水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法 (2).ppt

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1、水解酶及氧化还原酶组织化学水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法原理及方法现在学习的是第1页，共41页磷酸酶类磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联 而显色。而显色。碱性磷酸酶：在碱性磷酸酶：在pH9.2-9.4表现为最大活性表现为最大活性酸性磷酸酶：在酸性磷酸酶：在pH5.0显示最大活性显示最大活性显示法：显示法：金属沉淀法金属沉淀法偶氮耦联法偶氮耦联法现在学习的是第2页，共41页碱性磷酸酶碱性磷酸酶alkalin

2、e phosphatase,AKP、ALP在碱性范围，催化各种醇和酚的磷酸酯水解在碱性范围，催化各种醇和酚的磷酸酯水解。磷酸和磷酸和R能用组化方法捕获。能用组化方法捕获。钙钴法：捕获磷酸钙钴法：捕获磷酸偶氮耦联法：当偶氮耦联法：当R为萘酚衍生物时，捕获为萘酚衍生物时，捕获R二者最终均形成有色沉淀，可作定位观察。二者最终均形成有色沉淀，可作定位观察。现在学习的是第3页，共41页激活：金属离子激活：金属离子Mg2+、Mn 2+、Zn 2+、Co 2+抑制抑制：Tetramisol(四咪唑四咪唑)、各种醇类、各种醇类、L-半胱氨酸半胱氨酸现在学习的是第4页，共41页钙钴法钙钴法（金属沉淀技术金属沉淀

3、技术）Gomori-Takamatus法原理：把游离的磷酸变为盐的形式从而产生原理：把游离的磷酸变为盐的形式从而产生沉淀沉淀-甘油磷酸钠（底物）甘油磷酸钠（底物）磷酸离子磷酸离子磷酸离子磷酸离子+Ca2+磷酸钙（不可见）磷酸钙（不可见）磷酸钙磷酸钙+Co2+磷酸钴（不可见）磷酸钴（不可见）磷酸钴磷酸钴+S2-硫化钴（不溶，可见）硫化钴（不溶，可见）条件：条件：pH9.4AKP现在学习的是第5页，共41页作用液：作用液：2%巴比妥钠巴比妥钠3%-甘油磷酸钠甘油磷酸钠2%无水氯化钙无水氯化钙2%MgSO4.7H2O现在学习的是第6页，共41页步骤步骤：新鲜恒冷箱切片，新鲜恒冷箱切片，8不固定直接进

4、作用液不固定直接进作用液FCa（氯化钙（氯化钙Formalin）固定）固定5-2h，4，固定后，固定后蒸馏水洗蒸馏水洗作用液作用液10-60，37（视组织而定视组织而定）流水流水52%硝酸钴硝酸钴5蒸馏水洗蒸馏水洗1-2%硫化铵硫化铵1（*硫化铵需新鲜配制硫化铵需新鲜配制）蒸馏水洗蒸馏水洗甘油明胶封甘油明胶封 现在学习的是第7页，共41页结果：结果：黑色的颗粒状沉淀黑色的颗粒状沉淀对照：对照：去底物（以双蒸水替代去底物（以双蒸水替代-甘油磷酸钠），结果阴甘油磷酸钠），结果阴性性进作用液前用抑制剂抑制酶或将切片置沸水中使进作用液前用抑制剂抑制酶或将切片置沸水中使酶失活酶失活注意：组织内含铁血黄素

5、与钙盐形成棕黑色注意：组织内含铁血黄素与钙盐形成棕黑色沉淀，应鉴别（铁反应）沉淀，应鉴别（铁反应）现在学习的是第8页，共41页AKP主要存在于主要存在于物质交换活跃处：肠上皮和肾近曲小管的物质交换活跃处：肠上皮和肾近曲小管的刷状刷状缘缘、肝毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉、肝毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部的部的内皮内皮内质网、高尔基复合体、吞饮小泡肠上皮的溶内质网、高尔基复合体、吞饮小泡肠上皮的溶酶体、中性粒细胞的中性颗粒，平滑肌细胞膜酶体、中性粒细胞的中性颗粒，平滑肌细胞膜是细胞膜的标志酶之一是细胞膜的标志酶之一骨肉瘤内有丰富的骨肉瘤内有丰富的AKP现在学习的是第9页，共41页偶氮耦

6、联法偶氮耦联法原理：磷酸萘酯经酶水解放出萘酚，立刻原理：磷酸萘酯经酶水解放出萘酚，立刻为重氮盐捕获而成为有色不溶的偶氮染料。为重氮盐捕获而成为有色不溶的偶氮染料。-萘酚磷酸钠萘酚磷酸钠 -萘酚萘酚 -萘酚萘酚 重氮盐重氮盐（固蓝（固蓝RR）偶氮染料偶氮染料现在学习的是第10页，共41页Lojga改良改良Burstone偶氮耦联法偶氮耦联法作用液作用液 萘酚萘酚AS-SI磷酸钠磷酸钠 DMSO(二甲基亚砜二甲基亚砜)六偶氮对品红六偶氮对品红A液：盐酸对品红液：盐酸对品红400mg，蒸馏水，蒸馏水8ml，浓盐酸，浓盐酸(36%)2ml 混合溶解过滤混合溶解过滤B液：液：4亚硝酸钠液亚硝酸钠液临用前

7、临用前A、B液等量混合液等量混合Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH 8.29.2）现在学习的是第11页，共41页步骤：步骤：小块组织用液氮骤冷，恒冷箱切片小块组织用液氮骤冷，恒冷箱切片固定固定FCa 5分钟，分钟，4，固定后蒸馏水洗，固定后蒸馏水洗不固定不固定作用液作用液5-60，37或室温或室温蒸馏水洗蒸馏水洗4%甲醛固定甲醛固定15-2h，室温，室温自来水洗，蒸馏水洗自来水洗，蒸馏水洗1%甲基绿（氯仿洗过）甲基绿（氯仿洗过）5-10分钟，蒸馏水洗分钟，蒸馏水洗（1）甘油明胶封）甘油明胶封（2）丙酮）丙酮-丙酮甲苯丙酮甲苯-甲苯甲苯-DPX封封结果：结果：酶活动处出现红色无定形的沉淀，核呈

8、蓝绿色，酶活动处出现红色无定形的沉淀，核呈蓝绿色，对比明显对比明显*重氮盐也可用固蓝重氮盐也可用固蓝B盐盐,这种酶的反应活性部为紫黑这种酶的反应活性部为紫黑色，核的对比染色应改用核固红或中性红。色，核的对比染色应改用核固红或中性红。现在学习的是第12页，共41页钙钴法和偶氮耦联法比较钙钴法和偶氮耦联法比较钙钴法操作简单，但会出现假阳性现象钙钴法操作简单，但会出现假阳性现象偶氮耦联法的保温时间短，方法比较灵敏；偶氮耦联法的保温时间短，方法比较灵敏；在正常组织中无萘酚，不会出现假阳性，故在正常组织中无萘酚，不会出现假阳性，故不需对照切片；反应产物为偶氮染料，较磷不需对照切片；反应产物为偶氮染料，较

9、磷酸钙更难溶解，定位好，不易扩散，图象清酸钙更难溶解，定位好，不易扩散，图象清晰，并可控制反应深度晰，并可控制反应深度 现在学习的是第13页，共41页酸性磷酸酶酸性磷酸酶（ACP）ACP是在酸性范围里水解磷酸单酯，游离出是在酸性范围里水解磷酸单酯，游离出磷酸的酶磷酸的酶最适最适pH为为4.5-5.5 ACPACP现在学习的是第14页，共41页Gomori 铅法铅法作用原理同作用原理同AKP。因磷酸钙在酸性。因磷酸钙在酸性pH溶解，故用硝溶解，故用硝酸铅作为捕获剂，再用硫化氢直接把磷酸铅转变为酸铅作为捕获剂，再用硫化氢直接把磷酸铅转变为硫化铅，最后形成棕黑色硫化铅沉淀。硫化铅，最后形成棕黑色硫化

10、铅沉淀。激活剂：激活剂：Mn2抑制剂：氟化钠、磷酸根离子抑制剂：氟化钠、磷酸根离子对照：去底物；抑制酶对照：去底物；抑制酶现在学习的是第15页，共41页作用液作用液巴比妥醋酸缓冲液（巴比妥醋酸缓冲液（PH5.0）20ml3%-甘油磷酸钠甘油磷酸钠2ml硝酸铅硝酸铅 24mg用巴比妥醋酸缓冲液溶解硝酸铅，然后再加入用巴比妥醋酸缓冲液溶解硝酸铅，然后再加入3%-甘油磷酸钠，彻底混合后过滤，再测定其甘油磷酸钠，彻底混合后过滤，再测定其PH值，如不足或高于，都应调校至值，如不足或高于，都应调校至5.0。现在学习的是第16页，共41页步骤步骤恒冷箱冷冻切片，附贴于硅化载玻片上，电吹风吹干恒冷箱冷冻切片，

11、附贴于硅化载玻片上，电吹风吹干30分钟分钟后，用纯丙酮固定后，用纯丙酮固定5-10分钟。分钟。蒸馏水轻洗。蒸馏水轻洗。将切片于作用液中孵育将切片于作用液中孵育30-120分钟（分钟（37）。）。蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗1分钟。分钟。1%冰醋酸水溶液浸洗冰醋酸水溶液浸洗30秒钟。秒钟。蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗1分钟。分钟。1%硫化铵水溶液处理硫化铵水溶液处理1分钟。分钟。流水冲洗后再入蒸馏水洗。流水冲洗后再入蒸馏水洗。核固红染核核固红染核5分钟。分钟。流水洗流水洗5-10分钟。分钟。常规脱水、透明并封固。常规脱水、透明并封固。结果：细胞核红色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色。结果：细胞核红色，酸性磷酸

12、酶活性部位呈棕黄至棕黑色。现在学习的是第17页，共41页偶氮耦联法偶氮耦联法作用原理同作用原理同AKP。因为许多重氮盐在因为许多重氮盐在pH5.0时，不能与时，不能与-萘酚偶联；或萘酚偶联；或在在pH5.5时虽可偶联，但水解的速度大于耦联速度时虽可偶联，但水解的速度大于耦联速度而造成弥散。而萘酚而造成弥散。而萘酚AS-BI磷酸钠，与六偶氮对品红磷酸钠，与六偶氮对品红偶联，反应产物不溶，可获得正确的定位，鲜红色沉偶联，反应产物不溶，可获得正确的定位，鲜红色沉淀表明酶活性的位置。淀表明酶活性的位置。经氯仿提取过的甲基绿为理想的复染染料，选择性地染胞经氯仿提取过的甲基绿为理想的复染染料，选择性地染胞

13、核，而不影响反应产物的颜色。核，而不影响反应产物的颜色。现在学习的是第18页，共41页ACP分布极广，遍布各组织分布极广，遍布各组织主要存在于细胞的溶酶体内，为溶酶体标志酶主要存在于细胞的溶酶体内，为溶酶体标志酶内质网，胞质内质网，胞质骨巨细胞瘤内有丰富的骨巨细胞瘤内有丰富的ACP现在学习的是第19页，共41页5-核苷酸酶核苷酸酶（5-Nucleotidase,5Nase）催化核糖核苷和去氧核糖核苷在催化核糖核苷和去氧核糖核苷在C-5位置水解位置水解磷酸酯。磷酸酯。反应式：反应式：酶活性的显示是由底物中的腺苷酸水解后释酶活性的显示是由底物中的腺苷酸水解后释放的磷酸基被重金属捕捉放的磷酸基被重金

14、属捕捉现在学习的是第20页，共41页激活剂：激活剂：Mg2+，Mn2+抑制剂：抑制剂：NaF(0.1M)，硼酸钠硼酸钠(0.08M)，Ni(10-3M)5Nase有同工酶，最适有同工酶，最适pH有酸性、中性和碱有酸性、中性和碱性。中性最适性。中性最适pH7.5。方法：铅法方法：铅法酶分布较广泛，所有的生物细胞膜包括微生物酶分布较广泛，所有的生物细胞膜包括微生物在内，均具有在内，均具有5-Nase,是细胞膜的主要标志酶是细胞膜的主要标志酶肝、骨、肌、肾上腺髓质、脑组织中酶活性较肝、骨、肌、肾上腺髓质、脑组织中酶活性较高。高。现在学习的是第21页，共41页葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶磷酸酶 gluco

15、se-6-phosphatase,G6PaseG6Pase是具有水解活性和变位活性的多机能酶。组化检查是具有水解活性和变位活性的多机能酶。组化检查法是与其水解活性有关。法是与其水解活性有关。6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖+H2O 葡萄糖葡萄糖+磷酸磷酸磷酸磷酸+Pb2+磷酸铅磷酸铅G6Pase在在pH6活性最强，在活性最强，在pH8最稳定，而在最稳定，而在pH5易变性。易变性。组化反应用组化反应用pH6.5-6.7.G6Pase现在学习的是第22页，共41页抑制剂：氟化物，抑制剂：氟化物，Zn2+,CN-,四氧嘧啶四氧嘧啶短时低温丙酮固定或不固定。短时低温丙酮固定或不固定。*酒精固定，石蜡包埋，酒精

16、固定，石蜡包埋，G6Pase完全被抑制。完全被抑制。方法：铅法方法：铅法结果：酶活性处棕黑色硫化铅沉淀结果：酶活性处棕黑色硫化铅沉淀酶定位于内质网，为内质网的标志酶。以肝、肾、肠粘膜、酶定位于内质网，为内质网的标志酶。以肝、肾、肠粘膜、精囊腺、前列腺为强阳性。精囊腺、前列腺为强阳性。意义：此酶常用于诊断糖原贮积病意义：此酶常用于诊断糖原贮积病型（酶缺乏）型（酶缺乏）癌变过程中癌变过程中G6P不断减少或消失不断减少或消失现在学习的是第23页，共41页腺苷三磷酸酶腺苷三磷酸酶adenosin triphosphatase，ATPaseATPase只作用于磷酸与磷酸之间的高能键，水解三磷酸腺只作用于

17、磷酸与磷酸之间的高能键，水解三磷酸腺苷为二磷酸腺苷，同时释放大量能量。苷为二磷酸腺苷，同时释放大量能量。现在学习的是第24页，共41页具有代表性的具有代表性的ATP酶的分类酶的分类现在学习的是第25页，共41页方法：金属沉淀法方法：金属沉淀法钙钴法用来示肌球蛋白钙钴法用来示肌球蛋白ATP酶，也可示线粒体的酶，也可示线粒体的以及与膜结合的以及与膜结合的ATP酶酶铅法用于示膜结合的铅法用于示膜结合的ATP酶，也可示线粒体酶。酶，也可示线粒体酶。现在学习的是第26页，共41页酯酶酯酶属于羧酸酯水解酶属于羧酸酯水解酶 R-COOR+H2O R-COOH+ROH分类分类非特异性酯酶：水解短链脂肪酸的酯非

18、特异性酯酶：水解短链脂肪酸的酯脂酶：水解长链脂肪酸的酯脂酶：水解长链脂肪酸的酯胆碱酯酶：水解胆碱的酯键胆碱酯酶：水解胆碱的酯键现在学习的是第27页，共41页非特异性酯酶非特异性酯酶nonspecific esterases是一类分解含短链（是一类分解含短链（C2-C4）低级脂肪酸酯，）低级脂肪酸酯，并且没有底物特异性的酶，能水解并且没有底物特异性的酶，能水解萘酚醋酸。萘酚醋酸。最适最适pH5.08.0方法：偶氮耦联法方法：偶氮耦联法通常用醋酸萘酚或萘酚通常用醋酸萘酚或萘酚AS衍生物作底物，在酶的衍生物作底物，在酶的作用下，释出萘酚，与固蓝作用下，释出萘酚，与固蓝B或六偶氮对品红偶或六偶氮对品红

19、偶联成蓝棕色或不溶的偶氮染料。联成蓝棕色或不溶的偶氮染料。现在学习的是第28页，共41页应用应用此酶定位于溶酶体、内质网，在肝、肾、胰和小肠酶此酶定位于溶酶体、内质网，在肝、肾、胰和小肠酶活性高活性高单核巨噬细胞含酶最丰富单核巨噬细胞含酶最丰富T淋巴细胞局限性点状阳性，淋巴细胞局限性点状阳性，B淋巴细胞阴性淋巴细胞阴性用作髓性白血病的鉴别诊断：用作髓性白血病的鉴别诊断：非特异性酯酶非特异性酯酶氟化钠处理后氟化钠处理后原粒细胞性原粒细胞性原单核细胞性原单核细胞性现在学习的是第29页，共41页胆碱酯酶胆碱酯酶乙酰胆碱脂酶乙酰胆碱脂酶(acetycholinesterase，AchE)水解乙酰胆碱水

20、解乙酰胆碱分布于神经元胞质内、神经与肌肉接头处（运动分布于神经元胞质内、神经与肌肉接头处（运动终板）、红细胞等，酶的检测用于追踪神经通路。终板）、红细胞等，酶的检测用于追踪神经通路。最适最适pH7.58.0胆碱脂酶胆碱脂酶(cholinesterase，ChE)水解胆碱的酯水解胆碱的酯见于血清、胰、唾液腺内见于血清、胰、唾液腺内最适最适pH8.08.5现在学习的是第30页，共41页抑制剂抑制剂毒扁豆碱，毒扁豆碱，DFP（二异丙基氟磷酸）抑制（二异丙基氟磷酸）抑制AchE和和ChE四异丙基焦磷酸酰胺特异性抑制四异丙基焦磷酸酰胺特异性抑制ChEBW284C51特异性抑制特异性抑制AchE现在学习的

21、是第31页，共41页方法：方法：亚铁氰化铜法亚铁氰化铜法染色原理染色原理作用液作用液碘化乙酰硫代胆碱（底物）碘化乙酰硫代胆碱（底物）5.0mg0.1M顺丁烯二酸缓冲液（顺丁烯二酸缓冲液（pH6）6.5ml0.1M柠檬酸钠柠檬酸钠 0.5ml5M铁氰化钾铁氰化钾1.0ml30mM(0.75%)CuSO4（捕捉剂）（捕捉剂）1.0ml蒸馏水（或抑制剂）蒸馏水（或抑制剂）1.0ml 作用条件作用条件温度温度37或室温；时间或室温；时间 3060min 用用0.1M蔗糖蔗糖0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤。二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤。现在学习的是第32页，共41页氧化还原酶氧化还原酶 oxidoredu

22、ctases 细胞的氧化还原反应主要是由氧化还原酶或细胞的氧化还原反应主要是由氧化还原酶或脱氢酶催化的脱氢酶催化的氧化还原反应是由氢的供体把氢原子转移到氧化还原反应是由氢的供体把氢原子转移到氢的受体的酶促反应，即脱氢酶反应氢的受体的酶促反应，即脱氢酶反应现在学习的是第33页，共41页脱氢酶脱氢酶脱氢酶是氧化底物，从底物将氢传递给受氢体的酶系。脱氢酶是氧化底物，从底物将氢传递给受氢体的酶系。不同于氧化酶，合适的受氢体不是大气中的氧，而是辅酶不同于氧化酶，合适的受氢体不是大气中的氧，而是辅酶I、辅酶、辅酶II（NDAP）或黄素蛋白，然后经氢传递系统，使受）或黄素蛋白，然后经氢传递系统，使受氢体还原

23、显色，从而达到定位目的。氢体还原显色，从而达到定位目的。组化示脱氢酶分不需辅酶和必需辅酶二种。组化示脱氢酶分不需辅酶和必需辅酶二种。脱氢酶的组化方法，以四唑盐和铁氰化物为受氢体脱氢酶的组化方法，以四唑盐和铁氰化物为受氢体 现在学习的是第34页，共41页四唑盐法的基本原理四唑盐法的基本原理受氢体受氢体现在学习的是第35页，共41页琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶succinate dehydrogenase，SDH 不需辅酶不需辅酶 琥珀酸琥珀酸+受氢体受氢体 延胡索酸延胡索酸+还原的受氢体还原的受氢体方法：硝基蓝四唑法方法：硝基蓝四唑法 Pearson1958最适最适pH7.68.5抑制剂：丙二酸盐（

24、竞争抑制），磷酸盐，抑制剂：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制），凡氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制），凡与与-SH基化合的作用剂皆抑制其活性。基化合的作用剂皆抑制其活性。SDH现在学习的是第36页，共41页作用液的配制：作用液的配制：琥珀酸钠琥珀酸钠 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 NBT（硝基蓝四唑）（硝基蓝四唑）*DMSO（二甲亚砜）（二甲亚砜）*NBT先溶于先溶于DMSO中，再加入上液中，再加入上液现在学习的是第37页，共41页步骤：步骤：新鲜恒冷箱切片新鲜恒冷箱切片 作用液作用液15-35分钟，分钟，25 盐水洗盐水洗 Fca（氯化钙（氯化钙Formalin）固定）

25、固定10分钟分钟 80%酒精酒精5分钟分钟 甘油明胶封固甘油明胶封固结果：酶活性表现为蓝紫色沉淀结果：酶活性表现为蓝紫色沉淀现在学习的是第38页，共41页SDH仅位于线粒体中，可作为线粒体的标仅位于线粒体中，可作为线粒体的标志酶志酶含含SDH活性高的组织为：心肌、肾小管上活性高的组织为：心肌、肾小管上皮和肝细胞皮和肝细胞现在学习的是第39页，共41页乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase,LDH需辅酶需辅酶 乳酸盐乳酸盐+NAD 丙酮酸盐丙酮酸盐+NADH+H+（辅酶（辅酶）（还原型辅酶（还原型辅酶）四唑盐接受还原型辅酶四唑盐接受还原型辅酶I的氢而被还原为深色的氢而被还原为深色不溶的甲不溶的甲 沉淀。沉淀。最适最适PH7.4方法：方法：LDH四唑盐法四唑盐法LDH现在学习的是第40页，共41页LDH是糖原分解的酶系是糖原分解的酶系肝、骨骼肌中酶活性强肝、骨骼肌中酶活性强同工酶同工酶LDH1为心型，与有氧代谢有关为心型，与有氧代谢有关同工酶同工酶LDH5为肌型，与厌氧代谢有关，癌组为肌型，与厌氧代谢有关，癌组织因糖酵解织因糖酵解LDH5增加增加现在学习的是第41页，共41页