常用分子生物学技术的原理及其应用级临床医学讲稿.ppt

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1、常用分子生物学技术的原理及其应用级临床医学第一页，讲稿共二十五页哦概 述(一一)分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术 在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果将将不不同同种种类类的的DNA单单链链分分子子或或RNA分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，只只要要两两种种单单链链分分子子之之间间存存在在着着一一定定程程度度的的碱碱基基配配对对关关系系，在在适适宜宜的的条条件件下下，就就可可以以在在不不同的分子间形成杂化双链同的分子间形成杂化双链。这种现象称为。这种现象称为核酸分子杂交核酸分子杂交。将将各各种种生生物物大大分分子子从从凝凝胶胶转转移移到到一一种种固固定定基基质质上上的的过过程程称称为

2、为印迹技术印迹技术。第二页，讲稿共二十五页哦(二）聚合酶链式反应（二）聚合酶链式反应（PCR）PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。（三）单链构象多态性（三）单链构象多态性 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCRSSCP技术。第三页，讲稿共二十五页哦（四）限制酶酶谱分析（四）限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制

3、酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。（五）（五）DNA序列测定序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。（六）（六）DNA芯片技术芯片技术 应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。第四页，讲稿共二十五页哦第一节分子杂交与印迹技术、探针技术分子杂交与印迹技术、探针技术第五页，讲稿共二十五页哦一、分子杂交与印迹技术的原理第六页，讲稿共二十五页哦在在DNA变变性性后后的的复复性性过过程程中中，如如果果

4、将将不不同同种种类类的的DNA单单链链分分子子或或RNA分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，只只要要两两种种单单链链分分子子之之间间存存在在着着一一定定程程度度的的碱碱基基配配对对关关系系，在在适适宜宜的的条条件件（温温度度及及离离子子强强度度）下下，就就可以在不同的分子间形成可以在不同的分子间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这这种种杂杂化化双双链链可可以以在在不不同同的的DNA与与DNA之之间间形形成成，也也可可以以在在DNA和和RNA分分子子间间或或者者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交核酸分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(h

5、ybridization)第七页，讲稿共二十五页哦(一)印迹技术将各种生物大分子从凝胶转移到一种固将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术定基质上的过程称为印迹技术（blottingblotting）。）。第八页，讲稿共二十五页哦分子印迹分子印迹(渍渍)的概念的概念。将凝胶中的将凝胶中的DNADNA片段变性使其成为单链，然后再将一片段变性使其成为单链，然后再将一张硝酸纤维素张硝酸纤维素(nitrocellulose(nitrocellulose，NC)NC)膜放在凝胶上，膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使DNADNA片

6、段片段转移到转移到 NCNC膜上，使之成为固相化分子。载有膜上，使之成为固相化分子。载有DNADNA单单链分子的链分子的 NCNC膜就可以在杂交液与另一种带有标记膜就可以在杂交液与另一种带有标记的的 DNADNA或或RNARNA分子分子(即探针即探针)进行杂交，具有互补序列进行杂交，具有互补序列的的RNARNA或或DNADNA结合到存在于结合到存在于 NCNC膜的膜的 DNADNA分子上，经放分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。带。由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此

7、称为印迹技术。因此称为印迹技术。第九页，讲稿共二十五页哦(二)探针技术第十页，讲稿共二十五页哦 探针探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸多聚核苷酸，与固定在与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。有同源的核酸分子存在。因此印迹技术与探针技术往往同时使用。第十一页，讲稿共二十五页哦 分子杂交、印迹技术、探针技术实验分子杂交、印迹技术、探针技术实验目目 录录第十二页，讲稿共二十五页哦二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用DNA印

8、迹技术印迹技术(Southern blotting)RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析(Western blotting)第十三页，讲稿共二十五页哦(一一)DNA印迹技术印迹技术(Southern印迹法印迹法)DNA印迹技术印迹技术是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于能进行定位和测定分子量，可用于:基因的酶切图谱分析、基因突变分析、基因组基因的定性及定量分析、限制基因的酶切图谱分析、基因突变分析、基因组基因的定性及定量分析、限制性片段长度

9、多态性分析性片段长度多态性分析(RFLP)等。等。为了纪念为了纪念Southern 先生，以其姓氏称先生，以其姓氏称DNA印迹技术为印迹技术为Southern blotting(Southern印迹法印迹法)。第十四页，讲稿共二十五页哦(二二)RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于组织细胞中总用于组织细胞中总RNA或或mRNA的定性的定性和定量分析。和定量分析。其基本原理与其基本原理与DNA印迹技术类似。印迹技术类似。第十五页，讲稿共二十五页哦(三三)蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定

10、量及相互作用研究。第十六页，讲稿共二十五页哦三三种种印印迹迹技技术术第十七页，讲稿共二十五页哦放放射射自自显显影影照照片片目目 录录第十八页，讲稿共二十五页哦第第 二二 节节 PCR(PCR(聚合酶链式反应聚合酶链式反应)技术的技术的原理与应用原理与应用第十九页，讲稿共二十五页哦1993年年美美国国科科学学家家穆穆利利斯斯(K.Mullis)因因发发明明“聚聚合合酶酶链链式式反反应应”法法，在在遗遗传传领领域域研研究究中中取取得得突突破破性性成成就就、加加拿拿大大籍籍英英裔裔科科学学家家史史密密斯斯因因开开创创“寡寡聚聚核核甙甙酸酸基基定定点诱变点诱变”方法而共同获得诺贝尔方法而共同获得诺贝尔

11、化学奖化学奖。第二十页，讲稿共二十五页哦问题的提出？在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵。第二十一页，讲稿共二十五页哦发现耐热DNA聚合酶Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。第二十二页，讲

12、稿共二十五页哦一、PCR技术的工作原理PCRPCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：模板模板DNADNA的变性：的变性：模板模板DNADNA经加热至经加热至9393左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNADNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；反应作准备；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板模板DNADNA经加热变性成单经加热变性成单链后，温度降至链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配单链的互补序列配

13、对结合；对结合；第二十三页，讲稿共二十五页哦引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下，以用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板保留复制原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的半保留链互补的半保留复制链。复制链。重复循环变性重复循环变性-退火退火-延伸三过程，就可获得更多的延伸三过程，就可获得更多的“半半保留复制链保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需每完成一个循环需2 24 4分钟，分钟，2 23 3小时就能将待扩目的小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。基因扩增放大几百万倍。第二十四页，讲稿共二十五页哦PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火55C第二十五页，讲稿共二十五页哦