沙门菌的检验技术集大.ppt

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1、沙门菌的检验技术集大现在学习的是第1页，共44页是一大群寄生于动物肠道内生化反应和抗原构造是一大群寄生于动物肠道内生化反应和抗原构造相似的相似的革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌一、沙门氏菌生物学特性一、沙门氏菌生物学特性现在学习的是第2页，共44页国内外沙门菌检测方法（传统方法）国家标准国家标准(GB4789.4-2010:食品微生物学检验沙门氏菌检验食品微生物学检验沙门氏菌检验)行业标准（行业标准（SN0170-1992出口食品沙门氏菌属出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌包括亚利桑那菌)检验方法检验方法）FDA（Food&DrugAdministration）AOAC(Associationof

2、OfficialAnalyticalChemists)FSIS（FOODSAFETYANDINSPECTIONSERVICE）ISO加拿大官方食品微生物分析方法加拿大官方食品微生物分析方法 现在学习的是第3页，共44页标本采集标本采集增菌培养增菌培养肠道选择性培养基分离培养肠道选择性培养基分离培养革兰染色革兰染色生化反应生化反应取可疑菌落取可疑菌落血清学鉴定血清学鉴定食品中沙门氏菌检测的基本程序食品中沙门氏菌检测的基本程序现在学习的是第4页，共44页沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验三糖铁（TSI）尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）现在学习的是第5页，共44页沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验

3、吲哚试验阴性（液面黄）阳性（液面红）VP试验 阳性（红色）阴性（不变）现在学习的是第6页，共44页沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验赖氨酸脱羧酶试验对照 阳性（紫）阴性（黄）丙二酸盐试验阳性（兰）阴性（不变）现在学习的是第7页，共44页ONPG试验阳性（黄）空白沙门菌常用生化试验现在学习的是第8页，共44页冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法前增菌法25gBPW225mL36 1 一般4h，干蛋品18h24h10mLMM（或（或TTB）100mL10mLSC100mL直接增菌法直接增菌法2

4、5g灭菌生理盐水灭菌生理盐水25mL检样匀液检样匀液25mL MM（或（或TTB）100mL检样匀液检样匀液25mL SC100mLBSDHL（或（或HE、WS、SS）TSI（排除（排除A/A H2S结果结果），靛基质，尿素，靛基质，尿素，KCN，赖氨酸，赖氨酸沙门氏菌血清学试验沙门氏菌血清学试验甘露醇 山梨醇H2S 靛靛 尿尿KCN 赖赖H2S 靛靛 尿尿KCN 赖赖/非如左述的各种反应结果非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验沙门氏菌血清学试验 ONPG 沙门氏菌沙门氏菌非沙门氏菌非沙门氏菌42 18h24h36 1 18h24h42 18h24h36 1 18h24h36 1 40h4

5、8h36 1 18h24h微生物学检验微生物学检验沙门氏菌检验沙门氏菌检验中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-2010现在学习的是第9页，共44页l前增菌：使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞恢复前增菌：使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞恢复活力活力l未经加工过的食品，检验前不需要前增菌未经加工过的食品，检验前不需要前增菌前增菌：前增菌：25克（加工食品）克（加工食品）+225毫升毫升缓冲蛋白胨水缓冲蛋白胨水 37度培养度培养4小时（干蛋品小时（干蛋品1824小时）。小时）。（一）前增菌（一）前增菌现在学习的是第10页，共44页选择性增菌选择性增菌l含选择性抑制剂含选择

6、性抑制剂l1：1稀释液而不是稀释液而不是1：10，提高检出率，提高检出率增菌：移取增菌：移取10毫升接种于毫升接种于100mL的增菌液中。氯化镁的增菌液中。氯化镁孔雀绿（孔雀绿（MM）或四硫酸钠煌绿（）或四硫酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱）、亚硒酸盐胱氨酸（氨酸（SC）。）。一种增菌剂不可能适合所有的沙门菌，所以，要同一种增菌剂不可能适合所有的沙门菌，所以，要同时使用两种以上的培养基增菌时使用两种以上的培养基增菌现在学习的是第11页，共44页（二）分离培养（二）分离培养最适生长温度为最适生长温度为3537，最适最适pH值为值为6.87.8。选择性琼脂平板：选择性琼脂平板：BS培养基（亚硫酸铋琼

7、脂）、培养基（亚硫酸铋琼脂）、DHL琼琼脂、脂、HE（海克顿肠内琼脂培养基）或（海克顿肠内琼脂培养基）或WS琼脂、琼脂、SS琼琼脂。脂。BS最适合，但为提高检出率，需要使用一个最适合，但为提高检出率，需要使用一个BS培养基，培养基，同时再用另一个同时再用另一个DHL、HE、SS或或 WS现在学习的是第12页，共44页选择琼脂平板沙门氏菌、沙门氏菌（即亚利桑那菌）亚硫酸琼脂(BS琼脂)产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。黑色有金属光泽DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色。乳糖迟缓阳性

8、或阴性的菌株与沙门氏菌、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色。HE琼脂WS琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色。乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色。SS琼脂 无色半透明，产硫化氢菌株有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显.乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与沙门氏菌、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠艾希氏菌不能区分.现在学习的是第13页，共44页lSS平板平板l分离肠道致病菌的强选择培养基分离肠道致病菌的强选择培养基lSS平板组成平板组成l基础培养基基础培养基乳糖乳糖抑制

9、剂抑制剂(胆盐、枸橼酸钠、胆盐、枸橼酸钠、0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液)指示剂指示剂(中性红中性红)lSS平板上肠道细菌的生长现象平板上肠道细菌的生长现象l肠道致病菌：不分解乳糖，菌落无色或淡黄色肠道致病菌：不分解乳糖，菌落无色或淡黄色l肠道非致病菌：分解乳糖产酸，菌落呈红色肠道非致病菌：分解乳糖产酸，菌落呈红色肠道菌选择性培养基分离培养肠道菌选择性培养基分离培养现在学习的是第14页，共44页l分离培养分离培养l取增菌液划线接种于取增菌液划线接种于SS琼脂平板，于琼脂平板，于37培养培养1824h，观察菌落特征，观察菌落特征l肠道致病菌在肠道致病菌在SS平板上的菌落特征平板上的菌落特征l沙门氏

10、菌形成不发酵乳糖菌落沙门氏菌形成不发酵乳糖菌落l无色透明，光滑湿润、边缘整齐菌落无色透明，光滑湿润、边缘整齐菌落现在学习的是第15页，共44页发酵乳糖菌落发酵乳糖菌落(大肠杆菌菌落）大肠杆菌菌落）不发酵乳糖菌落不发酵乳糖菌落（肠道致病菌菌落）肠道致病菌菌落）SS培养基平板分离培养基平板分离现在学习的是第16页，共44页革兰染色革兰染色沙门氏菌：革兰阴性杆菌沙门氏菌：革兰阴性杆菌现在学习的是第17页，共44页（三）五项生化试验（三）五项生化试验1、三糖铁琼脂试验、三糖铁琼脂试验2、靛基质试验（吲哚试验）、靛基质试验（吲哚试验）3、尿素酶试验、尿素酶试验4、氰化钾试验（、氰化钾试验（KCN）5、赖

11、氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验现在学习的是第18页，共44页1、三糖铁琼脂、三糖铁琼脂(TSI)成分成分蛋白胨蛋白胨20.0g牛肉膏牛肉膏3.0g乳乳糖糖10.0g蔗糖蔗糖10.0g葡萄糖葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵硫酸亚铁铵(含含6个结晶水个结晶水)0.5g酚红酚红0.025g或或5g/L溶液溶液5mL氯化钠氯化钠5.0g硫代硫酸钠硫代硫酸钠0.5g琼脂琼脂12.0g蒸馏水蒸馏水1000.0mL现在学习的是第19页，共44页TSI生化原理生化原理斜面部分暴露于空气中，为有氧环境。而下部斜面部分暴露于空气中，为有氧环境。而下部与空气隔绝是相对厌氧的环境。因此与空气隔绝是相对厌氧的环境。因此TSI

12、时，时，最重要的是斜面部分和管下部琼脂的长度最重要的是斜面部分和管下部琼脂的长度，两，两者均为者均为3cm，以保证两部分相对应的有氧或，以保证两部分相对应的有氧或厌氧环境。厌氧环境。现在学习的是第20页，共44页测试时使用接种针测试时使用接种针先穿刺至底部先穿刺至底部，而后于斜面，而后于斜面作划线接种作划线接种，经培养经培养18-2418-24小时后，依情况判断糖类发酵情形。小时后，依情况判断糖类发酵情形。现在学习的是第21页，共44页观察结果：有三种类型观察结果：有三种类型A.非发酵型：无碳氢化合物发酵，所以无酸产生，非发酵型：无碳氢化合物发酵，所以无酸产生，斜面上琼脂的肽降解产物是碱性物质

13、导致斜面斜面上琼脂的肽降解产物是碱性物质导致斜面变红。这种类型的细菌称为非发酵型。变红。这种类型的细菌称为非发酵型。现在学习的是第22页，共44页B.非乳糖发酵型非乳糖发酵型:如果接种的是发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，如果接种的是发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，培养基内仅有培养基内仅有0.1%葡萄糖可以产酸。开始阶段，培养葡萄糖可以产酸。开始阶段，培养8-12h时，产生的酸足以引起斜面和底部颜色变成黄色。时，产生的酸足以引起斜面和底部颜色变成黄色。在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分的细斜面部分的细菌在有氧条件下开始氧化降解氨基酸，产生的胺类很快菌在有氧条

14、件下开始氧化降解氨基酸，产生的胺类很快就中和斜面上存在的酸就中和斜面上存在的酸；到；到18-24h，整个斜面又转换成碱，整个斜面又转换成碱性性PH，颜色有变成红色。深部（厌氧区域），氨基酸，颜色有变成红色。深部（厌氧区域），氨基酸降解不足以中和形成的酸，培养基仍为黄色。降解不足以中和形成的酸，培养基仍为黄色。现在学习的是第23页，共44页C.乳糖（蔗糖）发酵型乳糖（蔗糖）发酵型 现在学习的是第24页，共44页三糖铁（三糖铁（TSI）试验）试验l肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，可发酵葡萄糖产可发酵葡萄糖产酸。酸。l利用糖类发酵之不同与硫化氢产生与否，加以区分。利用糖类发酵之不

15、同与硫化氢产生与否，加以区分。l三糖铁琼脂斜面培养基含有三糖铁琼脂斜面培养基含有11乳糖及蔗糖与乳糖及蔗糖与0.10.1葡萄葡萄糖糖作为发酵基质，且以作为发酵基质，且以酚红作为酸碱指示剂酚红作为酸碱指示剂，如培养基由，如培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵橘红转为黄色，表示有糖类发酵现在学习的是第25页，共44页三糖铁（三糖铁（TSI）琼脂试验）琼脂试验本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但

16、因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。a.uninoculatedb.littlechange/alkaline/-/-c.alkaline/acid/-/+d.acid/acid/+/+e.acid/acid/+/-slant color/butt color/gas production/hydrogen sulfide production现

17、在学习的是第26页，共44页现在学习的是第27页，共44页制好的培养制好的培养基基对照管对照管斜面红色，斜面红色，底面黄色底面黄色培养基全黄色培养基全黄色斜面、底斜面、底部黄色，部黄色，并产生并产生H2S斜面红色，底部黑色，斜面红色，底部黑色，产生产生H2S底面黄色，并产生底面黄色，并产生CO2现在学习的是第28页，共44页（1 1）斜面碱性（红色）斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色）底部酸性（黄色+）产气）产气或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，但因

18、葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸立变黄，但因葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸立即氧化而呈碱性反应，同时培养基中的蛋白质也随即氧化而呈碱性反应，同时培养基中的蛋白质也随之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故仍维持酸性反应。生物生长较慢，故仍维持酸性反应。（2 2）斜面酸性（黄色）斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色）底部酸性（黄色+）产气或）产气或不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持培养基斜

19、面与底部保持酸性反应。可维持培养基斜面与底部保持酸性反应。现在学习的是第29页，共44页（3 3）斜面碱性（红色）斜面碱性（红色-）底部碱性（红色）底部碱性（红色-）或无变化）或无变化（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。为使结果准确，应于接种培养为使结果准确，应于接种培养18-2418-24小时内观察结果，小时内观察结果，以确保糖类尚

20、未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产以确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产生。生。现在学习的是第30页，共44页培养基变黑培养基变黑（4 4）三糖铁琼脂培养基中亦含）三糖铁琼脂培养基中亦含有硫代硫酸钠有硫代硫酸钠若微生物有硫化氢产生，会与若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变亚铁之沉淀，进而使培养基变黑。黑。现在学习的是第31页，共44页肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种/沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌/沙门氏菌、弗劳

21、地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属/大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌注：阳性；阴性；/多数阳性，少数阴性现在学习的是第32页，共44页肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果A1沙门氏菌属A2沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌A3弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌A4普通变形杆菌B1沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副

22、伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3/克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4/摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注2：KCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注3：表示阳性；表示阴性；/表示多数阳性，少数阴性。现在学习的是第33页，共44页2、靛基质（吲哚）试验、靛基质（吲哚）试验阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）现在学习的是第34页，共44页3、尿素酶试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）阴性（黄）阳性（红）现在学习的是第35页

23、，共44页5、赖氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验 对照对照 阳性（紫）阳性（紫）阴性（黄）阴性（黄）4、氰化钾试验、氰化钾试验 “浑浊浑浊”为为“+”现在学习的是第36页，共44页ONPG试验试验阳性（黄）阳性（黄）空白空白丙二酸盐试验丙二酸盐试验阳性（兰）阳性（兰）阴性（不变）阴性（不变）现在学习的是第37页，共44页沙门氏菌O多价血清凝集试验 左为阳性 右为阴性对照 3/3血清学试验结果血清学试验结果现在学习的是第38页，共44页结果报告结果报告l凡血清学鉴定与生化反应均符合沙门氏菌者凡血清学鉴定与生化反应均符合沙门氏菌者l报告：报告：食品食品25g25g检出沙门氏菌检出沙门氏菌l反之则报

24、告：反之则报告：食品食品25g25g未检出沙门氏菌未检出沙门氏菌现在学习的是第39页，共44页 出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法 肉类、蛋品肉类、蛋品缓冲胨水（缓冲胨水（BPW）四硫磺酸盐煌绿（四硫磺酸盐煌绿（TTB）亚硒酸盐胱氨酸（亚硒酸盐胱氨酸（SC）37 4h or 2024h直接选择性增菌亚硒酸盐胱氨酸（亚硒酸盐胱氨酸（SC）四硫磺酸盐煌绿（四硫磺酸盐煌绿（TTB）37 24 2h BS&DHL (亚利桑那菌琼脂亚利桑那菌琼脂)前增菌37 2448h TSI&赖氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶TSI&尿素酶尿素酶 37 2448h生化试验生化试验血清学试验（血清学试验（“O”抗原，抗

25、原，“Vi”抗原）抗原）42 20 2h 37 2448h结果判定结果判定检验检疫行业标准检验检疫行业标准SN017092现在学习的是第40页，共44页 样品（样品（20类）类）25g225mL 乳糖肉汤（乳糖肉汤（LB）or 胰酪胨大豆肉汤（胰酪胨大豆肉汤（TSB）or 煌绿溶液煌绿溶液（BG）or通用前增菌肉汤（通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（营养肉汤（NB）or 再造脱脂奶粉再造脱脂奶粉 or 四硫酸盐煌绿（四硫酸盐煌绿（TT）pH6.80.2 242 h 35RVTT 430.2 or 352.0 242h 242h 420.2BS&XLD&HE 242h 35TSI&LIA非沙

26、门菌非沙门菌沙门菌沙门菌非沙门菌非沙门菌LIA+LIA TSI K/ALIA TSI A/A&尿素酶，尿素酶，H抗原（多价抗原（多价H抗血清或抗血清或Spicer-Edwards flagellar(H)test），赖氨酸脱羧酶，），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），丙二酸盐，吲哚），O抗原抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MRVP,西蒙氏柠檬酸盐西蒙氏柠檬酸盐5种商业生化鉴定系统（API 20E,Enterotube II,Enterobacteriaceae II,MICRO-ID,or Vitek G

27、NI）&O抗原&H抗原细菌学分析手册（细菌学分析手册（FDA/BAM）第五章第五章沙门菌属沙门菌属现在学习的是第41页，共44页肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定USDA/FSIS MLG 4.02样品样品BPW or BPW（含结晶紫）（含结晶紫）351 20-24hBGS&DMLIA or XLT442 0.5 2224h0.5 0.05mL10mL TT0.1 0.02mL0.1 0.02mL10mL mRV10mL mRV42 0.5 2224h35 1 1824h&48hTSI&LIA血清学试验血清学试验商业生化试剂盒或自动鉴定系统商业生化试剂盒或自动鉴

28、定系统 or传统生化鉴定（传统生化鉴定（AOAC Official Method 967.27 or Edwards and Ewings Identification of Enterobacteriaceae）报告结果报告结果现在学习的是第42页，共44页肉制品中沙门菌的分离和鉴定肉制品中沙门菌的分离和鉴定FDA&USDA/FSIS乳糖肉汤缓冲蛋白胨水TTB肉汤RV肉汤TTB肉汤RV肉汤BSXLDHEXLT42倍改良LIABGS生化筛选（LIA,TSI）鉴定及确证试验 葡萄糖 脲酶试验 卫矛醇 动力试验 吲哚 MR-VP测试 氰化钾 粉红酒石酸盐琼脂 乳糖 水杨苷 赖氨酸脱羧酶 西蒙氏枸橼

29、酸盐 丙二酸 蔗糖血清学试验现在学习的是第43页，共44页AOAC沙门菌检测方法AOAC Official Method 967.25Salmonella in FoodsPreparation of Culture Media and ReagentsAOAC Official Method 967.26Salmonella in Processed FoodsDetectionAOAC Official Method 967.27Salmonella in FoodsIdentificationAOAC Official Method 967.28Salmonella in FoodsSerological Tests现在学习的是第44页，共44页