sirt1对大鼠脑缺血再灌注损伤模型中神经保护.doc

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1、分类号：R743.3 密级：公开 单位代码：10760 学号：107602147913新疆医科大学XinJiang Medical University硕士学位论文THESIS OF MASTER DEGREE临床医学硕士专业学位（学历教育）论文题目：sirt1对大鼠脑缺血再灌注损伤模型中神经保护邓 瑜机制的研究研究生 指导教师朱 沂 副教授专业学位领域神经病学研究方向神经保护是否保护研究起止时间2015年9月-2016年11月所在学院自治区人民医院2017 年 2 月 sirt1对大鼠脑缺血再灌注损伤模型中 神经保护机制的研究研究生邓 瑜邓瑜指导教师朱沂 副教授专业学位领域神经病学研究方向神

2、经保护2017 年 2 月Sirt1 on ischemia-reperfusion injury model rats nerve protection mechanism to study Dissertation Submitted to Xinjiang Medical UniversityIn Partial Fullfillment of the Requirementsfor the Degree ofMaster of MedicineByDeng yuNeurologyDissertation Supervisor: A.Prof.Zhu YiFeb ,2017论文独创性说明

3、本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 关于论文使用授权的说明本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定， （选择“同意/不同意”）以下事项：1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子

4、杂志社”用于出版和编入CNKI中国知识资源总库或其他同类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名Sirt1Sirtuin type 1依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的组蛋白脱乙酰酶NAD+nicotinamide adenine dinucleotide烟酰胺腺嘌呤二核苷酸ADAlzheimers disease阿尔茨海默病PARPpoly-ADP ribosepolymerase聚-ADP 核糖聚合酶 E2F1E2F transcription factor1是细胞周期调节因子之一HIC

5、1Hypermethylated in cancer 1是一种转录抑制物CREB cAMPresponse-element-binding proteincAMP反应调节蛋白ChREBPCarbohydrate response-element-bindingprotein碳水化合物调节蛋白HuRHu family of RNA-binding proteinRNA调节蛋白CHK2the cell cycle checkpoint kinase 2丝氨酸/苏氨酸激酶细胞周期检测点激酶 2Resresveratrol,白藜芦醇STACsSIRT1 activating compoundssirt

6、1激活化合物Nrf2Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2外源化合物调节氧化应激中关键转录因子目 录摘要1ABSTRACT2绪论3内容与方法31. 研究背景32. 研究意义3Sirt1分子介绍41. sirt1分子结构42. Sirt1在脑内分布和细胞内定位53. Sirt1活性调节54. Sirt1下游底物和功能105. Sirt1与认知15实验动物分组18脑缺血再灌注损伤模型制作18Westerblot法检测1919RNA检测20免疫荧光染色21梗死体积计算22神经功能评分22统计学方法22结果23讨论与展望26致谢28参考文献29综述34攻

7、读硕士学位期间发表的学位论文37导师评阅表38新疆医科大学硕士学位论文 Sirt1对大鼠脑缺血再灌注损伤模型中 神经保护机制的研究 研究生：邓瑜 导师：朱沂 副教授/主任医师 摘 要 生命体内的细胞如同接受情报一样每时每刻都在忙碌的接受着来自细胞内外的各种信号,信号转导所带来的生物学效应几乎涵盖了包括记忆与学习在内的所有的生命现象。从调节信号转导通路入手去研究和治疗痴呆已成为重要的途径。脑缺血缺氧时多个信号转导通路被激活,参与细胞存亡、能量代谢、氧化应激等与脑组织损伤的病理生理过程。详细透彻的阐明各信号转导通路在慢性脑缺血中的作用,以寻找具有治疗意义的药物靶点服务于血管性痴呆的临床,是当今研究

8、的热点。最近的氧糖剥夺体外实验和急性脑缺血和缺血预处理动物实验表明SIRT1 通过抗氧化、抗炎、减少凋亡等机制发挥神经保护作用,并有证据表明 SIRT1是控制出生后血管生长的内皮细胞基因表达的关键调节因子,我们推测其在慢性脑部低灌注病理状态下亦起重要作用。本文主要研究SIRT1信号对大鼠脑缺血再灌输损伤模型中神经保护作用，可以为我国医学方面大脑及神经的研究做出贡献。关键词：SIRT1 信号 脑缺血 神经保护Sirt1 on ischemia-reperfusion injury model rats nerve protection mechanism to study Postgraduat

9、e：Deng Yu Supervisior：A.Prof.Zhu Yi Abstract Cells in the life like an intelligence as every moment in the busy receiving from the inside and the outside of the cell signal, signal transduction brought about the biological effects of covering almost including memory and learning, including all the p

10、henomena of life. Research and treatment of dementia has become an important way from the regulation of signal transduction pathways. Cerebral ischemia and anoxia in multiple signal transduction pathway is activated and involved in cell survival, energy metabolism, oxidative stress and brain tissue

11、damage pathophysiological processes. To clarify the role of each signal transduction pathway in chronic cerebral ischemia and to find the clinical treatment of vascular dementia is a hot topic in the study. Recently the oxygen and glucose deprivation in vitro and acute cerebral ischemia and ischemia

12、 pre dealing with animal experiments show that SIRT1 by antioxidant, anti-inflammatory, reduce apoptosis play a neuroprotective role, and there is evidence to show that SIRT1 is controlled postnatal angiogenesis endothelial cell gene expression of key regulatory factor, we hypothesized that the path

13、ological state of chronic 一绪论一绪一、绪论 脑血管疾病是世界三大致死性疾病之一,具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率的特点。脑血管病是指在脑血管壁病变或血流障碍基础上发生的局限性或弥漫性脑功能障碍,65岁以上的中老年人多发,是中老年人致死和致残的主要疾病,严重危害人类的健康和生活质量。缺血性脑缺血疾病占脑血管疾病的70-80%。截止目前,脑缺血损伤的病理生理机制尚未完全明确,大量研究认为其发病机制可能与能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用、一氧化氮的大量合成、氧自由基损伤、脂质过氧化反应、细胞内Ca2+超载、炎症反应、细胞凋亡等机制相关。目前,临床上对缺血性脑血

14、管疾病治疗主要有溶栓治疗和神经保护治疗两大类。一方面,溶栓治疗虽然取得明确的临床治疗效果,但是受到治疗时间窗,颅内出血、脑水肿等并发症,以及再闭塞率等方面的限制。另一方面,神经保护药物治疗虽然具有广阔的前景,但是大多数药物虽然在动物实验中具有效果,但是进入临床效果亦不甚理想或者存在严重的不良反应,因此目前仍然缺乏理性的神经保护药物。本课题在以往研究的基础上,研究钙离子增敏剂椒苯酮胺对大鼠脑缺血再灌注损伤是否具有神经保护作用,以及进一步探讨其可能的作用机制,为该化合物进一步发展为具有自主知识产权的,治疗缺血性脑血管病的创新药物寻找理论基础。 方法： 第一部分,实验大鼠随机分为假手术组、模型组、P

15、PTA低、中、高剂量组(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)和阳性对照依达拉奉组(6mg/kg)。首先,采用经典的栓线法致大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)方法造成局灶性脑缺血再灌注损伤模型,脑缺血1h后静脉注射给药。模型动物缺血2h再灌注24h后,进行Zea-longa 5分制神经功能学评分方法,以评估动物神经损伤程度；测定实验大鼠脑组织含水量,以评估其脑水肿的程度；用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定梗死体积百分比。其次,使用Pulsinelli法建立全脑缺血20min再灌注模型,采用提前给药7d,运用Morris水迷宫,进行定向航行实验和空间探索实验,检测PPTA对

16、全脑缺血再灌注大鼠模型空间认知能力的影响。 第二部分,采用栓线法致大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)方法造成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。实验动物缺血2h再灌注24h后,采用黄嘌呤氧化法检测SOD活力,用硫代巴比妥酸显色法测定脑组织MDA含量,用硝酸还原法测定脑组织中NO含量,用NOS检测试剂盒测定脑组织提取液NOS活性,用考马斯亮蓝法组织蛋白含量测定,从而综合反映缺血再灌注时,实验动物脑组织中脂质过氧化反应以及氧自由基损伤的程度,从而研究PPTA是否具有对抗脂质过氧化反应和氧自由基损伤的作用。 第三部分,采用栓线法致大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)方法造成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。缺血2h再灌注2

17、4h后,采用real-time PCR检测动物脑组织中炎症反应因子(IL-1、TNF-a),及细胞凋亡因子(caspase-3、Hsp70)的表达,检测缺血再灌注时,动物脑组织中炎症反应以及细胞凋亡的变化程度,研究PPTA是否具有抑制炎症反应和抗细胞凋亡的作用。 结果： 缺血2h再灌注24h后,假手术组大鼠表现正常,评分为0分。与假手术组相比,模型组大鼠神经功能评分显著升高,其脑组织含水量和梗死体积较假手术组也有显著增加；全脑缺血20min后,运用Morris水迷宫进行定向航行实验和空间探索实验中,模型组大鼠潜伏期增加,空间认知能力下降,提示大鼠脑缺血后神经功能严重损伤；MCAO模型组大鼠较假

18、手术组脑组织中SOD活力和GSH含量降低,NOS活力、MDA和NO含量显著增高,提示其神经细胞在脑缺血再灌注时受到氧自由基和脂质过氧化损伤；同时脑组织中IL-1、TNF-a、Caspase-3、Hsp70等因子表达升高,验证了炎症反应和细胞凋亡也参与了缺血再灌注损伤病理损伤过程。 第一部分,PPTA中剂量组和高剂量组可显著降低行为评分,与模型组比较有显著性差异(P=0.027,P=0.017)；中剂量组和高剂量组脑组织含水量显著低于模型组(P0.001,P=0.001);PPTA中、高剂量组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积,与模型组相比有非常显著差异(P0.035,P0.003)。Morris

19、水迷宫实验中PPTA低、中、高剂量组,定向航行实验中的潜伏期第4天,模型组的定向航行实验潜伏期显著高于假手术组(P0.05)；第5天,PPTA低、中、高剂量组潜伏期显著低于模型组(P0.01)。第6天,空间探索实验表明,PPTA低、中、高剂量组第一次到达平台所在位置的时间均显著低于模型组(P0.01)；与模型组相比,PPTA低、中、高剂量组可显著增加实验动物留在目的象限的探索时间和探索路程(P0.05,P0.01,P0.01)；不同时间点的各组两两比较发现,各组大鼠的游泳速度没有明显差异,提示PPTA具有神经保护作用。 第二部分：与模型组比较,PPTA高剂量组(10mg/kg),大脑SOD活力

20、显著高于模型组(P=0.041);PPTA低、中、高剂量(2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg)脑组织MDA含量显著低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000)；高剂量组(10mg/kg)大脑GSH含量显著高于模型组(P=0.007)；脑组织NOS活力均显著低于模型组(P=0.030,P=0.006,P=0.004)；NO含量显著降低(P=0.000,P=0.000,P=0.000),提示PPTA可能通过提高抗氧化酶活性,清除氧自由基,抑制脂质过氧化反应,抑制NOS活性,减少NO的生成,抑制NO介导的毒性作用,发挥神经保护作用。 第三部分：与模型组比较,PPTA

21、低、中剂量的IL-1mRNA表达无显著性差异(P=0.254,P=0.099),PPTA高剂量组较模型组显著降低IL-1mRNA的表达(P=0.001); PPTA高剂量较模型组亦可显著降低TNF-a mRNA的表达(P =0.018); PPTA中、高剂量组(5mg/kg、10mg/kg)则显著降低Caspase-3 mRNA的表达(P=0.007, P=0.001); PPTA低剂量、中、高剂量组(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)与模型组比较显著降低HSP70表达(P=0.046,P=0.038,P=0.027),提示PPTA可能通过抗炎、抗细胞凋亡等机制,发挥神经保护作用

22、。 结论： 1. PPTA具有神经保护作用； 2. PPTA可能通过对抗氧自由基损伤和脂质过氧化反应,实现神经保护作用； 3. PPTA可能通过抑制炎症反应和细胞凋亡,实现神经保护作用。1.1研究背景大脑是人体新陈代谢最为旺盛的器官之一，其重量虽只有人体体重的 2%，但其耗氧量占到总耗氧量的 20%。因大脑不能储存氧气和葡萄糖，其功能的维持依赖于血液提供营养物质和氧气；大脑主要通过有氧呼吸的方式来获取大量的能量，而能量代谢需要充足的氧气，故脑缺血首先影响的是大脑能量代谢活动。然而，急性脑缺血引起的细胞能量代谢紊乱，不仅导致一系列的缺血级联反应，破坏细胞的正常结构和功能，还能启动细胞凋亡过程，引

23、发钙内流增加致使细胞死亡。溶栓治疗虽能使血管再通，但再灌注会带来第二次损伤，即再灌注损伤伴随的炎症反应，白细胞黏附和浸入、细胞因子作用等又将进一步加强缺血的损伤作用。血管性痴呆是发展中国家痴呆首要原因,迄今为止,人类还未找到治疗血管性痴呆行之有效的方法,防治手段十分有限。慢性脑缺血是研究血管性痴呆发病机理的重要组成部分,被认为是血管性痴呆、阿尔茨海默病等神经系统变性疾病、Binswanger病（皮质下动脉硬化性脑病）发病中的一个共同病理过程,可导致持久性进展性认知损伤,但其导致认识损害的病理生理机制仍不完全清楚,是丞待解决的医学难题。 1.2研究意义信号转导系统功能失调及氧化应激在脑缺血、阿尔

24、茨海默病等变性病所致痴呆中的重要作用已得到公认,临床上一些抗氧化剂已在痴呆的治疗中得到获益。细胞信号转导系统控制着细胞的生长、分化和死亡,参与调节细胞的活性。目前已知众多疾病都是由信号通路的缺陷所致。病理状态下信号通路的重构将有助于人们更多的了解疾病的病因和发病过程,同时提供了发现治疗疾病新方法的机会。二SIRT1分子介绍二、sirt1分子介绍 2.1 SIRT1 分子结构 人类的 SIRT1 是一种 NAD+依赖的包含 747 个残基的核脱乙酰基酶,相对分子量约 120kD。SIRT1 是一种无序蛋白,由四个区域组成,即 N 末端结构域、变构位点、催化核心和 C 末端结构域,其中 N 末端和

25、 C 末端结构域在 Sirtuin 家族中是 SIRT1 所特有的。其中位于 181 至 498 残基的催化核心和变构位点组成紧密的球状芯,N 末端和 C 末端是大型无序的结构域。催化核心又称大结构域,位于 181 到 243 残基,由排列有序的 NAD 依赖性蛋白质典型结构-罗斯曼折叠(Rossman fold)组成1,骑跨在 SIRT1蛋白 N 末端和紧密球形核心之间,是高度保守的中心结构域,为所有的 Sirtuin 家族成员所共有可以催化 NAD+依赖的脱乙酰化反应,参与转录、DNA 复制和修复等核事件2。变构位点又称小结构域,由四个螺旋和锌原子组成,位于 N 末端和催化核心之间,通过结

26、构上的变化可以控制催化核心的活性。SIRT1 的两个末端区域呈长的无序状,N 末端含 180 残基,C 末端含 249 个残基。除上述结构外,大小结构域之间还有一些环状结构,它们共同形成口袋状结构,是 NAD 的结合位点3。NAD 分子与由小结构域上的疏水残基和大结构域上的亲水残基组成的特异性口袋相适应。口袋附近的可变环有利于在 NAD 结合过程中 SIRT1 催化区域构的结构重整,是催化活性必不可少的。锌原子区域被认为在底物特异性结合中起作用,其周围是个四分体,即由四个半胱氨酸残基组成的硫醇基折叠成单一的结构单元。在所有的 Sirtuin 家族中这个由半胱氨酸残基组成的四分体是广泛保守的4。

27、 2.2 SIRT1 脑内解剖分布和细胞内定位SIRT1 广泛分布于鼠的脑实质,在代谢相关的区域表达丰富,如下丘脑、室旁核、梨状皮质(旧皮质)、内侧缰核、海马和小脑5。大鼠与小鼠的 SIRT1 核定位及解剖分布没有明显的种系区别。在哺乳动物的新皮质六层细胞中均含有丰富的 SIRT1 表达,与 DNA 稳定性及细胞增殖相关。SIRT1 mRNA 在海马神经元内表达丰富,其参与神经再生、学习和记忆、阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)等神经变性疾病的物质基础6。SIRT1 基因位于染色体 10q21.3,基因组序列约为 33kb。SIRT1 基因的 mRNA 主要定位于细胞核

28、,而蛋白则因细胞类型、细胞状态和分子间相互作用的不同而定位不同,既可以存在于细胞核内,如小鼠海马颗粒和锥体神经元细胞核内,也可以存在细胞质内,如纹状体的神经元样细胞,尽管它的胞质功能才刚开始澄清,而在室管膜细胞的胞质和核中都有 SIRT1 的表达7。尽管 SIRT1 被认为是核蛋白,离体试验已经证明 SIRT1 存在核浆穿梭现象,当 SIRT1 离开细胞核时可能会促进 SIRT1 核内靶基因的乙酰化和激活,而细胞浆内的 SIRT1 同样可以发挥其去乙酰化活性来作用于FOXO、p53 等底物8。核浆穿梭可能是 SIRT1 功能调节的机制之一。 2.3 SIRT1 活性调节 SIRT1 是细胞内信

29、号转导网络的关键节点,细胞内 SIRT1 的活性受到多种应激因素和物质的调节,控制 SIRT1 的活性是个复杂的调节网络,掌握控制 SIRT1 活性调节的机制将有助于更好的了解疾病的发生过程9。2.3.1 NAD+生物合成对 SRIT1 的调节同其他生物体内的酶一样,SIRT1 的催化活性受到它的酶学底物的影响。NAD+通过接受电子产生 NADH,广泛参与细胞的能量代谢,而在 SIRT1 介导的去乙酰化反应中,NAD+是必需的物质。通过水解 NAD+分子内核糖部分与烟酰胺之间的糖苷键,同时将底物蛋白的赖氨酸残基上的乙酰基转移到 ADP-核糖的 2-OH 位置,SIRT1 实现其对底物的去乙酰化

30、反应。此过程产生三个产物,其中丢失乙酰基的 SIRT1 底物成为去乙酰化蛋白,而获得乙酰基的 NAD+将裂解成烟酰胺及 2-氧位-乙酰基-ADP 核糖10。故实际上 SIRT1 具有两种酶活性,即去乙酰化和裂解 NAD+。细胞内 NAD+的供应量、以及去乙酰化反应副产物烟酰胺均可调节 SIRT1。在哺乳动物体内,细胞的能量状态通过改变 NAD+的水平来调节 SIRT1 的活性,例如,在热量限制条件下细胞的能量不足将提升 NAD+的水平从而提高 SIRT1 的活性。烟酰胺已被证明体内和体外均可以抑制 Sirtuin 的活性,体外试验显示正常浓度下烟酰胺通过结合在SIRT1 的口袋结构上阻止 NA

31、D+的水解,从而抑制 SIRT1 的活性11。ADP-核糖已知是SIRT1 的强抑制剂。除此之外,SIRT1 在不同的复合物中受到其他蛋白的直接抑制或激活。人类用于合成的 NAD+饮食原料包括色氨酸、烟酸、烟酰胺和一种新发现的前体烟酰胺核糖。其生物合成所需的酶的表达受到 Sirtuin 的控制,Sirtuin 感受细胞的 NAD+水平,根据 NAD+的利用度来抑制其生物合成酶的表达12。NAD+也能够通过补救途径从它的分解产物烟酰胺来合成,这一途径的关键酶是烟酰胺磷酸核糖转移酶。NAD+最大的消耗者是单 ADP核糖和聚 ADP 核糖的转移酶。这些转移酶裂解 NAD+内的糖苷键,将 ADP 转移

32、或聚合给其它蛋白。DNA 双链的断裂能激活聚-ADP 核糖聚合酶(poly-ADP ribosepolymerase,PARP),导致细胞 NAD+大量消耗13。除了 NAD+生物合成外,补救途径也对烟酰胺再利用,由此去除去乙酰化酶抑制剂烟酰胺。这两者都能提升 Sirtuin 的活性。上边提到的补救途径的关键酶 NAMPT （烟酰胺磷酸核糖转移酶）也能调节 NAD+和 Sirtuin 的活性。 细胞的氧化还原状态和随之而来的 NAD+/NADH 比率的改变参与细胞 Sirtuin 活性的调节以及包括热量限制诱导的酵母寿命延长、肌肉分化、神经产生的过程。NAD+/NADH 比率的降低可缘于 Si

33、rtuin 激活剂 NAD+量的减少,或 Sirtuin 抑制剂 NADH 量的增加。但对 Sir2 蛋白的辅酶特异性的详细研究未能获得支持细胞NAD+/NADH 比率改变调节 Sirtuin 活性的生物化学证据。尽管 NAD+/NADH 比率可能不直接影响 Sirtuin 酶学活性,有证据表明细胞的氧化还原状态在转录及转录后水平调节 SIRT1 的蛋白水平14。氧化还原感受器 HIC1 （癌超甲基化基因1）同时也是 SIRT1 的转录抑制剂,参与 NAD+/NADH 比率控制 SIRT1 转录的调节通路。而且有研究表明葡萄糖剥夺和细胞丙酮酸盐控制 SIRT1 蛋白水平甚至不改变 SIRT1

34、的 mRNA 水平。以上证据提示NAD+/NADH 比率可能通过改变 SIRT1 蛋白水平影响整个细胞的 SIRT1 活性,而不是直接控制 SIRT1 的酶学活性15。2.3.2 转录水平调节 (1)p53:SIRT1 基因启动子内有两个 p53 结合位点( 178bp 和 168bp),它们之间的相互作用可以抑制 SIRT1 的转录16。(2)FOXOs:SIRT1 去乙酰化 FOXO1,提高其转录活性,形成正负反馈机制;FOXO3(即 FOXO3)生理条件下结合 p53,将 p53 从 SIRT1 的结合位点上移除,从而减弱 p53 对 SIRT1 基因表达的抑制作用,使SIRT1 转录增

35、加,从而应对细胞对应激的反应。(3)E2F1(E2F transcription factor1,E2F1),是细胞周期调节因子之一,也是凋亡的强诱导剂。SIRT1 和 E2F1 之间存在负反馈机制,E2F1 结合在 SIRT1 启动子-65bp 位点上,增强其转录表达17。SIRT1去乙酰化 E2F1,抑制其转录活性,减少凋亡。在 DNA 损伤中 E2F1 是 SIRT1 的关键性激活剂。(4)HIC1(Hypermethylated in cancer 1,HIC1):是一种转录抑制物,SIRT1 是它的靶基因。氧化应激条件下,HIC1 同 E2F1 一样可以从转录水平对 SIRT1表达进

36、行调节。HIC1 结合在 SIRT1 的上游启动子-1116 和-1039bp 位点上, 通过它的 N 末端 POZ 区域形成转录抑制复合体,抑制 SIRT1 转录18。(5)TLX:TLX 是一种核受体,作为转录抑制因子,它可以促进神经前体细胞的增殖和自我更新,在神经前体细胞中基因敲除 TLX 后 SIRT1 的水平将下降19。其人类同源体可以结合在 HEK293细胞中 SIRT1 的启动子上的 TLX 激活元件,从而上调 SIRT1 的表达。(6)PPAR:也可以结合在 SIRT1 的启动子上抑制其转录。(7)其它:在内皮细胞内 eNOS 和SIRT1 之间可能存在正反馈机制,SIRT1

37、可以去乙酰化 eNOS 提高其活性,增加内皮一氧化氮的水平,而 eNOS 缺乏时 SIRT1 的表达也受限;cGMP 可以降低 p53的稳定性,并由此增强 SIRT1 的表达;在能量供应的反应中 CREB(cAMPresponse-element-binding protein)和ChREBP(carbohydrate response-element-bindingprotein)能够反向调节 SIRT1 的表达。当营养供给水平低时,CREB 提高 SIRT1 的表达,反之,没有能量应激的情况下 ChREBP 抑制 SIRT1 的表达。2.3.3 转录后调节除转录水平的调控外,对 mRNA

38、转录的转录后加工如胞内运输的调节、基因沉默或稳定和降解 mRNA 对蛋白量调节也是主要的决定因素,这主要是通过 microRNA和 RNA 结合蛋白与特定的 mRNA 序列相互作用实现的20。microRNAs 可以导致 mRNA 的稳定或降解,从而影响蛋白的表达,这也是 SIRT1蛋白表达另一个重要决定因素。microRNAs 是一组平均长度在 22 个核苷酸的小RNA,它们结合目的 mRNA 的互补序列导致基因的沉默和 mRNA 的降解。目前已知 10 多种 microRNA 以 SIRT1 为靶点,可以减少 SIRT1 表达的 microRNA 包括miR-34a、miR-132、miR

39、-217、miR-199、miR-921。特异性的 RNA结合蛋白也可以导致mRNA的稳定或降解,从而影响蛋白的表达。HuR(Hu family of RNA-binding protein,HuR)是 SIRT1 转录后调节的主要参与者。生理条件下HuR与SIRT1的mRNA的3非翻译区相互作用,可以提高SIRT1的mRNA的稳定性,从而促进 SIRT1 的翻译。DNA 损伤和氧化应激能够激活丝氨酸/苏氨酸激酶细胞周期检测点激酶 2(the cell cycle checkpoint kinase 2,CHK2)22,CHK2 使 HuR高度磷酸化,使HuR丧失对SIRT1的mRNA结合能力

40、,破坏HuR与SIRT1的mRNA复合体,降低 SIRT1 的 mRNA 稳定性,由此降低 SIRT1 的蛋白水平。HuR 与 SIRT1的 mRNA 的结合受到 HuR 磷酸化的调节,而丝氨酸/苏氨酸激酶细胞周期检测点激酶2(the cell cycle checkpoint kinase 2,CHK2)对 HuR 的磷酸化有控制作用。2.3.4 外源性调节SIRT1 可以被小分子化合物激活,这将有助于开发神经系统疾病新药物。这些小分子化合物多数为多酚类,包括白藜芦醇(resveratrol,Res)、橡黄素(quercetin)、姜黄色素(curcumin)、 儿茶精类(catechins

41、)23。(1) 白藜芦醇(resveratrol):即 3,4,5-三羟基-1,2-二苯乙烯,2003 年 Howitz等将第一个 SIRT1 激活剂白藜芦醇通过高通量生物化学筛选鉴定出来,其分子式为 C14H12O3,相对分子量 228.25,为一种非黄酮类多酚化合物,外观呈无色针状晶体,易溶于乙醇、丙酮等极性有机溶剂,难溶于水,是植物为对抗紫外线照射和真菌感染等不利因素产生的一种抗毒素。文献报道白藜芦醇的抗氧化作用强于维生素 E 和维生素 C,并能清除自由基,其减少氧自由基的产生、抗凋亡作用均为通过 SIRT1 实现。研究显示它降低肽底物和 NAD+的 Km 值,而对 Vmax 没有显著作

42、用,提示它是 SIRT1 的变构效应因子,是第一个被发现的 SIRT1 的变构激活剂,可改善代谢和糖耐量,以及各种应激试验中的总体身体性能。(2)STACs(SIRT1 activating compounds,STACs):2007 年结构上与白藜芦醇无关的合成化合物被报道能够激活 SIRT1,这些化合物被命名为 STACs。STACs可以从低于微摩尔水平提高 SIRT1 的催化活性几百倍,而且它们具有口服生物利用度,已被报道可以改善高脂饮食和糖尿病模型小鼠的代谢指标。与白藜芦醇类似,它们也是变构酶激活剂,可以提高肽底物的结合率。(3)同族烟酰胺:通过解除烟酰胺的抑制作用激活酵母 Sir22

43、4。上面提到烟酰胺是 sirtuin 内源性抑制剂,而同族烟酰胺与烟酰胺相互竞争,从而促进 SIRT1 体内和离体去乙酰化作用。 2.4 SIRT1 下游底物和功能 作为去乙酰化酶,SIRT1 的酶学活性并不局限于组蛋白,而是包括转录因子和辅助因子,DNA 修复酶,蛋白激酶,磷酸酶,和 tau 蛋白,管理不同的生物学过程。SIRT1在哺乳动物体内参与多种重要的代谢通路,是一种多功能蛋白质25。SIRT1 的催化活性显示出多种多样的细胞类型特异性的功能,参与癌症、肥胖、炎症和神经变性疾病的病理生理过程。实验室数据表明 SIRT1 参与多种重要的生物学过程的调控,包括染色质重塑,转录沉默,染色体的

44、稳定性,细胞周期进程,细胞凋亡,细胞自噬,新陈代谢,生长抑制,炎症和应激反应。2.4.1 组蛋白 组蛋白 H2、H3、H4 形成球状结构供 DNA 缠绕,使 DNA 处于静息状态。当组蛋白的赖氨酸发生乙酰化时,组蛋白失去正电荷,DNA 得到释放,舒展开来进行基因转录。相反,去乙酰化反应极化组蛋白,促进他们与 DNA 结合,导致基因组非特异性的转录沉默。SIRT1 去乙酰化 H3 的 Lys9 和 Lys14、H4 的 Lys16,导致基因沉默26。基因沉默将减少蛋白合成和能量消耗,这是细胞和有机体遇到热量限制、低温、休眠等不利环境时生存下来的共同策略,同时这些措施也将诱导神经元的耐受性,保护神经元免受病理性损伤。SIRT1 的去乙酰化作用负责异染色质的形成,组蛋白的去乙酰化反过来能够易化组蛋白的甲基化,因此增