家蚕关键品质性状分子解析及分子育种基础研究30594.docx

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1、项目名称：家蚕关键品质性性状分子解析析及分子育种种基础研究首席科学家：夏庆友 西南大大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：重庆市科委 教育部一、关键科学问问题及研究内内容1拟解决的关关键科学问题题 根据国家蚕丝产产业发展重大大需求和蚕业业科学发展长长远需要，以以“十一五”家蚕“973”项目研究为为基础，“十二五”期间紧紧围围绕家蚕关键键品质性状，重重点解决如下下两个关键科科学问题： 第一：家蚕关键键品质性状形形成的分子机机理 家蚕因食桑产丝丝，才可供人人类利用，其其关键品质性性状主要有三三：第一，丝丝蛋白合成与与分泌机制。丝丝蛋白的组成成和结构特征征，决定了蚕蚕丝关键品质质性状。研

2、究究表明，家蚕蚕丝的各种工工艺性状，包包括纤度（茧茧丝直径）、茧茧丝长度、净净度（茧丝表表面结构）、强强伸力、抱合合力以及解舒舒性能（丝胶胶溶解性）等等，均受丝腺腺合成与分泌泌机制所调控控；第二，发发育变态与调调控。家蚕是是典型的完全全变态昆虫，现现行蚕桑生产产体系，无不不是根据家蚕蚕生长与变态态发育特征来来安排。特别别重要的是，家家蚕生长与发发育特征（例例如个体大小小、蜕皮和化化蛹时期、成成虫孵化时期期）决定了蚕蚕丝蛋白合成成时期与合成成量，整体上上决定了家蚕蚕的蚕丝生产产特性；第三三，对疾病的的抵抗性。家家蚕经过数千千年人工驯化化，尽管获得得了适合群居居饲养和发育育整齐等有利利于生产的特特

3、性，同时也也有大规模易易受病原微生生物感染的不不利性状。尽尽管蚕桑生产产过程中的疾疾病防控受到到高度重视，但但每年蚕农因因蚕感病造成成的损失仍然然高达25，并且且高居不下。上上述三个生理理过程（或性性状），是家家蚕诸多影响响蚕丝产量和和品质中最为为关键且相互互联系的因素素，决定了蚕蚕丝生产的整整体水平与效效益，是本项项目将要解决决的第一关键键科学问题。 在前一个项目中中，家蚕性别别决定、丝蛋蛋白合成、发发育和免疫等等四大性状是是作为其中的的一个课题来来布局的，并并打开了关键键的突破口。本本期项目把性性别决定之外外的三个性状状上升为三个个课题，同时时布局家蚕干干细胞与不同同组织器官变变态发育过程

4、程中的分子基基础研究，因因为干细胞与与组织器官再再生与家蚕丝丝腺发育、变变态发育和免免疫防御有着着重要的密切切关系。根据据已有基础，家家蚕关键品质质性状形成分分子机理研究究的具体科学学问题分别如如下： 蚕丝蛋白合成机机理研究将着着重解决丝蛋蛋白基因的分分子调控问题题。家蚕幼虫虫期共食下鲜鲜桑叶约222g，丝腺合合成并分泌约约0.5g丝蛋蛋白。研究表表明，家蚕丝丝蛋白合成调调控有三大主主要特点，一一是蚕丝合成成高效性：家家蚕丝腺功能能高度特异化化，类似果蝇蝇唾液腺，而而丝蛋白质的的合成主要由由数目极其有有限（1400余个）的分分泌细胞完成成，这些细胞胞的细胞核内内染色体高度度多倍化，可可达到50

5、100万单单倍基因组。二二是部位特异异性：蚕丝由由家蚕体腔内内左右对称分分布的一对丝丝腺所合成，每每条丝腺分前前部、中部和和后部三个功功能区域，后后部和中部分分别特异合成成家蚕丝素蛋蛋白和丝胶蛋蛋白等茧丝纤纤维的主要结结构成分；这这种部位特异异性决定了蚕蚕丝各组分，尤尤其是有效组组分丝纤维的的所占比例和和加工特性。三三是时间特异异性：家蚕丝丝腺细胞分化化于胚胎发育育时期，尽管管早期幼虫的的蜕皮期能够够合成少量蚕蚕丝蛋白，但但大量合成丝丝蛋白并形成成丝纤维却是是在末龄幼虫虫第3天开始，具具有严格的时时间调控。因因此，阐明蚕蚕丝品质性状状机理，主要要的科学内涵涵是回答上述述三个特性的的分子调控机机

6、制。前期研研究表明，丝丝蛋白编码基基因的转录和和翻译机制是是决定丝蛋白白合成机制的的关键因素。通通过丝腺特异异基因的大规规模鉴定和功功能研究，初初步发现丝蛋蛋白编码基因因受两大信号号通路的调控控。一是激素素信号通路，主主要调控基因因转录的时间间特异性；二二是受发育主主控基因，即即高度保守的的同源异型盒盒（Homeeobox）类类转录调控因因子所调控，主主要决定丝蛋蛋白基因表达达的空间特异异性。为此，本本期项目将重重点研究fiib-H、fib-LL、P25和Ser13等主要丝蛋蛋白编码基因因受激素信号号和发育主控控基因的调节节机制，以期期系统阐明丝丝蛋白合成分分子机理及其其与蚕丝品质质之间的相互

7、互关系。 激素和营养信号号传导与变态态发育调控研研究着重解决决信号传导机机制。与其它它全变态昆虫虫一样，家蚕蚕的变态发育育主要受激素素（神经肽激激素、蜕皮激激素、保幼激激素和类胰岛岛素等）和营营养（氨基酸酸、糖和脂肪肪酸等）的协协同调控。目目前知道，当当家蚕从一个个龄期幼虫向向下一个龄期期幼虫转变时时，往往同时时有高水平的的蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）分泌，使得昆虫不会发育成蛹或成虫（蛾）。而在幼虫向蛹期发育时，体内有高水平的蜕皮激素，但保幼激素水平下降，使得幼虫向蛹期变态发育。因此认为，蜕皮激素控制着昆虫的蜕皮与变态发育进程；而保幼激素则调控着昆虫发育的方向。所以，蜕皮激素和保幼激素

8、信号传导系统及其相互作用是变态发育的核心问题。而家蚕生长与发育特征（例如个体大小、蜕皮和化蛹时期、成虫孵化时期）决定了蚕丝蛋白合成时期与合成量。因此，激素和营养信号传导对变态发育的调控将极大地影响着蚕丝产量和品质。本项目前期研究发现，家蚕共计有87种神经肽激素、激素受体和激素调节相关基因；鉴定出18种对20E敏感的受体和受体型转录因子。此外，神经肽激素基因，包括滞育激素（DH）、信息素生物合成激活神经肽（PBAN）、脂动激素（AKH）、羽化激素和家蚕素（4K-PTTH）基因也被鉴定。在前一期项目重点开展了家蚕JH和20E合成代谢途径及信号传导途径相关基因的鉴定和功能初探的基础上，本期项目将以丝

9、腺、脂肪体、中肠和表皮等组织器官为主要研究材料，重点研究昆虫变态发育的激素信号传导主要途径和关键调控分子的作用，揭示激素与营养信号与组织器官退化和再生的关系，建立比较完整的家蚕变态发育激素与营养调控的理论体系和机理模型，以期阐释昆虫变态发育这一重大的科学问题。干细胞与家蚕变变态发育的组组织器官再生生机理研究着着重解决成虫虫组织器官形形成中的干细细胞生物学行行为变化及调调控机制。家家蚕变态发育育期一般指55龄末期幼虫虫至成虫羽化化阶段，包括括幼虫-蛹和蛹-成虫（蛾）的的变化过程。在在变态过程中中，幼虫专性性组织如前胸胸腺、丝腺等等迅速退化消消亡，中肠、神神经和脂肪体体发生结构和和功能的转变变，翅

10、原基、胸胸足原基和生生殖腺细胞组组织快速分化化生长，并发发育为成虫的的器官组织。有有关果蝇的研研究表明，干干细胞在变态态发育期多种种成虫组织器器官分化形成成过程中扮演演着至关重要要的角色，受受到复杂的各各种信号分子子网络的调控控。干细胞与与组织器官再再生不仅与变变态发育有密密切的关系，与与丝腺发育和和免疫防御也也有着重要的的关系。前期期研究我们首首先关注了家家蚕中肠干细细胞的鉴定与与分化调节，在在筛查家蚕中中肠干细胞分分子标记和鉴鉴定变态发育育过程中的家家蚕中肠干细细胞等方面取取得突破进展展。本期项目目将以中肠、血血液、神经、脂脂肪体、翅原原基等组织器器官为主要材材料，系统研研究这些组织织器官

11、在家蚕蚕变态发育中中分化形成与与再生重建的的干细胞分子子基础，鉴定定目标组织器器官的干细胞胞，揭示干细细胞在相关组组织器官形成成或重建过程程中的自我维维持与分化行行为，阐释干干细胞分化为为相关组织器器官的分子调调控机制，这这是在分子细细胞生物学水水平阐明昆虫虫变态发育这这个重大科学学问题的关键键。 家蚕免疫调节与与抗性机理研研究将着重解解决宿主对病病原微生物的的模式识别问问题。昆虫体体液免疫在抵抵抗病原微生生物侵染中发发挥着最重要要的作用。昆昆虫体液分子子免疫系统主主要由模式识识别、信号传传导和效应因因子表达三个个部分组成。前前期项目主要要通过基因组组分析和微生生物诱导实验验，基本查明明了家蚕

12、体液液免疫信号传传导过程的关关键基因，系系统鉴定了家家蚕抗菌肽效效应因子的组组成和功能。研研究发现，家家蚕的免疫相相关基因和信信号传导途径径比较保守，与与模式生物果果蝇的Tolll和Imd两种先先天免疫信号号途径应答基基本一致，但但家蚕效应因因子体系与果果蝇相比又具具有一定的特特殊性。前期期项目还对TToll信号号途径中的TToll受体体、Spttzle、MyD888和Tube等，Imd途径中中的Imd、FADD、IKK和relissh等关键基基因进行了深深入研究。作作为免疫应答答的前哨，昆昆虫病原模式式识别受体是是激发免疫信信号传导通路路和效应因子子产生的关键键。昆虫对不不同的病原物物具有高

13、度特特异的模式识识别，剖析昆昆虫病原物的的模式识别，也也是阐明和提提高家蚕抗病病性的重要靶靶标。在前期期项目系统鉴鉴定信号传导导和免疫应答答体系的基础础上，本期项项目将重点研研究家蚕对不不同专有性病病原微生物的的模式识别分分子，以及它它们在启动免免疫信号通路路中的具体功功能，以期阐阐明家蚕重要要病害形成的的机制，寻求求新的防御措措施。 丝蛋白合成的分分子调控作为为昆虫特异基基因调控的研研究模式，对对昆虫发育和和分子生物学学的基础研究究将提供重要要补充作用；激素信号与与变态发育调调控、干细胞胞与变态发育育的组织器官官再生机理，以以及免疫分子子机制，更是是昆虫基础科科学研究的前前沿和热点。因因此，

14、这几个个方面的科学学问题相互联联系，不但作作为家蚕关键键品质性状对对蚕丝业生产产举足轻重，而而且也作为昆昆虫基础科学学的重要领域域，对整个昆昆虫学研究发发展和害虫防防治新策略的的产生都具有有十分重要的的意义。 第二：家蚕分子子育种理论基基础与技术体体系 在“十一五”家蚕“973”项目的支持持下，许多与与重要经济性性状相关功能能基因得到鉴鉴定，遗传素素材创新基础础平台建设也也已经初具规规模。系统研研究家蚕分子子育种的理论论体系，并建建立相应的技技术平台，培培育高产优化化的家蚕品系系，成为下一一个五年计划划必需解决的的重点问题。 家蚕分子育种理理论体系亟需需着重解决分分子改良靶标标和实现思路路。家

15、蚕自野野蚕经人工选选择和驯化而而来，与野蚕蚕祖先相比，家家蚕的产丝性性能提高近110倍。19300年代开始利利用一代杂种种优势，蚕丝丝产量比饲养养纯种又提高高了近20。自此此，家蚕生产产能力达到了了一个难以逾逾越的高峰，使使得其后近880年间未见见革命性突破破。与其它植植物或动物生生产一样，家家蚕品种也正正处于分子改改良甚至系统统分子育种的的前夜，新的的突破机遇需需要坚实的理理论基础。现现有遗传资源源中本身就存存在着大量发发育、变态和和抗性突变系系。如前所述述的三个关键键性状中，家家蚕激素调节节与免疫性状状实现分子育育种的靶标位位点相对较多多，而蚕丝蛋蛋白合成调节节的靶标位点点相对较少。初初步

16、研究成果果表明，通过过调节丝腺发发育和丝蛋白白编码基因转转录，可能是是实现丝产量量和品质改良良的有效途经经。本期项目目将以前述家家蚕几个关键键品质性状的的分子解析为为基础，建立立家蚕分子育育种的基本思思路和策略，为为家蚕品种的的分子改良奠奠定坚实的理理论基础。 家蚕分子育种技技术体系着重重解决遗传互互作和基因敲敲除技术的建建立。从基因因层面讲，分分子育种无外外乎有两个技技术途经：一一是已有基因因功能的加强强甚至新功能能的导入；二二是已有基因因功能的减弱弱甚至彻底丧丧失。通过前前期项目研究究，建立了比比较稳定和有有效的家蚕转转基因技术体体系，以及系系统RNAii、GAL4/UAS转基基因等分子遗

17、遗传操作方法法。但是，从从家蚕分子育育种的技术储储备和现实要要求而言，还还丞需建立和和完善遗传互互作和基因敲敲除等关键技技术。为此，本本期项目将着着重解决：克克隆不同发育育时期和组织织器官的特异异启动子或顺顺式作用元件件，建立多个个GAL4转基基因系，以实实现目的基因因的时空特异异转录调控；利用UASS使目的基因因功能加强或或获得新功能能，并整合RRNAi使目目的基因功能能消弱或丧失失；研究建立立2个UAS元件控控制2个基因的遗遗传操控及其其互作：2个基因同时时获得功能、2个基因同时丧失功能、1个基因获得功能而另1个基因丧失功能；结合GAL4/UAS转基因和FRT-FLP mosaic技术，建

18、立Flp-out mosaic方法，分析在任一组织、任一发育时期基因获得功能或丧失功能的细胞与外周野生型细胞的差异。家蚕中至今尚未实现基因的有效定向敲除（knock out）和敲入（knock in），本期项目将通过锌指核酸酶等方法建立家蚕基因定向敲除和敲入技术，通过对分子靶标的操控实现家蚕基因组的有效和定向编辑，为家蚕关键品质性状基因功能研究和分子改良与素材创新搭建关键技术平台。 2主要研究内内容 围绕以上两个关关键科学问题题，计划从三三个方面开展展研究：（1）家蚕重要要功能基因的的定位克隆 前期项目已经建建立了家蚕突突变基因定位位克隆平台技技术，以此为为基础，本期期将重点围绕绕家蚕丝品质质

19、、变态发育育和抗性性状状，定位克隆隆研究重要的的突变基因，在在布局上将分分解到三个品品质性状相关关的课题开展展研究。开展展此研究的主主要目的在于于保持前沿探探索，不断推推动家蚕功能能基因组研究究的长期和可可持续发展。 （2）家蚕关键键品质性状的的分子解析 从基因层面解析析家蚕丝蛋白白合成、激素素调控与变态态发育、干细细胞分化与组组织器官形成成以及分子免免疫的分子机机制，是本项项目的核心和和重点之一。因因此在布局上上，三个关键键性状以及干干细胞分化与与组织器官形形成均单独列列为课题开展展研究。丝蛋蛋白合成研究究将围绕家蚕蚕丝素重链基基因（fibb-H）、轻轻链基因（ffib-L）、丝丝胶基因（S

20、Ser133）和P25等蚕丝丝主要结构蛋蛋白编码基因因的转录调控控机理展开，重重点研究包括括丝腺细胞发发育与功能分分化，丝蛋白白编码基因表表达与激素信信号的相互关关系，丝纤维维主要组成蛋蛋白晶体结构构解析，各组组成蛋白数量量和结构与丝丝纤维加工工工艺性状之间间的关系等内内容。家蚕发发育激素调控控研究将围绕绕激素信号传传导体系展开开，重点包括括激素结合蛋蛋白或受体及及信号传导途途径关键转录录因子的克隆隆和功能研究究，蜕皮激素素和保幼激素素信号传导途途径关键调控控因子的相互互作用，昆虫虫激素与营养养调节的关系系，以及激素素调节与家蚕蚕旧组织退化化和新组织形形成之间的关关系等内容。干干细胞与家蚕蚕变

21、态发育的的组织器官再再生机理重点点围绕家蚕变变态发育中成成虫组织器官官形成的干细细胞基础展开开，重点包括括家蚕变态发发育中特定组组织干细胞的的鉴定，组织织器官发生或或重建中干细细胞的自我维维持与分化行行为，干细胞胞分化发育与与相关组织器器官的分子调调控机制等内内容。家蚕分分子免疫研究究将围绕家蚕蚕对专有病原原微生物的分分子识别展开开，包括家蚕蚕对主要病原原微生物侵染染的反应及病病原识别因子子的鉴定，免免疫应答及抗抗微生物肽表表达调控，主主要病原微生生物与宿主的的互作，以及及抗病和抗逆逆的分子基础础等内容。 （3）家蚕分子子育种理论基基础与技术体体系研究家蚕分子育种理理论基础与技技术体系建立立是

22、整个项目目的终极目标标和指引方向向，在布局上上列为两个课课题开展研究究。理论基础础围绕家蚕分分子改良的分分子靶标和实实现途径开展展研究，重点点包括丝蛋白白编码基因上上调表达研究究，丝腺组织织发育分子调调控以及与对对产丝量的影影响，家蚕激激素信号传导导对丝蛋白合合成的影响，家家蚕分子免疫疫信号调控与与疾病抵抗性性的调节等主主要内容，整整体上要求明明确关键品质质性状人为调调节的可能环环节和关键因因子，形成家家蚕分子育种种的理论体系系。分子育种种技术体系围围绕家蚕分子子遗传操作体体系和基因定定向敲除技术术开展工作，重重点包括利用用GAL4/UAS双开开关实现目的的基因的时空空特异调控，研研究2个基因

23、的同同步调控及其其遗传互作，建建立Flp-out mmosaicc技术并分析析突变体细胞胞和野生型细细胞的差异，利利用锌指核酸酸酶等技术实实现家蚕基因因的定向敲除除和基因替换换，家蚕基因因敲除与转基基因技术的整整合和遗传调调控等内容。整整体上要求实实现可人为干干预任何一个个靶标基因功功能的分子育育种平台。该该两个课题还还将利用整个个项目产出的的基础研究成成果，创新家家蚕遗传素材材，培育新型型高产优质和和满足特殊需需求的新品种种，推动蚕丝丝产业整体技技术水平和综综合效益的大大幅度提升，为为国民经济建建设和蚕农增增收服务。二、预期目标1总体目标根据国家蚕丝产产业发展重大大需求和蚕业业科学发展长长远

24、需要，以以“十一五五”家蚕“9973”项目目研究为基础础，“十二五”期间总总体目标是：1）充分挖挖掘利用家蚕蚕全基因组生生物信息学资资源和突变资资源，围绕关关键品质性状状，尤其是丝丝蛋白产量和和质量性状，克克隆或鉴定重重要关键基因因，解析其调调控途径，阐阐明关键品质质性状形成的的分子机理；2）建立和和完善家蚕基基因调控和定定向敲除等关关键平台技术术，实现完整整的功能丧失失和功能获得得等遗传分析析及素材创新新必需手段，建建立分子育种种的理论基础础和技术体系系，创制新型型素材，培育育新型品种。总总体上要求围围绕解决提高高蚕丝产量和和质量这个具具体的科学和和生产问题，取取得系统性和和标志性的重重大理

25、论突破破，以推进我我国蚕丝产业业技术革命，并并进一步夯实实我国家蚕基基础研究的国国际领先优势势，培养造就就一批具有国国际影响的中中青年学术带带头人和技术术骨干。2五年预期目目标（1）阐明四个个机制，形成成一个理论基基础，建立一一个技术体系系：以家蚕基基因组和功能能基因组学研研究成果为基基础，通过分分子、细胞和和个体水平的的系统研究，阐阐明家蚕关键键品质性状形形成的分子机机制，即家蚕蚕高效特异合合成丝蛋白的的分子调控机机制，家蚕激激素信号传导导途径与变态态发育调节机机制，家蚕干干细胞分化形形成成虫组织织器官的分子子机制，家蚕蚕分子免疫系系统中病原模模式识别与抗抗性形成的分分子机制；通通过研究，明

26、明确家蚕分子子改良关键靶靶标和策略模模型，建立完完善的家蚕分分子育种理论论基础；建立立包括基因敲敲除等在内的的家蚕基因遗遗传操控和基基因组定向编编辑技术，以以形成分子育育种的完整技技术体系。整整体上将家蚕蚕功能基因组组研究深化和和拓展到系统统的性状分子子解析与产业业应用新阶段段。（2）定位克隆隆至少25个个以上的重要要突变基因，通通过功能验证证和机理解析析揭示新的信信号通路或调调控途经。（3）深入研究究至少25个个与丝产量品品质、变态发发育激素调节节、成虫组织织干细胞发育育分化和抗病病性密切相关关的调控基因因，获取155个左右的关关键顺式作用用元件，取得得基因专利440项。（4）创制155个以

27、上的高高产、优质、强强健新型遗传传素材，培育育2个标志性性新蚕品种。（5）出版学术术专著3部，在在国内外核心心刊物发表论论文300篇篇，其中有重重要影响的论论文50篇以以上，并发表表35篇有有重要理论突突破的高水平平研究论文；培养和造就就一批中青年年学术带头人人和不同层次次的科技新人人，其中包括括硕士研究生生200名、博博士研究生1100名和博士后155名。三、研究方案1学术思路 利用家蚕全基因因组序列和高高精度遗传变变异图谱，通通过家蚕基因因定位克隆、基基因敲除和敲敲入，转基因因及RNA干干扰等现代分分子生物学技技术，以家蚕蚕丝蛋白合成成、变态发育育激素调节、组组织器官形成成的干细胞基基础以

28、及分子子免疫为目标标，系统深入入研究关键基基因的调控方方式和信号传传导，解析关关键品质性状状的分子机理理；利用GAAL4/UAAS系统在特特定组织特定定时间解析特特定基因的功功能和调控；利用锌指核核酸酶等技术术实现家蚕基基因组的定向向编辑，研究究建立家蚕分分子育种理论论和技术；通通过对关键分分子靶标的遗遗传操作实现现品质性状的的分子改造、素素材创新和品品种育成，奠奠定产业实际际应用的基础础。同时，使使家蚕作为鳞鳞翅目模式昆昆虫的研究提提升到一个新新的台阶。 2技术途径 项目总体采用三三条主要技术术路线：一是是精细图谱变异图谱基因定位，二二是基因功能能调控机理理性状形成成，三是关键键基因素材材创

29、新产业业应用。具体体如下： （1）精细图谱谱变异图谱谱基因定位位 基于家蚕重测序序建立的高精精度变异图谱谱，筛选有效效的SNPss定位标记；制作突变材材料作图群体体（BF1或或F2），利利用经典连锁锁信息和精细细图谱，确定定多态型标记记；对群体进进行分子标记记和性状之间间的连锁分析析，逐步缩短短性状连锁区区间至最小范范围；利用精精细图谱确定定所在区间候候选基因，通通过表达分析析、突变位点点分析基因功功能确定突变变基因。 （2）基因功能能调控机理理性状形成成 针对不同基因，设设计不同技术术路线研究基基因调控机理理：丝蛋白编编码基因主要要通过生物信信息分析筛选选候选顺式作作用元件，利利用DNA蛋白

30、质结合合技术鉴定顺顺式作用元件件和转录调控控因子，进而而探索转录调调控与激素信信号等通路之之间的联系；激素与发育育相关基因将将主要通过转转基因和RNNAi等技术术，对目标基基因进行功能能研究和调控控分析，以及及通过组织和和细胞分离与与离体转化和和培养技术对对基因表达调调节和功能在在分子、细胞胞、器官和个个体水平上进进行研究；干干细胞发育分分化相关基因因主要通过荧荧光示踪鉴定定特定组织的的干细胞和寻寻找干细胞发发育和分化的的关键节点，结结合基因芯片片、基因诱捕捕、生物信息息学等技术手手段，建立成成虫组织干细细胞的分化调调控网络；免免疫相关基因因主要通过PPull-ddown等鉴鉴定与病原物物结合

31、的蛋白白，通过基因因在细胞或者者个体表达调调控研究对下下游信号通路路、抗菌效应应因子和病原原诱导存活率率的影响。 （3）关键基因因素材创新新产业应用用 根据家蚕分子育育种理论和设设计，以piiggyBaac为载体，实实现有用基因因的正向改良良（新功能获获得或加强），利利用转基因RRNAi或者者锌指核酸酶酶技术，实现现基因功能的的反向改良（削削弱或者彻底底丧失功能），利利用转基因技技术和GALL4/UASS遗传开关，实实现对多个基基因同时操作作，实现优良良性状整合，创创制新型素材材；通过经典典育种程序，选选择稳定的品品系，育成高高产优质品种种。 总体技术路线如如下：3创新点与特特色 （1）重要品

32、质质性状关键基基因作用机理理及其调控网网络的系统性性解析 重点抓住蚕产量量和品质关键键，通过丝编编码基因调控控机理、变态态发育激素调调控、成虫组组织干细胞发发育分化和免免疫与抗性四四个密切相关关的课题，系系统并深入解解析家蚕重要要品质形成的的关键基因和和调控网络。因因此，从整体体上讲，本项项目是在完整整基因组生物物信息学基础础上，将首次次实现生物信信息学、基因因组学和功能能基因组学等等大规模分析析平台与分子子生物学、发发育生物学和和遗传学等分分析方法的有有机结合，高高起点、高通通量、高效率率地解剖决定定重要品质性性状的关键途途径的机理，将将系统地揭示示家蚕特有的的和区别于其其它昆虫、动动物和植

33、物的的基因作用方方式。 （2）突破分子子育种理论和和技术关键 其它昆虫（主要要是害虫）的的基础研究主主要以控制和和防治为目的的，而本项目目的主要目标标集中于有效效利用，具有有特殊性。项项目将率先建建立家蚕分子子育种理论和和技术体系，实实现素材创新新和育种。与与蚕丝产业技技术传统研究究相比，具有有理论上的先先进性、技术术方法的现代代性和研究方方案的高效性性，将突破传传统育种无法法逾越的障碍碍，推动蚕丝丝业技术革命命并奠定长远远可持续发展展基础。 （3）推动家蚕蚕作为昆虫研研究模式的发发展 项目所重点涉及及的家蚕丝蛋蛋白合成、发发育变态激素素调节、成虫虫组织干细胞胞发育分化和和免疫抗性的的分子机理

34、研研究等内容，在在理论上属于于昆虫科学前前沿性重大科科学问题。另另一方面，与与小鼠、线虫虫、果蝇、斑斑马鱼、拟南南芥等其它模模式生物相比比，现代昆虫虫学研究还缺缺乏一种重要要的模式昆虫虫，其主要障障碍之一是缺缺乏有效的、专专一的、定向向的和可控的的基因敲除与与敲进等遗传传操控技术体体系。通过本本项目将回答答昆虫学前沿沿科学问题的的同时，建立立家蚕有效的的遗传操控技技术体系，突突破家蚕昆虫虫模式化道路路中的关键瓶瓶颈，有力推推动家蚕这一一“中国果蝇蝇”基础研究究的快速发展展。4可行性分析析项目承担单位近近年来共完成成家蚕相关研研究项目700余项，包括括1项“9773”项目、110项“8663”项

35、目、115项“九五”和“十十五”重大大科技攻关项项目、4项国国家自然科学学基金重点项项目和40余余个面上项目目，完成了项项目的基础积积累。特别是是“十一五五”期间认真真执行“9773”家蚕项项目，至少在在三个方面奠奠定了本项目目的重要基础础：一是集中中了全国优势势力量，形成成紧密的分工工协作研究框框架，通过引引进和培养形形成了一支强强有力的研究究队伍；二是是各个承担单单位建设了高高水平的研究究平台，并形形成了各自的的特色和优势势；三是完成成了前一期项项目各项研究究任务，建立立了较为完善善的平台技术术，关键性状状研究取得了了突破。特别别是，本期项项目及时吸纳纳了从国外回回国的华南师师范大学冯启启

36、理教授和中中科院上海生生命科学研究究院植物生理理生态研究所所李胜研究员员两个优秀团团队以及多名名学术骨干，进进一步加强了了传统家蚕研研究力量与模模式昆虫（果果蝇）和害虫虫防治研究力力量的交叉整整合，研究力力量得到大幅幅度提升。 在工作保障方面面，先后召开开了多次全国国性家蚕基础础研究讨论会会，统一了学学术认识和研研究思路，确确立了有机的的整体方案，形形成了有效的的协作机制。各各成员单位均均开展了具体体的前期研究究。通过国际际学术交流和和国际合作项项目，与世界界高水平研究究机构建立了了稳定的合作作关系，为本本项目的开展展提供了良好好的国际合作作空间。此外外，通过农业业部行业技术术体系，建立立了国

37、家蚕桑桑产业技术研研发中心和技技术研发服务务网络，将有有力支撑本项项目成果的转转化和应用。我我们相信，通通过立项，集集成优势，紧紧密合作，完完全可以在家家蚕基础研究究上做出更大大更出色的标标志性成果，为为丝绸之路增增添异彩，为为中华民族产产业的发展做做出历史性贡贡献。5课题设置按总体研究目标标和思路，将将本项目分解解为6个课题题进行，具体体目标和主要要研究内容如如下：课题1：蚕丝蛋蛋白合成分子子调控与蚕丝丝品质形成机机理解析 研究目的：定位位克隆与产丝丝量和丝品质质相关的重要要突变基因，探探明家蚕发育育主控信号对对家蚕前部、中中部和后部丝丝腺发育与细细胞功能的异异化关系，剖剖析蚕丝蛋白白编码基

38、因转转录调控网络络与调控机制制，阐释决定定家蚕产丝量量和蚕丝主要要工艺性状形形成的分子机机理。该课题题为项目的核核心。研究内容： （1）家蚕产丝丝量和丝品质质相关突变基基因克隆与功功能研究一个新突变基因因的获得，往往往会导致一一条控制重要要生物性状的的新机制的发发现。在长期期自然和人为为选择过程中中，积累了大大量的家蚕突突变品系，有有关突变基因因遗传研究基基础相当扎实实。在这些家家蚕突变资源源中，报道与与蚕丝合成相相关的近300个品系，其其中相当一部部分都保存至至今，弥足珍珍贵。其中，与与蚕丝产量相相关的有5个个，包括薄纸纸茧（flcc，3连锁群群-49.00座位（下同同），后部丝丝腺分泌能力

39、力低下）、裸裸蛹（Nd，25-0.0，不不分泌丝素）、丝丝胶茧（Ndd-s，144-19.22，丝素轻链链不能合成）和和裸蛹b（Nd-b，遗遗传座位未知知，丝腺退化化）等；与蚕蚕丝品质相关关的有5个，绵绵茧（Fl，7-332.1，茧茧层浮松）和和软茧（Scc，遗传座位位未知，茧层层柔软似绵）等等；与蚕茧颜颜色相关的有有12个，包包括黄色、绿绿色、锈色等等系列；与蚕蚕营茧行为相相关的有4个个，包括破风风茧和吐平板板丝等。上述述突变除裸蛹蛹（Nds）基因因已被定位克克隆（编码基基因外显子）外外，其余突变变基因和机制制都不清楚。如如能分离克隆隆这些突变基基因，极有可可能为家蚕丝丝蛋白合成研研究和分子

40、机机制研究打开开突破口。 前期项目重重点建立了基基于SNP标标记的图位法法克隆体系，并并已经克隆或或者精细定位位了5个突变变基因，其中中包括与茧丝丝产量相关的的裸蛹基因（Nd）和品质相关突变绵茧基因（Fl），均已被锁定到数百K距离，候选基因不超过10个。这两个突变具有重要的研究价值：首先，这两个突变基因座位都与具体的编码基因相去甚远，因此不可能是编码基因突变；其次，从候选基因的情况看，推测与激素和丝腺细胞发育信号相关。因此，本期项目将选一些与产量和质量相关重要突变，配制定位材料，通过高密度SNP标记，精细定位并分离克隆突变基因，重点通过对突变性状产生的分子机理研究，寻找家蚕丝蛋白合成调控中的信

41、号通路，探索其与蚕丝产量和品质形成的关系。 （2）家蚕丝腺腺发育调控与与丝蛋白编码码基因表达的的空间特异性性 家蚕丝腺是起源源于外胚层的的器官，发生生在胚子最长长期和反转期期。丝腺细胞胞仅在胚胎期期发生10次次细胞分裂。幼幼虫期，丝腺腺细胞不再发发生分裂，至至5龄后期，一一个丝腺细胞胞核内DNAA的复制次数数达到2930次，细细胞核内的DDNA量增加加至107g和2144g，分别别相当于原来来的54万倍倍或108万万倍。以满足足后期丝蛋白白大量合成的的需要。丝腺细胞分化不不但形成了功功能特异的前前、中和后部部三个部分，而而且决定了丝丝蛋白编码基基因表达的空空间特异性。项项目将研究胚胚胎期丝腺细

42、细胞形成和分分化，研究不不同丝腺部位位分子结构特特征与功能的的关系。丝蛋蛋白编码基因因存在着一些些关键的顺式式作用元件，我我们将重点研研究丝蛋白编编码基因顺势势作用元件PPax4、PPax6、FFOX类的转转录因子结合合位点的功能能。挖掘未知知转录因子对对丝蛋白编码码基因的转录录调控关系，鉴鉴定家蚕丝蛋蛋白编码基因因与转录空间间特异性相关关的顺式作用用元件，以阐阐明家蚕丝蛋蛋白合成空间间特异性的分分子机制，并并探索通过转转录因子或者者顺式作用元元件的改造，提提高丝产量或或者改变蚕丝丝组分的可能能性。 （3）家蚕丝腺腺发育调控与与丝蛋白编码码基因转录的的时期特异性性形成机理 家蚕在孵化之后后，就

43、具有合合成少量丝蛋蛋白的能力。幼幼虫各个生长长龄期后部丝丝腺都能检测测到丝素mRRNA的转录录；但是在眠眠期却没有丝丝素mRNAA表达，表现现为反复的“开开与关”特征征。当幼虫发发育到末龄第第3天，丝腺腺开始大量合合成丝蛋白，直直至幼虫期结结束，丝蛋白白充满整个丝丝腺腔体，以以后则进入吐吐丝营茧期，表表明家蚕丝蛋蛋白合成具有有严格的时期期特异性。丝丝纤维三个组组要组分，即即丝素重链HH、丝素轻链链L和P255具有严格的的比例（H:L:P255=6:6:1），这是是形成丝素蛋蛋白小体并最最终形成丝纤纤维的决定性性因素，表明明不同丝蛋白白编码基因的的表达量调控控具有协调性性。 目前为为止，已发现现

44、了几个丝腺腺特异因子，如如SGF-11和SGF-33，它们参与与了丝胶基因因及丝素基因因的转录调控控。但其它几几个重要的转转录因子，如如SGF-22、SGF-44及PSGF等却却还未鉴定，它它们很可能与与丝素基因调调控相关。前前期项目在丝丝蛋白编码基基因上游鉴定定了两个与转转录因子BRR-C Z44和BR-CC Z1结合合的重要位点点。BR-CC是一个含有有BTB蛋白白结合结构域域及1-4个个锌指结构的的转录因子，具具有4种蛋白白异构体，它它是蜕皮激素素的重要初级级反应基因，并并对家蚕的蜕蜕皮和变态期期基因的转录录调控起着重重要的作用。研研究还发现，BBR-C的表表达时期与丝丝蛋白的表达达时期

45、是相反反的，很可能能与丝蛋白基基因的上游结结合位点序列列结合，抑制制丝素基因在在眠期的表达达。以此为基基础，本期项项目将重点研研究家蚕丝蛋蛋白主要编码码基因上游顺顺式作用元件件与激素信号号系统之间的的相互作用关关系，结合本本项目课题33，研究激素素受体及各下下游应答因子子对丝蛋白合合成的调控作作用机制，阐阐明家蚕丝蛋蛋白合成的时时期特异性和和不同丝纤维维蛋白组分协协同调控性对对产丝量的影影响。 （4）家蚕丝产产量和丝品质质形成机理一般认为，家蚕蚕产丝能力受受多个基因调调控并具有伴伴性遗传特征征，而部分茧茧丝品质具有有较高的遗传传力。本部分分研究将产丝丝量和品质形形成机制的阐阐明作为重点点，主要

46、包括括三个研究内内容： 首先先是定位和克克隆产量主性性状候选基因因。家蚕的产产丝性状主要要包括茧重、茧茧层量和茧层层率等指标，是是长期以来育育种工作的主主要选择对象象，虽然有不不少提高但机机制形成不明明。前期项目目中，我们利利用高产品种种“菁松”和和低产品系“兰兰10”为材材料，通过自自交，分别得得到这两个品品系20代以以上的自交系系。然后利用用近19万个个SNP位点点，对该材料料进行了全面面扫描，初步步获得了全茧茧重、茧层量量和丝长等性性状显著密切切相关的QTTL位点，而而茧层率也具具有潜在的QQTL位点。本本期项目将在在此基础上，进进一步加大样样本数量和标标记密度，对对主要产量性性状主效Q

47、TTL进行精细细定位，并克克隆分离主要要基因或者调调控区域，通通过分子生物物学手段，研研究这些基因因或者调控序序列对家蚕产产丝量的影响响和作用机制制。 其次是是解析蚕丝主主要成分蛋白白的晶体结构构。尽管我们们知道蚕丝纤纤维由丝素重重链H、丝素素轻链L和PP25蛋白所所组成，但是是对有关蛋白白空间结构和和蛋白质-蛋蛋白质相互作作用却毫不知知情。日本提提出了这三种种蛋白的初步步构象关系（丝丝蛋白小体结结构模式），但但缺乏结构生生物学证据。丝丝纤维结构成成为了悬而未未决的世界难难题。前期项项目我们克隆隆了丝素重链链N段序列，并并获得了其编编码蛋白的高高分辨率晶体体结构，首次次发现了其立立体结构以片层

48、为主，并并初步提出了了丝纤维空间间构象。以此此为基础，本本期项目将解解析主要成分分蛋白，包括括丝素重链HH、丝素轻链链L和P255的晶体结构构，不但破解解这一世界难难题，而且将将探索丝蛋白白空间结构与与物理、化学学特性之间的的关系，探索索丝蛋白结构构与蚕丝加工工工艺性状之之间的关系。以以结构生物学学为指导，还还将探索改变变蚕丝蛋白编编码基因或者者蛋白质组分分，以改进蚕蚕丝工艺缺陷陷，开发新功功能的可能途途经。 第三是分析影响响产丝产量和和质量的其它它重要因素。前前期项目中，通通过构建不同同家蚕品系和和野蚕全基因因组高精度遗遗传变异图谱谱，共计鉴定定了354个个与产丝性状状相关的蛋白白质编码基因

49、因作为驯化的的候选基因。特特别重要的是是，分析发现现了若干与产产丝性状相关关的人工选择择印记，其中中有4、322和54个基基因分别在丝丝腺、中肠和和精巢中高量量表达。在丝丝腺表达基因因中，丝腺特特异因子-11（Sgf-1）是与果果蝇Fkh同源的的一个基因，Sgf-1调控家蚕丝胶-1基因编码的丝胶蛋白和三个分别编码丝素重链、轻链和fhx/P25丝素基因的转录。另一个家蚕丝腺高量表达的基因是BGIBMGA005127，与果蝇sage基因同源。它在高丝量品种中的含量是常规品系“大造”的4倍。在果蝇中，Fkh和sage分别协调控制丝胶基因SG1和SG2的转录，它们在丝胶蛋白的合成和分泌中起着重要的作用。本期项目将重点探讨这些候选基因在蚕丝产量和品质形成中的重要作用，综合上述各方面