核酸类药物生化制药技术.ppt

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1、核酸类药物生化制药技术2022/10/51现在学习的是第1页，共24页 概概 述述 核酸类药物分为两类：核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质一类为具有天然结构的核酸类物质,这类药物已这类药物已广泛用于放射病广泛用于放射病(Co60)(Co60)、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等，、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有属于这一类的核酸类药物有ATPATP、辅酶、辅酶A A、脱氧核苷酸等。、脱氧核苷酸等。第二类为天然结构碱第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这类药物是当今人类

2、治疗病毒、肿瘤、，这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。胸苷、阿糖腺苷等。反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存在反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存在的寡聚核苷酸片断（反义的寡聚核苷酸片断（反义DNADNA和反义和反义RNARNA），结合目标基因或），结合目标基因或mRNAmRNA特定序特定序列列(靶核酸靶核酸)，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译。，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻

3、译。反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，即干扰遗传反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。信息从核酸向蛋白质的传递。2022/10/52现在学习的是第2页，共24页 概概 述述 核核酸酸是是由由许许多多核核苷苷酸酸以以33，5-5-磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接而而成成的的大大分分子子化化合合物物。核核苷苷酸酸由由碱碱基基、戊戊糖糖和和磷磷酸酸三三部部分分组组成成，碱碱基基和和戊戊糖糖组组成成的的单单元元叫叫核核苷苷。核核酸酸类类药药物物包包括括核核酸酸、核核苷苷酸酸、核核苷苷、碱碱基基及其衍生物。及其衍生物。依据化

4、学结构和组成分四大类：依据化学结构和组成分四大类：1 1 核酸碱基及其衍生物核酸碱基及其衍生物 2 2 核苷及其衍生物核苷及其衍生物 3 3 核苷酸及其衍生物核苷酸及其衍生物 4 4 多核苷酸多核苷酸 （C C）（U U）（T T）腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）-D-D-核糖核糖-2-D-2-D-脱氧核糖脱氧核糖2022/10/53现在学习的是第3页，共24页核酸的生产方法核酸的生产方法1.酶解法酶解法 是先用糖质原料、亚硫酸纸浆废液或其他原料发酵生产酵母，再从酵母体中提取核糖核酸（RNA），提取出的核糖核酸经过青霉属或链霉属等微生物产生的酶进行酶解，制成各种核苷酸。2.半合

5、成法半合成法 即微生物发酵和化学合成并用的方法。例如由发酵法先制成5-氨基4-甲酰胺咪唑核苷（AICAR），再用化学合成制成鸟苷酸。又如用发酵法先制成肌苷，再利用微生物的或化学的磷酸化作用，使肌苷转变为肌苷酸。2022/10/54现在学习的是第4页，共24页2022/10/55现在学习的是第5页，共24页 核苷酸的制备核苷酸的制备 核核酸酸(RNA(RNA主主要要存存在在于于微微生生物物中中，如如啤啤酒酒酵酵母母、纸纸浆浆酵酵母母以以及及多多种种抗抗生生素素的的菌菌丝丝体体；DNADNA主主要要存存在在于于动动物物内内脏脏等等)经经酶酶、酸酸、碱碱水水解解生生成成核核苷苷酸酸，然然后后分分离离

6、提提取取制制备备各各种种核核苷苷酸酸的的方方法法通通称称水水解解核核酸酸法法。用用催化剂的不同，分为酶水解、酸水解和碱水解等。催化剂的不同，分为酶水解、酸水解和碱水解等。(1)(1)酶水解酶水解 最常用的酶有桔青霉最常用的酶有桔青霉A.S3.2788A.S3.2788产生的产生的5 5磷酸二酯酶，也可用红酵磷酸二酯酶，也可用红酵母发酵所产生的母发酵所产生的3 3磷酸二酯酶。磷酸二酯酶。2022/10/56现在学习的是第6页，共24页 核苷酸的制备核苷酸的制备 （2 2）碱水解法）碱水解法 在在稀稀碱碱条条件件下下，RNARNA容容易易水水解解得得到到2 2核核苷苷酸酸和和3 3核核苷苷酸酸。实

7、实际际上上这这是是由由于于稀稀碱碱水水解解过过程程中中，先先形形成成一一个个中中间间环环状状物物2 2，3 3环环状状核核苷苷酸酸，它它很很不不稳稳定定，进进一一步水解生成步水解生成2 2和和3 3核苷酸。核苷酸。稀稀碱碱水水解解的的浓浓度度随随温温度度和和作作用用时时间间的的不不同同而而异异。用用1M1M氢氢氧氧化化钾钾或或氢氢氧氧化化纳纳在在8080下下作作用用1h1h能能使使RNARNA水水解解成成单单核核苷苷酸酸；用用0.3M0.3M氢氢氧氧化化钾钾或或氢氢氧氧化化纳纳在在3737下作用，要下作用，要16h16h。2022/10/57现在学习的是第7页，共24页 从微生物中提取RNA是

8、工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸，如酵母、白地霉、多中抗菌素（青梅素、制霉菌素等）的菌丝体。通常在细菌中RNA占525%，在酵母中占2.715%，在霉菌中占0.728%。菌体内RNA含量的变化受培养组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于C、H比例和培养基组成等。RNA来源2022/10/58现在学习的是第8页，共24页 RNA的制备的制备组织匀浆冷酸处理残留物酸溶性小分子有机溶剂处理脂溶性物质残留物酸处理碱处理酸提取液（RNA）残留物（DNA）上清液（RNA等）沉淀物（DN

9、A，蛋白质等）2022/10/59现在学习的是第9页，共24页实例2022/10/510现在学习的是第10页，共24页提取与纯化 乙醇沉淀法 提取 去污剂沉淀法 酚法纯化：密度梯度离心法 柱色谱法 凝胶电泳法2022/10/511现在学习的是第11页，共24页RNA的含量测定RNA消化浓硫酸or过氯酸核苷酸、碱基、戊糖正磷酸+钼酸，H+磷钼酸还原剂钼蓝660nm处最大吸光度；分光光度法检测。DNA含磷量：9.4%RNA含磷量：9.9%2022/10/512现在学习的是第12页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 三磷酸腺苷三磷酸腺苷是体内广泛存在的是体内广泛存在的辅辅酶酶，是体内，

10、是体内组织细组织细胞所需能量的主胞所需能量的主要来源，蛋白要来源，蛋白质质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需、脂肪、糖和核苷酸的合成都需ATP参与。参与。ATP经经腺腺苷酸苷酸环环化化酶酶催化形成催化形成环环磷酸腺苷磷酸腺苷(cAMP)，是，是细细胞内的生物活性物胞内的生物活性物质质，对对细细胞胞许许多代多代谢过谢过程有重要的程有重要的调节调节作用。作用。ATP为为蛋白蛋白质质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促使肝、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促使肝细细胞修复和再生，增胞修复和再生，增强强肝肝细细胞代胞代谢谢活性，活性，对对治治疗疗肝病有肝病有较较大大针对针对性。性。但外源性但外源性A

11、TP不易不易进进入入细细胞，且与体内需要的量比胞，且与体内需要的量比较较，可能提供的，可能提供的量微不足道。量微不足道。2022/10/513现在学习的是第13页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 白色类白色粉末，易溶于水，白色类白色粉末，易溶于水，难溶于有机溶剂。在水中的溶难溶于有机溶剂。在水中的溶解度具有氢型钠盐钡盐解度具有氢型钠盐钡盐汞盐的顺序。在碱性溶液汞盐的顺序。在碱性溶液(pHl0)(pHl0)及低温下比较稳定。及低温下比较稳定。ATPATP二钠是两性化合物。能与二钠是两性化合物。能与可溶性汞盐和钡盐形成不溶于可溶性汞盐和钡盐形成不溶于水的沉淀物，利用这种性质可水的沉

12、淀物，利用这种性质可分离分离ATPATP。1、化学结构和性质、化学结构和性质2022/10/514现在学习的是第14页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 （1 1）工艺路线）工艺路线 2、以兔肌肉为原料、以兔肌肉为原料强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂 2022/10/515现在学习的是第15页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 兔肉松的制备兔肉松的制备 提取提取 取取肉肉松松加加入入4 4倍倍量量冷冷蒸蒸馏馏水水，搅搅拌拌提提取取30min30min，过过滤滤后后再再提提取取1 1次次。合合并并2 2次次滤滤液液，冷处静置冷处静置3h3h，经

13、布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。2、以兔肌肉为原料、以兔肌肉为原料 吸吸附附 取取处处理理好好的的氯氯型型离离子子交交换换树树脂脂装装入入层层析析柱柱，用用pH3pH3的的水水将将柱柱平平衡衡。提提取取液液上上柱柱流流速速控控制制在在0.60.6一一1ml1ml(cm(cm2 2.min).min)左左右右，吸吸附附ATPATP。上上柱柱过过程程中中用用DEAEDEAEC C薄薄板检查。板检查。洗洗脱脱饱饱和和ATPATP柱柱，用用pH3pH3、0.03M0.03M氯氯化化钠钠液液洗洗涤涤柱柱上上滞滞留留的的AMPAMP、ADPADP及及无无机机盐盐等等，流流速

14、速控控制制在在1mL1mL(cm(cm2 2.min).min)。再再用用pH3.8pH3.8、1M1M氯氯化化钠钠液液洗洗脱脱ATPATP，流流速速控控制制在在0.3ml/(cm0.3ml/(cm2 2.min).min)，收集洗脱液。操作温度在，收集洗脱液。操作温度在0 0一一1010。2022/10/516现在学习的是第16页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 除热原、杂质除热原、杂质 将洗脱液按总体积计加入将洗脱液按总体积计加入0.60.6的硅藻土，的硅藻土，0.40.4的活性炭的活性炭搅拌搅拌10min10min，用，用4 4号垂熔漏斗过滤，收集号垂熔漏斗过滤，收集AT

15、PATP滤液。滤液。结结晶晶、干干燥燥 用用6M6M盐盐酸酸调调滤滤液液至至pH2.5pH2.53 3，在在2828的的水水浴浴中中恒恒温温,加加乙乙醇醇，不不断断搅搅拌拌，使使ATPATP二二钠钠结结晶晶，用用4 4号号垂垂熔熔漏漏斗斗过过滤滤，分分别别用用无无水水乙乙醇醇、乙乙醚醚洗洗涤涤，收收集集ATPATP二二钠钠结结晶晶，置置五五氧氧化化二二磷磷干干燥燥器器内内真真空空干干燥燥，即即得得ATPATP成成品品。次次滤液，冷处静置滤液，冷处静置3h3h，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。2、以兔肌肉为原料、以兔肌肉为原料2022/10/517现在学习的是第

16、17页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 3、产氨短杆菌直接发酵法、产氨短杆菌直接发酵法 2022/10/518现在学习的是第18页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 菌种培养菌种培养 培养基组成葡萄糖培养基组成葡萄糖1010，硫酸镁，硫酸镁1 1，尿素，尿素0.30.3，玉米浆适量，磷酸氢，玉米浆适量，磷酸氢二钾二钾1 1，磷酸二氢钾，磷酸二氢钾1 1pH7.2pH7.2，接种量，接种量7 79 9，pHpH控制在控制在6.86.87.27.2。发酵培养发酵培养 培养温度培养温度3030，36h36h，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨，控制，投入腺嘌呤，加尿素、氢

17、氧化钠和氨，控制pHpH。通风量通风量1 1：0.5v0.5v(v(vmin)min)。提取、精制提取、精制 发酵液加热使酶失活后，调节发酵液加热使酶失活后，调节pH3pH33.53.5，过滤，分离除去菌体，过滤，分离除去菌体，上清液通过上清液通过769769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用CL-CL-型阴离子交型阴离子交换树脂吸附换树脂吸附ATPATP，经氯化钠，经氯化钠盐酸液洗脱洗脱液经醇沉，过滤，丙酮洗涤，脱水，置盐酸液洗脱洗脱液经醇沉，过滤，丙酮洗涤，脱水，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，得五氧化二磷真空干燥器中干燥，得ATPATP品。品。

18、3、产氨短杆菌直接发酵法、产氨短杆菌直接发酵法 2022/10/519现在学习的是第19页，共24页 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 应用兔肌肉为原料的提取法生产应用兔肌肉为原料的提取法生产ATPATP，曾采用三氯乙酸沉淀蛋白质，以钡盐，曾采用三氯乙酸沉淀蛋白质，以钡盐和汞盐纯化和汞盐纯化ATPATP。此法耗用试剂多，成本高，易造成环境污染和直接危及操作人员身体。此法耗用试剂多，成本高，易造成环境污染和直接危及操作人员身体健康。后改用蒸馏水提取健康。后改用蒸馏水提取ATPATP，树脂精制纯化，树脂精制纯化 从根本上解决了上述存在的问题又可从根本上解决了上述存在的问题又可回收回收AMPAM

19、P、ADPADP，兔肉渣还可食用，总收率并不比汞盐法低。，兔肉渣还可食用，总收率并不比汞盐法低。产氨短杆菌产氨短杆菌B1B1是生物素缺陷型菌株，其诱变菌株也依赖生物素作为生长因子。玉是生物素缺陷型菌株，其诱变菌株也依赖生物素作为生长因子。玉米浆中含有丰富的生物素，加入培养基中使米浆中含有丰富的生物素，加入培养基中使ATPATP的产量显著提高。的产量显著提高。4 4、注解、注解 2022/10/520现在学习的是第20页，共24页第六节第六节 辅酶辅酶A辅酶A（coenzyme A，CoA）由-巯基乙胺、4-磷酸泛酸和3，5-二磷酸腺苷所组成，是ADP的衍生物或类似物，分子量为767.54.高纯

20、度的CoA（95%）为白色无定形粉末，具有典型的硫醇味，有吸湿性，易溶于丙酮、乙醚和乙醇。CoA兼有核苷酸和硫醇的同性，与其他硫醇一样，易被空气、过氧化氢等氧化成无活性的二硫化合物，故制剂中宜加稳定剂（如半胱氨酸盐酸盐等），并最好充氮保存。CoA是乙酰基的载体，对酯类代谢、糖代谢、蛋白质代谢、甾醇的生物合成和乙酰化解毒等都起重要作用。2022/10/521现在学习的是第21页，共24页生产工艺生产工艺吸附人造沸石绞碎心浆提取水，硫酸提取液离心，碱化氨水碱化液吸附细胞色素C的沸石流出液酸化稀硝酸酸化液吸附，洗涤活性炭，水pH4.0吸附CoA的活性炭洗脱水，40%含氨乙醇洗脱液浓缩，酸化硝酸pH2

21、.53，35上清液沉淀物CoA丙酮干粉干燥 4透析水，4，48h透析外液制剂水，甘露醇，L-半胱氨酸pH5.56，冻干冻干品新鲜猪心沉淀丙酮pH2.53，42022/10/522现在学习的是第22页，共24页工艺过程工艺过程1.酸化、吸附 沸石吸附细胞色素C后的流出液用稀硝酸调pH4.0，上活性炭柱，用蒸馏水洗株，在用40%乙醇洗至洗出液加10倍丙酮不出现白色浑浊为止。2.洗脱 用含3.2%氨的40%乙醇溶液洗脱，当流出液呈微黄色即开始收集，至pH10左右，停止收集。3.浓缩、酸化 洗脱液减压浓缩至原体积1/10（外温不超过60），用硝酸酸化至pH2.53.0，置冷库过夜。次日离心，上清液继续

22、浓缩至原体积1/20左右。2022/10/523现在学习的是第23页，共24页4.沉淀、干燥 浓缩液用硝酸调节pH2.53.0，在剧烈搅拌下加20倍酸化丙酮沉淀，置冰箱过夜，次日离心，沉淀用冷丙酮洗2次，低温干燥。5.透析 将丙酮CoA干粉溶于1.5倍新鲜冷蒸馏水中，装入透析袋，置入无热原蒸馏水中低温透析48h。6.制剂 准备测定透析外液CoA效价，加注射用水稀释至120U/mL，加甘露醇（15mg/支）和L-半胱氨酸盐酸盐（0.5mg/支），用1mol/L氢氧化钾调pH5.56.0，无菌过滤，灌装（0.25mL/支），冻干，封口。工艺过程工艺过程2022/10/524现在学习的是第24页，共24页