工业微生物的菌种选育与保藏讲稿.ppt

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1、工业微生物的菌种选育与工业微生物的菌种选育与保藏保藏第一页，讲稿共一百一十三页哦第一节 菌种的分离简介 一、菌种的来源一、菌种的来源一、菌种的来源一、菌种的来源n n根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、高高等等院院校校、工工厂厂或或菌菌种种保藏部门索取或购买；保藏部门索取或购买；n n从大自然中分离筛选新的微生物菌种。第二页，讲稿共一百一十三页哦二、分离思路 n n新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，快快速速、准准确确地把所需要的菌种挑选出来。地把所需要的菌种

2、挑选出来。n n实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。n n有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。第三页，讲稿共一百一十三页哦n n定方案：定方案：定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。n n采样：采样：采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。n n增增增增殖殖殖殖：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培条条件件，使使所所需需菌菌种种增增殖殖培培养养后后，在在数量上占优势。数量上占优势。n n分离：分离：分离：分离：利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。n n

3、发发发发酵酵酵酵性性性性能能能能测测测测定定定定：进进行行生生产产性性能能测测定定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐受受最最高高温温度度、生生长和发酵最适温度、长和发酵最适温度、最适最适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤第四页，讲稿共一百一十三页哦（一）采样1、采样对象 以采集以采集土壤土壤为主。田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主。富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也

4、可以是植物，腐败物品，某些水域等。第五页，讲稿共一百一十三页哦从自然界筛选从自然界筛选第六页，讲稿共一百一十三页哦n n2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。n n3、采采土土方方式式：在在选选好好适适当当地地点点后后，用用小小铲铲子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-15cm5-15cm处处的的土土约约10g10g，盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好好，标标记记，记记录录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件件等等，以以备备查查考考。为为了了使使土土样样中中微微生生物物的的数数量量和和类类型型尽尽少少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。变化

5、，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。第七页，讲稿共一百一十三页哦（二）增殖培养n n 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择择性性培培养养基，选择一定的培养条件来控制。基，选择一定的培养条件来控制。n n 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。第八页，讲稿共一百一十三页哦（三）培养分离n n 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效

6、效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。划划线线分分离离法法稀稀释释分分离离法法第九页，讲稿共一百一十三页哦（四）筛 选 n n这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以以求求得得适适合合于于工工业业生生产产用菌种。用菌种。第十页，讲稿共一百一十三页哦（五）毒性试验n n 自自然然界界的的一一些

7、些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其其他他微微生生物物作作为为食食用用，均均需需通通过过两两年年以以上上的的毒性试验。毒性试验。第十一页，讲稿共一百一十三页哦第二节 培养分离n n 从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种选选育育的的重重要要和和基基

8、础础的的步骤。步骤。n n 到到目目前前为为止止，还还没没有有一一种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个个试试样样中中所所包含的所有微生物总数和种类。包含的所有微生物总数和种类。n n在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的菌菌株株；在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程程中中，应应及及时时调调整整检检测测方方法法，以以与与各各种种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。不同类型的生长和代谢之微生物相适应。第十二页，讲稿共一百一十三页哦一、成功的分离培养方法(1)(1)认真考它所需产品的特征和生产过程；认真考它所需产品的特征和生产过程；(

9、2)(2)制订初步的筛选标准；(3)(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。第十三页，讲稿共一百一十三页哦二、培养分离中要解决的问题二、培养分离中要解决的问题1、“分离什么和从哪里分离出?”2、必必须须充充分分考考虑虑所所分分离离微微生生物物的的生生产产能能力力、生生长长速速度度、生生物物群群体体培培养养和和产产品品生生产产工工艺艺及及其其提提纯纯的的难难易易和和费费用用，工工业业生生产产发发酵酵罐罐中中稳稳定定性性及及遗遗传传操操作作的的难难易易程程度等。度等。3 3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。、选择适宜的培养分离方法和检测方法。第十四页，讲稿共一百

10、一十三页哦三、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点n n1 1罗列出所要分离的微生物类群；罗列出所要分离的微生物类群；n n2 2根根据据所所采采集集样样本本的的各各种种生生态态参参数数，描描述述所所要要分分离离的的微微生生物物之之生生态态系统或栖息地：系统或栖息地：n n3 3将将若若干干样样本本分分成成若若干干类类型型，如如植植物物和和植植物物各各部部，土土壤壤(类类型和土层型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；、岩石、水、昆虫和发酵食品等；n n4 4罗罗列列出出所所要要考考察察和和测测量量的的环环境境参参数数，如如pHpH、盐盐分分、水水分分、氧氧化还原电势及温度等；化还原电势及温

11、度等；第十五页，讲稿共一百一十三页哦 5 5列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；葡萄表皮的果胶；6 6根据上述根据上述1-51-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；7 7用标准方法作对照来评价生态学分离方法；用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8 8根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9 9运用特定的富集方法，富集那些可能

12、具有筛选意义的微生物类运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。群。第十六页，讲稿共一百一十三页哦四、自然界中细菌的分离第十七页，讲稿共一百一十三页哦(一)采样和采集方法n n为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中中出出现现的的菌群时，必须十分重视样本的采集。菌群时，必须十分重视样本的采集。n n样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。第十八页，讲稿共一百一十三页哦采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无

13、菌；2 2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；第十九页，讲稿共一百一十三页哦n n5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于于44下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体环境，其内部生态环境

14、就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长之间就会出现消长第二十页，讲稿共一百一十三页哦1土样采集方法n n森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；n n水水田田等等浸浸水水土土壤壤在在不不损损土土层层结结构构的的情情况况下下插插入入圆圆筒筒采采集集。如如果果层层次次要要求求不不严严格格，可可取取离离地地面面5 515cm15cm处处的的土土。将将采采集集到到的的土土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。n n在在采采集集植植物物根根际际土土样样时时，一一般般方方法法是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出植植物物根根，在

15、在大大量量无无菌菌水水中中浸浸渍渍约约20min20min，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。第二十一页，讲稿共一百一十三页哦2植物体采集方法n n 在在采采集集叶叶面面时时，一一般般是是用用灭灭菌菌的的剪剪刀刀、打打孔孔器器、安安全全刀刀片片等等，由由几几片片新新鲜鲜叶叶片片的的同同一一部部位位切切取取一一小小块块，并注意不要损伤周围边缘。并注意不要损伤周围边缘。n n选选择择叶叶面面时时应应考考虑虑叶叶位位、叶叶龄龄、叶叶片片正正反反面面和和在在一一片片叶上的取样部位。叶

16、上的取样部位。n n采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。第二十二页，讲稿共一百一十三页哦 3水样采集方法n n用用于于细细菌菌检检测测的的水水样样应应收收集集于于100m1100m1干干净净、灭灭菌菌的的广广口口塑塑料料瓶瓶中。中。n n由由于于表表层层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样样时时应应在在较较深深的的静静水水层层中中采采集集水样。水样。n n方方法法是是：握握住住采采样样瓶瓶底底浸浸入入水水中中30-50cm30-50cm处处，然然后后瓶瓶口口朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让让水水样样进进入入。如如果果有有急

17、急流流存存在在的的话话，应应直直接接将将瓶瓶口口反反向向于于急急流流。采采集集瓶瓶从从水水中中取取出出时时应应迅迅速速并并带带有有较较大大的的弧弧度度。水水样样不不应应装装满满采采样样瓶瓶。所所有有水水样样都都应应在在24h24h之之内内迅迅速进行检测，或者速进行检测，或者44下贮存。下贮存。第二十三页，讲稿共一百一十三页哦(二)生态学参数及培养基的组成原则1 1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都都会会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。影响实验中所要分离的

18、细菌的数量和种类。2 2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，部部分分培培养养基基中中则则应应含含有有多多种种碳碳、氮氮源源，如如几几丁丁质质、纤维素或果胶。纤维素或果胶。第二十四页，讲稿共一百一十三页哦3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和如放线菌酮和制霉素制霉素)，掺加浓度一般为50g50gm1m1，以抑制真菌以抑制真菌的生长。的生长。4 4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育l l2天。5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，

19、如pHpH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。第二十五页，讲稿共一百一十三页哦土中细菌的富集培养与分离土中细菌的富集培养与分离n n 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。富集。n n但但对对某某些些少少数数细细菌菌则则要要求求特特殊殊的的富富集集或或选选择择技技术术才能很好地被分离培养。才能很好地被分离培养。第二十六页，讲稿共一百一十三页哦富集方法n n运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基复杂底物及生长因子的前体物质来激活

20、细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。因组，可以建立起若干富集技术。n n富集可以促进抗性的产生并维持下来。第二十七页，讲稿共一百一十三页哦n n土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m10.1m1涂布已添加及涂布已添加及未添加富集底物未添加富集底物(如几丁质、纤维素等如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。n n植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。经适度稀释后涂布平板。n n水中细菌的分离：水样通过0.22m0.22m无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下

21、。用样本稀释液适度无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。第二十八页，讲稿共一百一十三页哦水中细菌分离的简易富集技术n n 在在无无菌菌的的、用用棉棉团团塞塞好好的的广广口口三三角角烧烧瓶瓶中中连连续续培培养养，定定期期取取样样涂涂布适宜分离琼脂平板上；布适宜分离琼脂平板上；n n在在不不同同水水体体的的水水样样中中加加入入一一定定的的底底物物如如蔗蔗糖糖、多多糖糖及及蛋蛋白白质质等，同样可以促进水中微生物的增殖。等，同样可以促进水中微生物的增殖。n n培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。培养过程

22、中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。n n另另一一富富集集方方法法是是在在培培养养烧烧瓶瓶中中添添加加细细菌菌“附附着着材材料料”，如如无无菌菌的的植植物组织或土壤浸出液。物组织或土壤浸出液。n n通通过过改改变变培培养养温温度度和和培培养养周周期期可可选选择择性性富富集集嗜嗜冷冷性性细细菌菌、中中温温菌菌和嗜高温菌。和嗜高温菌。第二十九页，讲稿共一百一十三页哦次代培养及纯化步骤 1 1、涂涂布布的的平平板板经经培培养养后后，如如生生长长出出菌菌落落，则则按按涂涂布布不不同同稀稀释释度度的的稀稀释释液液所所得得的的单单菌菌菌菌落落和和多多菌菌菌菌落落对对琼琼脂脂平平板板进进行行分类。分类

23、。2 2、用用无无菌菌牙牙签签将将菌菌落落转转接接到到筛筛选选平平板板上上及及转转接接至至添添加加有有少少量量天天然然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3 3、筛筛选选平平板板经经培培养养后后，按按生生长长出出菌菌落落的的形形态态学学特特征征如如色色素素、菌菌落落形形态等进行最初分组。态等进行最初分组。4 4、将将认认为为有有希希望望的的菌菌落落用用牙牙签签转转接接到到另另一一模模拟拟分分离离琼琼脂脂平平板板上进行筛选。上进行筛选。第三十页，讲稿共一百一十三页哦五、放线菌的分离(一一)采样及采集方法n n应尽可能实行无菌操作。n n所采集的样本应具有一定的代表性。n n样

24、样本本采采集集完完后后，应应及及时时处处理理或或在在4下下贮贮存存，贮贮存存试试样样处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。第三十一页，讲稿共一百一十三页哦(二)生态学参数n n 放放线线菌菌分分离离培培养养过过程程中中所所需需考考虑虑的的生生态态参参数数有有温温度、度、pHpH、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。第三十二页，讲稿共一百一十三页哦（三）培养基的组成原则n n大大多多数数放放线线菌菌的的分分离离培培养养是是在在贫贫脊脊或或复复杂杂底底物物的的琼琼脂脂平平板板上上进进行行的的。除除嗜嗜温温性性放放线

25、线菌菌外外，其其他他放放线线菌菌一一般般在在培培养养4-204-20天天内内在在分离平板上缓慢形成菌落。分离平板上缓慢形成菌落。n n在在放放线线菌菌分分离离琼琼脂脂中中通通常常都都加加入入抗抗真真菌菌剂剂制制霉霉菌菌素素或或放放线线菌菌酮，以抑制真菌的繁殖。酮，以抑制真菌的繁殖。n n选择性地添加抗生素。选择性地添加抗生素。n n分分离离琼琼脂脂平平板板制制备备好好后后，一一般般皆皆应应在在3737培培养养箱箱中中存存放放3 3天。天。第三十三页，讲稿共一百一十三页哦放线菌的分离n n土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印

26、土样后压印平板后培养。压印土样后压印平板后培养。n n植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。微生物后振荡培养。n n水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。第三十四页，讲稿共一百一十三页哦次代培养及纯化n n菌菌落落形形成成后后可可根根据据肉肉眼眼可可见见的的菌菌落落形形态态上上的的差差异异，作作初初步步的的鉴鉴定定和区分。和区分。n

27、 n通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。n n成成功功地地分分离离出出各各种种不不同同的的放放线线菌菌属属及及种种的的关关键键是是所所采采集集样样本本的的本本身身及及其其分分离离用用的的琼琼脂脂培培养养基基；而而肉肉眼眼识识别别不不同同的的生生长长形形态态、从从而而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。n n将将分分离离平平板板上上所所形形成成的的菌菌落落用用经经火火焰焰灼灼烧烧灭灭菌菌的的钩钩形形针针或或无无菌菌牙牙签签挑挑取取，点点接接到到琼琼脂脂平平板板上上进进行行影影印

28、印培培养养，以以进进一一步步筛筛选选和和分离。分离。第三十五页，讲稿共一百一十三页哦六、真菌分离、真菌分离1、利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3 3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。第三十六页，讲稿共一百一十三页哦4 4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平

29、的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。第三十七页，讲稿共一百一十三页哦真菌的分离方法n n土土中中真真菌菌的的分分离离：稀稀释释法法，混混入入法法，压压贴贴法法，粘粘附附法法，浮浮选选法法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。n n植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。n n水水中中真真菌菌的的分分离离：水

30、水样样稀稀释释后后涂涂布布分分离离。饵饵诱诱技技术术常常用用于于水水中中真真菌的富集。菌的富集。n n子子实实体体直直接接分分离离培培养养担担子子菌菌：新新采采集集的的子子实实体体组组织织植植入入平平板板内内或或在在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。第三十八页，讲稿共一百一十三页哦七、生产选种n n 是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。n n

31、进进行行类类似似新新种种筛筛选选分分离离，达达到到获获得得新新的的优优良良生生产产菌菌种种的目的。的目的。第三十九页，讲稿共一百一十三页哦第三节 工业菌种的育种方针n n工业菌种的育种：是是运运用用遗遗传传学学原原理理和和技技术术对对某某个个用用于于特特定定生生物物技技术术目目的的的的菌菌株株进进行行的的多多方方位位的的改改造造。通通过过改改造造，可可使使现现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。第四十页，讲稿共一百一十三页哦工业菌种育种的方法n n诱变n n基因转移n n基因重组第四十一页，讲稿共一百一十三页哦育种过程n n包括下列3

32、个步骤：n n (1)(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。n n(2)(2)希望基因型的选出。希望基因型的选出。n n(3)(3)改良菌种的评价改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。第四十二页，讲稿共一百一十三页哦选择育种方法时综合考虑的因素 (1)待待改改良良性性状状的的本本质质及及与与发发酵酵工工艺艺的的关关系系(如如批批式式或或连续发酵试验连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；(3)(3)经济费用。经济费用。n n如如果果对对特特定定菌菌种种的的基基本本性性状状及及其其工工艺艺知知晓晓甚甚少少，则则多多半采用随机诱变、筛选及选育等技

33、术：半采用随机诱变、筛选及选育等技术：n n如如果果对对其其遗遗传传及及生生物物化化学学方方面面的的性性状状已已有有较较深深的的认认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。第四十三页，讲稿共一百一十三页哦工业菌种改良方法 (1)(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。增加前体物的浓度。(3)改改变变代代谢谢途途径径，减减少少无无用用副副产产品品的的生生成成以以及及提提高高菌菌种种对高浓度的有潜在毒性的底物、

34、前体或产品的耐受力。对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。第四十四页，讲稿共一百一十三页哦(4)抑制或消除产品分解酶。抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)(6)消消除除代代谢谢产产品品的的反反馈馈抑抑制制。如如诱诱导导代代谢谢产产品品的的结结构构类类似物抗性。似物抗性。第四十五页，讲稿共一百一十三页哦 提高特定基因的表达水平n n(1)(1)引引入入强强转转录录及及翻翻译译信信号号，可可通通过过在在一一高高效效表表达达载载体体上上克克隆隆靶靶基基因因；在在靶靶基基因因的的上上游游引引入入强强启启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。动子；修改现有表达信号，提高

35、基因效力等。n n(2)(2)诱导解除基因表达抑制的突变。第四十六页，讲稿共一百一十三页哦 改进菌种的生长效率n n提高菌株对底物的利用率方法：提高菌株对底物的利用率方法：n n a.a.通过确定并改变代谢中的耗能部分;n n b.由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。n n c.赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。第四十七页，讲稿共一百一十三页哦第四节 诱变育种n n以以微微生生物物的的自自然然变变异异作作为为基基础础的的生生产产选选种种的的机机率率并并不不很很高，一个基因的自然突变频率仅高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-1010-6-10-

36、10左右。n n诱诱变变育育种种：以以诱诱发发突突变变为为基基础础的的育育种种，是是迄迄今今为为止止国国内内外提高菌种产量、性能的主要手段。外提高菌种产量、性能的主要手段。第四十八页，讲稿共一百一十三页哦诱变诱变物理、化学或生物诱变方法物理、化学或生物诱变方法第四十九页，讲稿共一百一十三页哦 一、诱变剂和诱变处理一、诱变剂和诱变处理n n 物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子；n n物物理理因因素素中中目目前前使使用用得得最最方方便便而而且且十十分分有有效效的的是是紫紫外外线线。许许多多高高产产菌菌株株的的选选育育都都用用过过紫紫外外线线，对对于于一一般实验室、中小型工厂都适用，也很

37、安全。般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。n n其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。第五十页，讲稿共一百一十三页哦化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。第五十一页，讲稿共一百一十三页哦2 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩

38、。而用电离辐射行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大大部部分分诱诱变变剂剂是是致致癌癌剂剂，所所以以在在使使用用中中必必须须非非常常谨谨慎慎，要要避避免免化化学学诱诱变变剂剂与与皮皮肤肤接接触触，且且切切勿勿吸吸入入其其蒸蒸气气，有有人人对对某某些些诱诱变变剂剂极极其其敏敏感感，甚甚至至未未直直接接接接触触就就会会过过敏，这就更要当心。敏，这就更要当心。第五十二页，讲稿共一百一十三页哦诱变剂的选择1 1碱碱基基类类似似物物和和羟羟胺胺具具有有很很高高的的特特异异性性，但但很很少少使使用用，回复突变率高，效果不大。回复突变率高，效果不大。2亚亚硝硝酸酸和和烷烷化化剂剂应应用用的的范范围围较

39、较广广，造造成成的的遗遗传传损损伤伤较较多多。其其中中亚亚硝硝基基胍胍和和甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯常常被被称称为为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。第五十三页，讲稿共一百一十三页哦3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4 4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。第五十四页，讲稿共一百一十三页哦二、诱变育种步骤二、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选第五十五页，讲稿共一百一十三页哦(一)出发菌株的选择1自自然然界界新新分分离离的的野野生生型型菌菌株株，对对诱诱变变处

40、处理理较较敏敏感感，容易达到好的效果。容易达到好的效果。2在在生生产产中中经经生生产产选选种种得得到到的的菌菌株株与与野野生生型型较较相相像像，也是良好的出发菌株。也是良好的出发菌株。3 3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4出出发发菌菌株株开开始始时时可可以以同同时时选选23 3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。第五十六页，讲稿共一百一十三页哦 5 5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。

41、特别是高产基因。6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。第五十七页，讲稿共一百一十三页哦(二)处理菌悬液的制备n n这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。第五十八页，讲稿共一百一十三页哦(三)诱变处理 根根据据前前面面有有关关诱诱变变剂剂及及诱诱变变处处理理的的介介绍绍，结结合合诱诱变变对象的实际，设计诱变处理方案。对象的实际，设计诱变处理方案。第五十九页，讲稿共一百一十

42、三页哦(四)中间培养 由由于于在在发发生生了了突突变变尚尚未未表表现现出出来来之之前前，有有一一个个表表现现延延迟迟的的过过程程，即即细细胞胞内内原原有有酶酶量量的的稀稀释释过过程程(生理延迟)，需3 3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。第六十页，讲稿共一百一十三页哦 方法：让让变变异异处处理理后后细细胞胞在在液液体体培培养养基基中中培培养养几几小小时时，以以让让细细胞胞的的遗遗传传物物质质复复制制，让让细细胞胞繁繁殖殖几几代代，以以得得到到纯纯的的变变异异细细胞胞。这这样样，隐隐性性的的变变异异就就会会显显现现出出来来，若若不不经经液液体体

43、培培养养基基的的中中间间培培养养，直直接接在在平平皿皿上上分分离离就就会会出出现现变变异异和和不不变变异异细细胞胞同同时时存存在在于于一一个个菌菌落落内内的的可可能能，形形成成混混杂杂菌菌落落，以以致致造造成成筛筛选选结结果果的的不不稳稳定定和和将将来来的的菌株退化。菌株退化。第六十一页，讲稿共一百一十三页哦(五)分离和筛选n n筛筛选选分分初初筛筛和和复复筛筛。初初筛筛以以迅迅速速筛筛出出大大量量的的达达到到初初步要求的分离菌落为目的，以量为主。步要求的分离菌落为目的，以量为主。n n复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产

44、物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%90%的的菌菌落落淘淘汰汰。在在数数量量减减少少后后就就要要仔仔细细比比较较参参加加复复筛筛和和再再复复筛筛的的菌菌株株，最最后后才才能能选选得得优优秀秀菌菌株株。在在以以后后的的复复筛筛阶阶段段，还还应应不不断断结结合合自然分离，纯化菌株。自然分离，纯化菌株。第六十二页，讲稿共一百一十三页哦紫外线的诱变育种n n 紫紫外外线线诱诱变变一一般般采采用用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7

45、080%为宜。第六十三页，讲稿共一百一十三页哦亚硝基胍诱变曲霉菌n n N甲基N-硝硝基基-N-亚硝基胍(NGN(NGN，MNNG或或TG)对对真真核核或或原原核核微微生生物物都都有有强强烈烈的的诱诱变变作作用用。其其精精确确的的作作用用机机制制尚尚不不很很清清楚楚，据据认认为为是是伴伴随随着着重重氮氮甲甲烷烷的的生生成成及及在在酸酸性性条条件件下下生生成成亚亚硝硝酸酸，直直接接作作用用于于细细胞胞内内的的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。第六十四页，讲稿共一百一十三页哦第五节 营养缺陷型的选育n n营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸

46、、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。n n与营养缺陷型对应的是野生型。第六十五页，讲稿共一百一十三页哦n n能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；n n在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)(SM)；n n能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。第六十六页，讲稿共一百一十三页哦营养缺陷型的用途n n 营营养养缺缺陷陷型型在在生生产产上上和和科科学学研研究究上上用用途途很很大大。目目前前生生产产氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸的的

47、菌菌种种都都是是各各种种类类型型的的缺缺陷陷型型。要要研研究究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。第六十七页，讲稿共一百一十三页哦筛选营养缺陷型的步骤n n诱变n n淘汰野生型n n检出缺陷型n n确定生长谱第六十八页，讲稿共一百一十三页哦一、诱变方法n n物理诱变n n化学诱变第六十九页，讲稿共一百一十三页哦二、淘汰野生型n n抗抗生生素素法法：野野生生型型能能在在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MMMM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应

48、加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。n n菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。第七十页，讲稿共一百一十三页哦 三、检出缺陷型n n原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上上生生长长良良好好，而而在在MM上则不生长，野生型都能生长。上则不生长，野生型都能生长。n n具体方法：影印法、点种法、夹层法 第七十一页，讲稿共一百一十三页哦n n1将将一一较较平平皿皿直直径径小小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌

49、。n n2 2将将完完全全培培养养基基上上长长出出的的全全部部菌菌落落在在丝丝绒绒上上轻轻轻轻一一压压，使之成为印模，标记方位。使之成为印模，标记方位。n n3将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。(一)影印法第七十二页，讲稿共一百一十三页哦n n4 4 将将CM和MM在恒温箱中培养。在恒温箱中培养。n n5二二平平皿皿相相同同方方位位进进行行比比较较，即即可可发发现现在在MMMM平平皿皿上上长长出出的的菌菌落落少少于于GM平平板板上上的的。MMMM上上未未长长而而相相应应于于CMCM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。上长出的那几个菌落就可能是缺陷

50、型。n n此此法法要要求求平平皿皿上上菌菌落落不不能能太太多多，菌菌落落之之间间应应有有一一定间隔。定间隔。第七十三页，讲稿共一百一十三页哦(二)点种法n n也就是任意法。也就是任意法。n n用接种针或牙签将CM上上长长出出的的菌菌落落在在MMMM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。n n此法结果明确，但工作量大。第七十四页，讲稿共一百一十三页哦(三)夹层法n n先先在在培培养养皿皿上上倒倒一一层层基基本本琼琼脂脂培培养养基基，凝凝固固后后涂涂上上一一层层含含菌菌的的MMMM，凝固后再倒一薄层MMMM琼琼脂脂培培养养基基，培培养养24h24h，将将出出现现的