工业微生物分离与筛选讲稿.ppt

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1、工工业微生物分离与微生物分离与筛选第一页，讲稿共四十二页哦定定方方案案：首首先先查查阅阅资资料料，了了解解所所需需菌菌种种的的生生长长培养特性。培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。增增殖殖：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培条条件件，使使所所需需菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。发发酵酵性性能能测测定定：进进行行生生产产性性能能测测定定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产

2、量量、耐耐受受最最高高温温度度、生生长长和和发发酵酵最最适适温温度度、最最适适pHpH值值、提提取取工工艺等。艺等。新菌种分离与筛选的步骤新菌种分离与筛选的步骤第二页，讲稿共四十二页哦（一）菌种的来源（一）菌种的来源v根据资料直接向有科研单位、高等院校、工根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；厂或菌种保藏部门索取或购买；v从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。第三页，讲稿共四十二页哦新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法

3、，快快速速、准准确确地地把把所所需需要要的的菌菌种种挑选出。挑选出。实实验验室室或或生生产产用用菌菌种种若若不不慎慎污污染染了了杂杂菌菌，也必须重新进行分离纯化。也必须重新进行分离纯化。（二）分离思路（二）分离思路第四页，讲稿共四十二页哦第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集一、从土壤中采集一、从土壤中采集分布：细菌、放线菌、分布：细菌、放线菌、霉菌、酵母、霉菌、酵母、藻类、藻类、原生动物原生动物1、土壤特点：v有机质含量和通气状况 5-25cm细菌、放线菌；5-10cm酵母、霉菌v酸碱度和植被状况第五页，讲稿共四十二页哦p地理条件p季节条件：以温度适中，雨量不多的以温度适中，雨量

4、不多的秋秋 初初为好。为好。第六页，讲稿共四十二页哦二、根据微生物生理生化类型采样1、根据微生物营养类型采样 自养型、异养性（碳源不同）2、根据生理特性采样 温度敏感型、氧敏感性、渗透压敏感型、酸碱型等3.特殊环境下采样：极端微生物 第七页，讲稿共四十二页哦三、采样方式三、采样方式（1 1）土样采集）土样采集v森森林林、旱旱地地，草草地地可可先先掘掘洞洞，由由土土壤壤下下层层向向上上层层顺序采集；顺序采集；v用用小小铲铲子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-25cm5-25cm处处的的土土约约10g10g，盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好好，标标记记，记记录

5、录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件件等等。为为使使土土样样中中微生物的数量和类型尽少变化，样品要及时分离。微生物的数量和类型尽少变化，样品要及时分离。第八页，讲稿共四十二页哦水水田田等等浸浸水水土土壤壤在在不不损损土土层层结结构构的的情情况况下下插插入入圆筒采集。或可取离地面圆筒采集。或可取离地面5 515cm15cm处的土。处的土。在在采采集集植植物物根根际际土土样样时时，一一般般是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出植植物物根根，在在无无菌菌水水中中浸浸渍渍约约20min20min，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用用无无菌菌水水漂漂洗洗下下根根部残留的土，这

6、部分即为部残留的土，这部分即为根际土样根际土样。采集工具采集工具：样本采集时所需的工具通常样本采集时所需的工具通常 有有无菌无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刮铲、土样采集器、镊子、解剖 刀、手套、刀、手套、无菌无菌小塑料袋和塑料瓶等。小塑料袋和塑料瓶等。第九页，讲稿共四十二页哦（2 2）植物体采集）植物体采集采采集集叶叶面面一一般般用用灭灭菌菌的的剪剪刀刀、打打孔孔器器、安安全全刀刀片片等等，由由几几片片新新鲜鲜叶叶片片的的同同一一部部位位切切取取一一小小块块，并并注意不要损伤周围边缘。注意不要损伤周围边缘。选选择择叶叶面面时时应应考考虑虑叶叶位位、叶叶龄龄、叶叶片片正正反反面面和和在在一片叶

7、上的取样部位。一片叶上的取样部位。采采集集植植物物根根及及根根系系时时，方方法法与与根根际际土土样样采采集集方方法法相似。采集根系时，一般与根际土样一起保存。相似。采集根系时，一般与根际土样一起保存。第十页，讲稿共四十二页哦（3 3）水样采集）水样采集水样应收集于水样应收集于100m1100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中；干净、灭菌的广口塑料瓶中；由由于于表表层层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样样时时应应在在较较深深的的静水层静水层中采集水样；中采集水样；方方法法：握握住住采采样样瓶瓶底底浸浸入入水水中中30-50cm30-50cm处处，然然后后瓶瓶口口朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让让水水

8、样样进进入入。水水样样不不应应装装满满采采样样瓶瓶。所所有有水水样样都都应应在在24h24h之之内内迅迅速速进进行行检检测测，或者或者44下贮存。下贮存。第十一页，讲稿共四十二页哦四、四、采样的注意事项采样的注意事项采样时应尽可能保持采样时应尽可能保持相对无菌相对无菌；所采集的样本必须具有某种所采集的样本必须具有某种代表性代表性；完完整整地地标标上上样样本本的的种种类类及及采采集集日日期期、地地点点以以及采集地点的地理、生态参数及采集地点的地理、生态参数等；等；应应充充分分考考虑虑采采样样的的季季节节性性和和时时间间因因素素，因因为为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；真正的原地菌群的出现可能是

9、短暂的；采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于存于44下，下，时间不宜过长时间不宜过长。第十二页，讲稿共四十二页哦1 1、营养成分、营养成分2 2、培培养养时时间间、温度、温度、pHpH3 3、抑制杂菌、抑制杂菌等一切能提高目的微生物相对生长等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。中占优势。第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养第十三页，讲稿共四十二页哦v从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种

10、选选育育的的重重要要和基础的步骤。和基础的步骤。v在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的菌菌株株；所所以以筛筛选选过过程程中中，应应及及时时调调整整检检测测方方法法，以以与与各各种种不不同同类类型型的的生生长长和和代代谢谢之微生物相适应。之微生物相适应。第三节第三节 工业微生物的常规分离工业微生物的常规分离第十四页，讲稿共四十二页哦一、一、对工业微生物的基本要求对工业微生物的基本要求 菌株应为菌株应为“纯种培养纯种培养”。镜检无其它微生物。镜检无其它微生物。且无噬菌体感染。且无噬菌体感染。菌种具稳定的遗传性。菌种具稳定的遗传性。必须能生长出

11、可再生的单位必须能生长出可再生的单位营养细胞、孢子营养细胞、孢子 种子质量好种子质量好各级种子罐的扩大培养要生长迅各级种子罐的扩大培养要生长迅速、强健。速、强健。微生物菌株是发酵生产成败的关键。微生物菌株是发酵生产成败的关键。第十五页，讲稿共四十二页哦1 1 在短时间内可获得目的产物在短时间内可获得目的产物3 3天或更短。天或更短。2 2 菌株的自我保护及采取措施菌株的自我保护及采取措施:降低降低pHpH高温生长高温生长3 3 目的产物多，且在多组分中易分离。目的产物多，且在多组分中易分离。第十六页，讲稿共四十二页哦二、含微生物样品的富集培养二、含微生物样品的富集培养v控制培养基的营养成分v控

12、制培养条件v抑制不需要的菌第十七页，讲稿共四十二页哦 从产物角度从产物角度在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 从形态的角度从形态的角度菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外外观上就可以初步识别。观上就可以初步识别。三、分离方法确定三、分离方法确定从生理的角度从生理的角度 好氧型、厌氧型好氧型、厌氧型第十八页，讲稿共四十二页哦1 1、生态学方法用于

13、培养分离中、生态学方法用于培养分离中列出所要分离的微生物类群；列出所要分离的微生物类群；根根据据所所采采集集样样本本的的各各种种生生态态参参数数，描描述述所所要要分分离离的的微微生生物物之之生生态态系系统统或或栖栖息息地地：列列出出所所要要考考察察和和测测量量的的环环境境参参数数，如如pHpH、盐盐分分、水水分分、氧氧化化还还原原电势及温度电势及温度等；等；将将样样本本分分成成若若干干类类型型，如如植植物物和和植植物物各各部部，土土壤壤(类型和土层类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；、岩石、水、昆虫和发酵食品等；列列出出生生物物系系统统中中有有用用的的自自然然底底物物，如如森森林林土土壤

14、壤中中的几丁质、葡萄表皮的果胶；的几丁质、葡萄表皮的果胶；第十九页，讲稿共四十二页哦根据上述根据上述5 5项中所获得的数据，设计分离方法，项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件汁和培养条件；用标准方法作对照来评价分离方法，根据待检用标准方法作对照来评价分离方法，根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；材料的生态参数需要，修改已知的方法；运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。义的微生物类群。第二十页，讲稿共四十二页哦2 2、生态学参数及培养基的组

15、成原则、生态学参数及培养基的组成原则部部分分分分离离培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，应应含含有有多多种种碳碳、氮氮源，如源，如几丁质、纤维素或果胶几丁质、纤维素或果胶。所有分离培养基中都应含有抗所有分离培养基中都应含有抗真菌剂真菌剂或或抗细菌制抗细菌制剂剂，浓度约为，浓度约为50g50gm1m1；琼脂平板使用前应置于琼脂平板使用前应置于3737培养箱中孵育培养箱中孵育l l、2 2天；天；培养基的生物物理学参数，如培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分及盐分也应调节也应调节到与试样的生态系统参

16、数值相近。到与试样的生态系统参数值相近。第二十一页，讲稿共四十二页哦1 分离培养微生物的常规操作分离培养微生物的常规操作分离研究微生物要在分离研究微生物要在无菌条件无菌条件下进行。下进行。防杂菌污染防杂菌污染1 操作在操作在无菌室、无菌箱、超净工作台无菌室、无菌箱、超净工作台上进行。使上进行。使 用前用用前用7075酒精棉球擦拭。酒精棉球擦拭。2 培养容器（培养容器（试管、培养皿试管、培养皿）要事先灭菌。培养时要）要事先灭菌。培养时要加盖。以防污染。加盖。以防污染。3 接种用具（接种用具（吸管、接种环吸管、接种环）要灭菌）要灭菌4 接种时塞子或盖要在火焰上过一下。接种时塞子或盖要在火焰上过一下

17、。三、菌种分离方法三、菌种分离方法第二十二页，讲稿共四十二页哦2 采样分离方法采样分离方法（1）从自然界采样分离）从自然界采样分离 培养分离培养分离挖土挖土稀释稀释 接种接种 表面向下表面向下5cm，编号记录编号记录 1000100万倍万倍 取取0.10.2ml稀释液稀释液 选用易生长发育的培养基选用易生长发育的培养基第二十三页，讲稿共四十二页哦（2）从检样分离）从检样分离可采取下列方法从检样可采取下列方法从检样直接分离菌株直接分离菌株A A 把把检样土检样土直接混合到预先融化的固体培养基中培养。直接混合到预先融化的固体培养基中培养。B B 取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中。取稀释后检样

18、的上清液混合到固体培养基中。C C 把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体培把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体培养基。养基。D D 将土样连续几次在液体培养基中富集培养后，接入固体将土样连续几次在液体培养基中富集培养后，接入固体培养基中分离。培养基中分离。第二十四页，讲稿共四十二页哦E组织分离法组织分离法一般有病组织分离法消毒冲洗放在培养基上分离单一菌落食用菌孢子分离法 多孢子分离法 单孢子分离法第二十五页，讲稿共四十二页哦3 3 微生物的接种培养方法微生物的接种培养方法（1）稀释平板培养法（定性、定量）稀释平板培养法（定性、定量）加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培

19、加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培养养对绝对厌氧菌的对绝对厌氧菌的辅助措施辅助措施培养用培养箱要预先培养用培养箱要预先去除氧并密闭去除氧并密闭第二十六页，讲稿共四十二页哦加还原剂（p72)加入半胱氨酸、维生素C、硫化钠等焦性没食子酸法平皿厌氧培养法试管厌气培养法玻璃板隔绝空气培养法生物吸氧法第二十七页，讲稿共四十二页哦（2）厌氧菌的稀释）厌氧菌的稀释转动分离转动分离培养法培养法琼脂试管加热溶解冷却至琼脂试管加热溶解冷却至5050（保持（保持液态液态），），接种接种一支一支试管，试管，转动混合转动混合后取出后取出1/101/10接接入第二支试管，转动混合后再入第二支试管，转动混合后再取出

20、取出1/101/10接入第三支试管，接入第三支试管，依依次类推次类推，连续接种，连续接种6 61010支支。冷。冷却凝固。在琼脂培养基表面倾注却凝固。在琼脂培养基表面倾注一层一层无菌石蜡无菌石蜡，防止空气中的，防止空气中的氧气进入。氧气进入。第二十八页，讲稿共四十二页哦4 4 纯化分离菌种的方法纯化分离菌种的方法挑取首批菌落挑取首批菌落菌悬液菌悬液无菌稀释液稀释无菌稀释液稀释接种到培养皿培养接种到培养皿培养重复上述步骤重复上述步骤单孢子分离单孢子分离稀释转动培养稀释转动培养挑取一个菌落挑取一个菌落取一部分取一部分观察。必要时观察。必要时所有操作所有操作在无菌条在无菌条件下进行件下进行第二十九页

21、，讲稿共四十二页哦第四节第四节 有用微生物的筛选有用微生物的筛选筛选有用微生物是工业生产过程的筛选有用微生物是工业生产过程的第一步第一步。筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用特特定定的操作程序分离并发现有用的微生物的操作程序分离并发现有用的微生物。一一 初筛初筛二二 复筛复筛三三 抗菌谱的测定抗菌谱的测定第三十页，讲稿共四十二页哦（一）初（一）初 筛筛目的目的：得到具有：得到具有潜在应用价值潜在应用价值的目的微生物。的目的微生物。初筛初筛：一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生：一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选出来。物

22、淘汰，把少量有用的微生物筛选出来。要求要求：快速快速有预测或预见有预测或预见 敏捷敏捷迅速处理好众多的样品。迅速处理好众多的样品。经济经济得到有广泛目标的有用微生物。得到有广泛目标的有用微生物。第三十一页，讲稿共四十二页哦筛选方法筛选方法琼脂平板培养基上培养生产出群体琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛。后初筛。1 1、用、用pHpH指示剂检测有无有机酸或胺类。指示剂检测有无有机酸或胺类。中性麝香草酚蓝中性麝香草酚蓝:pHpH6.06.0黄黄,pH pH 7.67.6蓝蓝,pH6.0-7.0pH6.0-7.0绿绿2 2、在培养基中加入、在培养基中加入碳酸钙检测有机酸碳酸钙检测有机酸。可在菌群周

23、围。可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。形成清晰的碳酸钙溶解区。3 3、在培养基中加入、在培养基中加入底物底物检测检测细胞外酶、酶抑制剂细胞外酶、酶抑制剂等特定等特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应对特的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应对特定底物形成溶解或沉淀。定底物形成溶解或沉淀。第三十二页，讲稿共四十二页哦4 各种抗生素产生菌的初筛各种抗生素产生菌的初筛（1）有代表性的常用试验菌（部分是病原菌）有代表性的常用试验菌（部分是病原菌）细菌细菌真菌真菌原虫原虫革兰氏革兰氏阴性菌阴性菌革兰氏革兰氏阳性菌阳性菌金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌枯枯草草杆杆菌菌八八叠叠球球菌菌肺肺炎炎双双

24、球球菌菌产产气气杆杆菌菌大大肠肠杆杆菌菌痢痢疾疾杆杆菌菌普普通通变变形形杆杆菌菌黑黑曲曲霉霉产产黄黄青青霉霉烟烟曲曲霉霉菌菌白白色色念念珠珠痢痢疾疾阿阿米米巴巴球球虫虫第三十三页，讲稿共四十二页哦（2）各种抗生素产生菌的初筛）各种抗生素产生菌的初筛采用抑菌圈法，亦称平板扩散法、杯碟法采用抑菌圈法，亦称平板扩散法、杯碟法方法方法培养菌液培养菌液溶化的琼脂溶化的琼脂48混合混合倒平板倒平板放检样杯碟放检样杯碟培养培养无菌操作无菌操作有抑菌圈为阳有抑菌圈为阳性反应性反应第三十四页，讲稿共四十二页哦（二）（二）复复 筛筛 微生物初筛鉴定微生物初筛鉴定 发酵培养基的选择发酵培养基的选择 培养与发酵培养与

25、发酵 抽提试验抽提试验第三十五页，讲稿共四十二页哦1、微生物初筛鉴定、微生物初筛鉴定 对初筛菌株进行分类对初筛菌株进行分类何属？何种何属？何种？目的：预知微生物对人、动物或植物是目的：预知微生物对人、动物或植物是 否有致病性。否有致病性。或进行毒理实验，最短或进行毒理实验，最短3月，长达月，长达 2-5年年 但分类复杂。以前轻易不作。但分类复杂。以前轻易不作。第三十六页，讲稿共四十二页哦放线菌放线菌细菌细菌霉菌霉菌植物病原菌植物病原菌碳源：葡萄糖、淀碳源：葡萄糖、淀粉、糊精、蔗糖、粉、糊精、蔗糖、麦芽糖麦芽糖葡萄糖、柠葡萄糖、柠檬酸钠檬酸钠乳糖、葡乳糖、葡萄糖、蔗萄糖、蔗糖糖葡萄糖、蔗葡萄糖、

26、蔗糖糖氮源：大豆粉、蛋氮源：大豆粉、蛋白胨、牛肉膏、玉白胨、牛肉膏、玉米浆、硝酸铵米浆、硝酸铵肉汤、蛋白肉汤、蛋白胨、豆饼粉、胨、豆饼粉、酵母膏、硫酵母膏、硫酸铵酸铵玉米浆、玉米浆、蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨无机盐：氯化钠、无机盐：氯化钠、碳酸钙、磷酸氢二碳酸钙、磷酸氢二钾钾氯化钠、磷氯化钠、磷酸氢二钾、酸氢二钾、锰、铁锰、铁磷酸氢二磷酸氢二钾、锰、钾、锰、铁铁磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾、锰、铁锰、铁2 发酵培养条件及培养基的选择发酵培养条件及培养基的选择第三十七页，讲稿共四十二页哦3 3 培养与发酵培养与发酵（1 1）试管培养）试管培养 试管摇床培养。常用。试管摇床培养。常

27、用。目的：原种斜面培养后，为了提高初筛目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。效率。（2 2）摇瓶培养（摇瓶发酵）摇瓶培养（摇瓶发酵）250 250或或500500mlml锥形瓶再锥形瓶再200200rpmrpm摇床上培养。摇床上培养。目的：培养基和培养条件的初筛。目的：培养基和培养条件的初筛。第三十八页，讲稿共四十二页哦（3 3）玻璃自控发酵罐）玻璃自控发酵罐 容量容量5 55050L L。是摇床向发酵罐的过渡阶段。是摇床向发酵罐的过渡阶段。目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。（4 4）试验罐培养）试验罐培养 中间工业试验阶段中间工业试验阶段 目的：放

28、大和验证摇床试验结果，积累发酵工目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规律和发酵参数。为工业规模生产打基础艺规律和发酵参数。为工业规模生产打基础第三十九页，讲稿共四十二页哦发酵试验的四个阶段发酵试验的四个阶段第四十页，讲稿共四十二页哦4 4 抽提试验抽提试验采取适当方法把发酵的目的代谢产物抽提采取适当方法把发酵的目的代谢产物抽提出来。出来。有四种方法：有四种方法：1 溶媒抽提溶媒抽提 2 用活性炭抽提用活性炭抽提 3 用树脂吸附洗脱用树脂吸附洗脱 4 从菌丝体浸出抽提从菌丝体浸出抽提第四十一页，讲稿共四十二页哦例：新抗生素的抽提试验例：新抗生素的抽提试验发酵液发酵液过滤、分离（离心）过滤、分离（离心）4 菌丝体菌丝体浸出抽提浸出抽提水抽提水抽提甲醇抽提甲醇抽提过滤过滤过滤、蒸发过滤、蒸发抗菌活性试验抗菌活性试验甲醇浓缩液甲醇浓缩液清液（滤液）清液（滤液）1 在不同在不同PH条件下向溶媒转移条件下向溶媒转移2 活性炭吸附洗脱活性炭吸附洗脱溶出洗脱溶出洗脱3 树脂吸附洗脱树脂吸附洗脱酸碱溶媒洗脱酸碱溶媒洗脱抗性活性试验抗性活性试验第四十二页，讲稿共四十二页哦