血液琼脂脂平板。方法：将将平皿盖盖打开，向向血液琼琼脂表面面连续咳咳嗽二、三三次，盖盖好后，337培养224小时时。结果：观观察平板板上细菌菌生长的的情况。实验四 细细菌生长长状态及及运动观观察Obseervaatioon of baacteeri

23、aal groowinng staate andd mmotiilitty一、细细菌生长长状态观观察细菌不同同，在培培养基上上的生长长状态也也不相同同。通过过观察细细菌生长长状态，有有助于鉴鉴定细菌菌。(一)琼琼脂平板板上菌落落观察一个细菌菌在固体体培养基基上，经经过一定定时间的的生长繁繁殖之后后，所形形成的肉肉眼可见见的细菌菌集团，称称为菌落落。很多多菌落连连在一起起，融成成一片，称称为菌苔苔。由于于细菌种种类不同同，以及及培养基基的成分分不同，形形成的菌菌落特点点也不同同，可呈呈现一定定的形态态、色泽泽等，有有助于鉴鉴别细菌菌。因此此，应当当对菌落落进行认认真观察察。其观观察要点点如下：1

24、、大小小：以直直径（毫毫米）表表示之，11毫米左左右为小小菌落，22-3毫毫米为中中等大落落，3毫毫米以上上为大菌菌落。2、形状状：圆形形、卵园园形及不不规则形形。3、边缘缘：整齐齐或不整整齐、锯锯齿状、毛毛发状等等。4、表面面：光滑滑、湿润润皱纹、干干燥等。5、隆起起度：扁扁平、凸凸起、中中心凹陷陷等。6、透明明度：透透明、半半透明、不不透明。7、颜色色：无色色、白色色、黄色色等。8、溶血血性：在在血平板板上产生生溶血毒毒素的细细菌，可可以使培培养基中中的红细细胞破坏坏溶解。可可分为完完全溶血血，草绿绿色溶血血及不溶溶血。根据菌落落的特点点，可分分为光滑滑型（SS型）菌菌落和粗粗糙型（RR型

25、）菌菌落。SS型菌落落为圆形形、边缘缘整齐、表表面光滑滑、湿润润。R型型菌落与与之相反反。(二)斜斜面上生生长状态态观察：可见有有均匀一一致的菌菌苔，如如有不同同的菌落落出现，则则表明污污染了杂杂菌。(三)液液体培养养基中生生长状态态观察：未培养养前的液液体培养养基多为为清澈透透明的。接接种细菌菌培养后后，由于于细菌种种类不同同，可有有以下三三种生长长形式：1、混浊浊：液体体变为混混浊。2、菌膜膜：液体体澄清，表表面有一一薄膜。3、沉淀淀：管底底有沉淀淀物。(四)半半固体中中生长状状态观察察：无鞭鞭毛（无无运动）的的细菌，以以培养后后仅沿穿穿刺线生生长，培培养基清清亮。有有运动的的细菌，沿沿穿

26、刺线线向外扩扩散，穿穿刺线模模糊不清清，培养养基混浊浊。二、细菌菌运动观观察应用不染染色标本本可观察察活细菌菌的运动动和状态态，且能能避免由由于某些些染色操操作而引引起的细细菌变形形。常用用的不染染色标本本的制备备方法有有悬滴法法、压滴滴法及暗暗视野显显微镜检检查法等等。材料：枯草杆菌菌和葡萄萄球菌混混合菌液液、盖玻玻片、凹凹玻片、凡凡士林油油及暗视视野显微微镜。方法：取清洁的的凹玻片片和盖玻玻片各一一张。涂涂少许凡凡士林于于凹玻片片窝的周周围；取取一接种种环菌液液滴 于盖玻片片之中央央；将盖盖玻片迅迅速翻转转，盖于于凹窝上上。轻压压盖片，使使其固定定并密封封，防止止菌液变变干，便便于长时时间

27、观察察。镜检方法法：将集集光器稍稍降下，使使视野内内光线变变暗。用用低倍镜镜检出悬悬滴边缘缘，然后后换高倍倍镜或油油镜观察察细菌的的形态和和运动。枯草杆菌菌有鞭毛毛能运动动，它们们在运动动时各向向不同方方向进行行，速度度较快，相相互间的的位移很很大，称称之为真真性运动动或固定定运动。葡葡萄球菌菌没有鞭鞭毛不能能运动，但但由于受受水分子子的撞击击而呈分分子运动动（布朗朗氏运动动），只只在原地地颤动，位位移不大大。(二)压压滴法取混合菌菌液1-2滴，放放于载物物玻片中中央，小小心地把把盖玻片片放入液液滴之上上。镜检检方法与与悬滴方方法相同同。压滴滴法比悬悬滴简单单，但标标本容易易干涸，不不能作长长

28、时间观观察。(三)暗暗视野显显微镜检检查法镜检方法法将混合合菌液直直接滴于于载物玻玻片上，加加盖玻片片，做成成压滴标标本。在标本本未放载载物台上上之前，调调节光源源光镜，此此时在暗暗视野集集光器的的面上可可以看到到一个光光圈，用用低倍接接物镜来来观察光光圈并转转动集光光器上的的螺旋，使使光圈位位于视野野正中，在在集光器器上加镜镜油一滴滴。降低集集光器，放放标本于于载物台台上，徐徐徐升高高集光器器，使油油滴与玻玻片接触触，但避避免油滴滴中有气气泡产生生。用低倍倍接物镜镜观察标标本。这这时可以以看到一一个光点点，升降降集光器器使光点点集中而而且光度度强烈，并并使光点点位于视视野正中中。在标本本的盖

29、玻玻片上加加镜油，改改用油浸浸镜观察察。此时时应放开开接物镜镜上的虹虹彩，转转动镜筒筒的调节节螺旋，待待初步看看到物像像的轮廓廓以后，再再慢慢缩缩小接物物镜上的的虹彩，直直至视野野完全无无光，而而被检微微生物清清晰可见见。 图2 抛物面型暗视野集光器1、光束 2、遮光板 3、标本 4、射入镜筒光线 注检查牙垢垢时可先先在载物物玻片上上置生理理盐水一滴，加加入牙垢垢少许，盖盖盖玻片片，做成成压滴标本进进行暗视视野检查查。【原理】由于活的的细菌、螺螺旋体等等体积微微小而且且半透明，在普普通显微微镜下不不易看清清楚，如如果用暗暗视野显微镜，即即在普通通光学显显微镜上上安装一一个特制制的集光器一一暗视

30、野野集光器器（图22），其其中央为为不透明明的黑板所所遮，光光线不能能直接通通向镜筒筒，仅可可从其四周边缘缘斜射到到载玻片片标本上上。因光光线不直直接上升，所以以视野背背景是暗暗的。从从集光器器斜射到到细菌等微粒上上的光线线，由于于散射作作用而发发出亮光光，反射到接物物镜内。故故在强光光照射下下，可以以在黑色色的视野中看看到发亮亮的菌体体。犹如如黑夜的的天空，闪闪烁着点点点星光光；也正正象我们们在暗室室内，能能看见从从隙缝漏漏入的阳阳光内，有有千万颗颗尘埃微微粒跳跃跃飞舞其其中一样样。实验五 革兰氏氏染色法法Gramms staain一、革兰兰氏染色色法革兰氏染染色法是是最常用用的细菌菌鉴别染

31、染色法。要要求同学学必须掌掌握此项项基本技技术操作作，并理理解革兰兰氏染色色法在鉴鉴别细菌菌上的重重要意义义。18844年由GGramm氏建立立，因之之得名。关关于其原原理还不不完全清清楚，曾曾有几种种不同的的解释：1、革兰兰氏阳性性菌细胞胞壁结构构比较致致密，肽肽聚糖层层很厚，脂脂类含量量低，酒酒精不易易透入。阴阴性菌的的细胞壁壁较为疏疏松，肽肽聚糖很很薄、外外膜、脂脂蛋白、脂脂多糖均均含有大大量脂质质，易被被酒精溶溶解，致致使细胞胞壁通透透性增高高，细胞胞内的结结晶紫一一碘复合合物被酒酒精溶解解提出而而致脱色色。2、革兰兰氏阳性性菌含有有多量核核糖核酸酸镁盐，可可与结晶晶紫和碘碘结合成成大

32、分子子复合物物，不易易脱出。而而阴性菌菌中此物物质含量量甚少，故故易于脱脱色。3、革兰兰氏阳性性菌等电电点（ppH2-3）比比革兰氏氏阴性菌菌（pHH4-55）为低低，在同同样pHH的染色色环境中中，阳性性菌所带带的阴电电荷比阴阴性菌多多，故与与带阳电电荷的结结晶紫染染料结合合较为牢牢固，不不易脱色色。目前前认为，在在以上各各因素中中，细胞胞壁结构构上的差差异是最最重要的的因素。材料：葡萄球菌菌与大肠肠杆菌的的混合菌菌液。革兰氏染染色液，载载物玻片片等。方法：1、涂片片：先将将接种环环（白金金耳）用用火焰灭灭菌，用用灭菌的的接种环环取菌液液一滴，在在载物玻玻片上涂涂一个薄薄而均匀匀的涂膜膜，直

33、径径约为11厘米。如如用纯培培养菌做做涂片时时，应先先取一滴滴生理盐盐水放于于载物玻玻片上，再再取少量量纯菌，混混于盐水水中，然然后再涂涂片。2、干燥燥：放空空气中自自然干燥燥，或于于火焰上上部略加加烘烤，使使液体干干燥。3、固定定：将玻玻片从火火焰中央央部，反反复通过过三次。使使涂片中中细菌，固固着于载载物玻片片上，并并杀死大大部分细细菌。4、取结结晶紫液液滴于涂涂膜上，染染1分钟钟，水洗洗。5、用芦芦戈碘媒媒染1分分钟，水水洗。6、用00.4石碳酸酸复红液液脱色复复染半分分钟，水水洗。7、印干干后，用用油镜观观察。结果：经经革兰氏氏染色后后，凡染染成紫色色的的细细菌称之之为革兰兰氏阳性性菌

34、；凡凡染成红红色的细细菌称之之为革兰兰氏阴性性菌。表1 常见见的革兰兰氏阳性性和革兰兰氏阴性性菌染色性微生物革兰氏阳阳性菌（GG+）革兰氏阴阴性菌（GG-）球 菌葡萄球菌菌、链球球菌、肺肺炎球菌菌等。奈瑟氏菌菌属（脑脑膜炎球球菌、淋淋球菌等等）。杆 菌能形成芽芽胞的杆杆菌（炭炭疽杆菌菌、破伤伤风杆菌菌、肉毒毒杆菌、气气性坏疽疽病原菌菌等）、白白喉杆菌菌、抗酸酸性菌（结结核杆菌菌）。绝大多数数杆菌（肠肠道杆菌菌、布氏氏杆菌、鼠鼠疫杆菌菌、百日日咳杆菌菌等）、弧弧菌。其它微生生物真菌螺旋体、立立克次氏氏体、支支原体。附：常用用细菌染染色液的的配制(一) 染料酒酒精饱和和液（原原液）的的制备：由于染

35、染料的纯纯度不同同，用量量可有不不同。1、美兰兰酒精饱饱和液：美兰5-7克+95酒精1100毫毫升2、碱性性复红酒酒精饱和和液：碱性复红红10克克+955酒精精1000毫升3、结晶晶紫酒精精饱和液液结晶紫55克+995酒酒精1000毫升升(二) 碱性美美兰液：单染色色和抗酸酸染色等等用。混合，滤过。美兰原液液 30毫毫升 0.011KOOH 1100毫毫升(三) 结晶紫紫液：革革兰氏染染色用。亦亦可用龙龙胆紫液液代替，配配法相同同。混合，滤过。结晶紫原原液 20毫毫升1草酸酸铵水溶溶液 800毫升(四) 芦戈氏氏碘液：革兰氏氏染色用用。先用几毫毫升蒸馏馏水将22克碘化化钾溶解解，再加加1克碘碘

36、，在碘碘溶解之之后，再再加蒸馏馏水，最最后总量量为3000毫升升。(五) 石炭酸酸复红液液，用于于抗染色色法和芽芽胞染色色法。混合，滤过。碱性复红红原液 10毫毫升5石炭炭酸水溶溶液 1100毫毫升(六)稀稀释石炭炭酸复红红液：革革兰氏染染色法及及单染色色用。将石炭酸酸复红液液用蒸馏馏水稀释释10倍倍即可。二、特殊殊构造染染色法细菌的特特殊构造造有荚膜膜（Caapsuule）芽芽胞（SSporre）、鞭鞭毛（FFlaggelllum），特特殊构造造用一般般染色法法不易着着色，必必须用特特殊的染染色法才才能着色色。某些些细菌的的特殊构构造的检检查，有有助于细细菌的鉴鉴别。(一) Hissscap

37、psulle sstaiin1、涂片片、干燥燥、固定定。2、结晶晶紫液加加温染色色1分钟钟，弃去去染色液液。3、用220硫硫酸铜水水溶液冲冲洗。4、印干干、镜检检。(二) Flaagelllumm sttainn（户田田法）1、将具具有鞭毛毛的细菌菌轻轻涂涂于完全全无脂的的玻片上上，自然然干燥。2、用户户田氏染染色液染染色0.5-55分钟，水水洗。3、印干干、镜检检。菌体和鞭鞭毛均染染成红色色。户田氏染染色液的的配制：甲液：明明矾饱和和水溶液液 22份混合5石炭炭酸水溶溶液 55份20鞣鞣酸水溶溶液 2份乙液：复复红原液液 11份甲液、乙乙液用前前混合，过过滤(三) Spoore staain

38、 1、涂片片、干燥燥、固定定。2、用55碳酸酸复红液液加温染染色5分分钟，水水洗。3、用995%酒酒精脱色色20秒秒，立即即水洗。4、用碱碱性美兰兰（吕氏氏美兰）溶溶液复染染1分钟钟，水洗洗。5、印干干、镜检检菌体染成成蓝色，芽芽胞染成成红色。实验六 细菌菌对药物物的敏感感性与耐耐药性试试验Senssitiivitty aand ressisttancce ttestt off baacteeriaa onn meediccinee一、细菌菌的药物物敏感性性试验（简简称药敏敏试验）细菌因其其种或株株的不同同，对药药物的敏敏感性也也不同。有有的在与与药物相相互作用用中还会会改变敏敏感性。因因此，

39、临临床上测测定病原原菌对药药物的敏敏感性，对对选用抗抗菌素、磺磺胺和中中草药治治疗细菌菌引起的的疾病、发发现耐药药菌和及及时控制制感染都都有重要要的意义义。药敏试验验有稀释释法与扩扩散法。最最常用的的有试管管稀释法法和纸片片扩散法法。(一) 试管稀稀释法材料：青霉素：用无菌菌蒸馏水水配制成成50单单位/毫毫升。菌液：金金黄色葡葡萄球菌菌6小时时肉汤培培养物，用用肉汤稀稀释十倍倍使其浓浓度约为为3亿菌菌体/毫毫升。肉汤培养养基。无菌小试试管，无无菌1毫毫升吸管管。方法：1、取无无菌小试试管155支排列列于试管管架上，第第1管内内加入肉肉汤1.8毫升升，第22-155管内各各加入肉肉汤1毫毫升。2

40、、第11管内加加入抗菌菌素（青青霉素）00.2毫毫升，混混匀后吸吸出1毫毫升加到到第2管管中。按按此法依依次作倍倍量稀释释直至第第14管管，吸出出1毫升升弃去；第155管不加加抗菌素素作为对对照。3、在上上述各试试管中，用用无菌吸吸管加入入葡萄球球菌稀释释液0.1毫升升。混匀匀后置337温箱内内，培养养18-24小小时观察察结果。结果：试管中肉肉汤呈均均匀混浊浊，表明明有菌生生长（即即与对照照管相同同）。如如肉汤澄澄清，则则细菌受受抑制，抑抑菌生长长之最低低抗菌素素浓度，即即细菌对对该抗菌菌素的敏敏感度，用用单位或或微克/毫升表表示之。(二)纸纸片法材料：从病人脓脓汁中分分离出并并鉴定为为金黄

41、色色葡萄球球菌。各种抗菌菌素滤纸纸片：市市售的抗抗菌素滤滤纸片（上上海第六六人民医医院检验验组制），每每枚滤纸纸片的含含药量为为：青霉霉素为11单位，其其它抗菌菌素为110微克克（g）磺磺胺为1100微微克（g）,痢特灵灵为5微微克（g）。普通琼脂脂平板，无无菌镊子子及接种种环等。方法:1、用灭灭菌的接接种环取取纯培养养的葡萄萄球菌少少许，经经反复划划线使之之均匀地地分布在在琼脂表表面。2、用灭灭菌的小小镊子，将将含药滤滤纸片于于平板的的表面，并并轻轻地地压紧。每每个平板板可贴44-5种种滤纸片片，其间间距为22-3厘厘米。3、置337温箱内内培养118-224小时时，观察察结果。结果：细菌如

42、对对抗菌素素敏感，则则在滤纸纸片的周周围出现现抑菌环环。测定定抑菌环环直径的的大小（毫毫米）即即可知其其敏感性性。本试验敏敏感度参参照下述述标准判判定：抑抑菌环直直径在115毫米米以上为为高度（或或极度）敏敏感；110-114毫米米为中度度敏感；10毫毫米以下下为低度度敏感；无抑菌菌环为不不敏感（耐耐药）。二、细菌菌R质粒粒接合转转移试验验在细菌的的变异中中，以药药物从敏敏感变成成耐药也也是经常常发生的的一种生生物学现现象。细细菌的耐耐药基因因位于染染色体上上或R质质粒。有有些耐药药的细菌菌，特别别是肠道道杆菌，带带有可传传递的耐耐药性质质粒（rresiistaanceeplaastiid ,

43、R质粒粒），这这种耐药药性质粒粒DNAA可经细细菌接合合，由供供体菌转转移给受受体菌，使使受体菌菌也获得得相应的的耐药性性。材料：图3 Cm+Rif伊红美兰平板接种菌示意图1、供体体菌为多多重耐药药的痢疾疾杆菌DD15株，SSmr、Cmmr、Tccr（耐链链霉素、氯氯霉素、四四环素）。2、受体体菌为大大肠杆菌菌K122W14665株，RRifrr（耐利利福平）。3、肉汤汤培养基基、伊红红美兰平平板（或或中国兰兰平板）、含含Cm220g/mml，RRif1100g/mml的伊伊红美兰兰平板（或或中国兰兰平板）。方法：1、细菌菌活化(1) 将供、受受体菌分分别接种种于伊红红美兰平平板上，337过夜

44、。(2) 分别将将两种菌菌转种于于1mll肉汤中中，377培养55-6小小时。2、接合合(1)吸吸取供、受受体菌液液各0.02mml于00.5mml肉汤汤中混匀匀，377水浴中中接合22小时。(2)在在含Cmm+Riif的伊伊红美兰兰平板上上按图33涂布接接合菌、受受体菌和和供体菌菌各0.05mml，置置37培养过过夜。结果：在Cm+Riff伊红美美兰（或或中国兰兰）平板板上，供供、受体体菌均不不生长，只只有接合合菌长出出较大、不不透明的的黑紫色色（或兰兰色）菌菌落。附：噬菌菌体的特特异性溶溶菌试验验噬菌体（bbactteriiophhagee）是细细菌的病病毒，它它可以使使相应的的细菌溶溶解，这这种溶解解作用具具有高度度特异性性，故可可用于细细菌的鉴鉴定和细细菌分型型。此外外，由于于噬菌体体可作为为一种DDNA片片断的载载体，把把某些基基因带到到宿主细细胞中去去与DNNA整合合，引起起后者发发生变异异，目前前噬菌体体已成为为研究分分子生物物学的一一种重要要工具。材料：痢疾杆菌菌培养物物与相应应的噬菌菌体，伤伤寒杆菌菌的噬菌菌体，营营养琼脂脂平板培培养基。方法：1、取一一接种环环痢疾杆杆菌致密密划线于于营养琼琼脂平板板上。2、用吸吸管滴加加痢疾杆杆菌的噬噬菌体一一滴，滴滴于平板板的一端端，倾斜斜平板，使使