艾普拉唑联合参七肚痛汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠的干预作用、对胃黏膜凋亡调控机制的研究及临床验证 (2).docx

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1、吉首大学本科生毕业设计目 录摘 要IAbstractII第1章 绪 论11.1 研究背景11.2 研究目的及意义31.3 在临床药物治疗或药物开发中的应用及发展趋势4第2章 艾普拉唑联合参七肚痛汤对CAG模型大鼠的干预作用52.1 实验材料52.1.1 实验动物52.1.2 实验药品及试剂52.1.3 实验仪器52.1.4 其他仪器52.2 实验方法62.2.1 大鼠慢性萎缩性胃炎模型复制62.2.2 模型判定标准62.2.3 分组及给药72.2.4 主要评价指标72.2.5 统计及分析92.2.6 实验难点9第3章 艾普拉唑联合参七肚痛汤对CAG大鼠的机制研究93.1 实验材料93.1.1

2、实验动物93.2.2 实验药品及试剂93.2.3 实验仪器103.2.4 其他仪器103.2.5 蛋白质印记法（Western Blot）试剂配制103.2 实验方法113.2.1 CAG大鼠模型复制113.2.2 模型判定标准113.2.3 分组及给药113.3.4 标本采集113.3.5 主要评价指标113.3.6 统计及分析14第4章 可行性论证15第5章 预期结果及分析165.1 对CAG大鼠的干预作用165.1.1 大鼠的一般生理状况及体重变化165.1.2 对CAG大鼠模型胃组织病理学的影响165.1.3 对CAG模型大鼠胃液量及酸度的影响175.1.4 对CAG模型大鼠胃蛋白酶活

3、性的影响175.1.5 预期结果分析讨论175.2 对CAG大鼠的胃黏膜凋亡调控机制的研究18第六章 艾普拉唑联合参七肚痛汤的临床应用186.1 一般资料186.2 治疗方法186.3 指标判定196.4 统计学方法196.5 预期结果及分析19致 谢25艾普拉唑联合参七肚痛汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠的干预作用、对胃黏膜凋亡调控机制的研究及临床验证向贺娅指导老师 盛益华（吉首大学药学院 湖南吉首 416000）摘 要：慢性萎缩性胃炎是近年来发病率较高的一种疾病，会对患此病的人日常生活及生活的水平有着极大的影响。艾普拉唑是近年来推广运用的苯丙咪唑类质子泵抑制类的医疗药品，在之前关于抑制类的药品运

4、用比较多的是奥美拉唑，但是在运用了新的药品后发现其效果更加具有适应性，新的药品对胃酸的分泌具有很有良效的阻碍作用。在对其研究过后统计了数据发现，中西医结合的治疗理念开始得到广泛应用，且对具有慢性状态的萎缩性疾病关于胃炎具有良好的效果。本次的实验以大鼠和人体具有一定相似的结构来进行实验，并且另实验品模拟具有慢性的萎缩性疾病胃炎，遵循单一变量原则和对照原则，随机进行分组，阳性对照及阴性对照进行观察，从动物体实验探讨艾普拉唑联合参七肚痛汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠的干预作用，从细胞凋亡的角度探讨其治疗的可能作用机制，进一步为中西医结合治疗CAG的临床推广提供实验室依据，促进中西医结合治疗理论的传承及临

5、床应用的发展。在动物体实验取得成功的前提条件下，进行临床验证，进一步为中西医结合治疗CAG提供临床实验依据，促进该方法临床应用的发展。关键词：艾普拉唑；参七肚痛汤；慢性萎缩性胃炎；药效观察；机制研究没有Study on the Intervention Effect of Ilprazole Combined with Shenqidutong Decoction on Chronic Atrophic Gastritis Model Rats and the Regulation Mechanism of Gastric Mucosal ApoptosisXiang HeyaTeacher

6、Sheng Yihua(College of Pharmacy, Jishou University, Jishou Hunan, 416000)AbstractChronic atrophic gastritis(CAG) is a disease with a high incidence in recent years, which has a great impact on patients daily life and quality of life. Ilaprazole is a novel type of proton pump inhibitor(PPI) drug with

7、 a more optimized structure than omeprazole, which is effective in inhibiting gastric acid secretion. According to relevant studies, the treatment concept of integrated traditional Chinese and western medicine began to be widely used, and has a good effect on the treatment of chronic atrophic gastri

8、tis.In this study, a rat model of chronic atrophic gastritis was established, followed the principle of single variable and the principle of control, randomly divided into groups, positive control and negative control were observed, and the intervention effect of Ilprazole combined with Shenqidutong

9、 decoction on rats with chronic atrophic gastritis was investigated by moving object experiment, and the possible mechanism of its treatment was discussed from the perspective of cell apoptosis. Further to combine traditional Chinese and western medicine in the treatment of the CAG promotion provide

10、 laboratory basis, combining traditional Chinese and western medicine treatment of the theory of inheritance and the development of clinical application.On the premise of successful animal experiments, clinical verification is carried out to further provide clinical experimental basis for the treatm

11、ent of CAG with integrated traditional Chinese and western medicine, and promote the development of clinical application of this method.Key words: Ilaprazole, Shenqidutong decoction, Chronic atrophic gastritis, Efficacy observation, Mechanism research 28第1章 绪 论1.1 研究背景具有慢性状态的胃炎还有一定的萎缩性（CAG）又被称为萎缩性胃炎

12、，是常见的消化性系统疾病，胃黏膜厚度会削弱的原因是其上面的一些组成上皮、腺体萎缩、数量上有相对减少。胃黏膜的厚度会增加，还有另一种状态是幽门腺化生以及肠腺化生，也还有另一种状态不典型增生，其所展现出的问题就是慢性状态的消化性具有炎症的病态。主要的表现为胃黏膜腺体萎缩，在微黏膜上皮受到损伤后胃黏膜上的固有腺体发生病变开始呈现萎缩，且在慢性萎缩性胃炎患者中常常存在不完全肠上皮化生中度至重度增生，部分的患者有一定的癌变概率，对于存在异型增生的患者而言其产生癌变的几率相对更大1。具有慢性状态的胃炎还有一定的萎缩性（CAG）会发生这样的病态主要是各种引发病症的因素对胃粘膜有一个长期的侵入，消磨了胃粘膜的

13、抗性，所以时间长后就会导致胃粘膜的损伤，伴随着腺体也会有一定的损伤，胃粘膜受到了伤害的遗留症是永久性的，不能完全恢复最初的状态，逐渐的胃粘膜就会萎缩或者肠化。有相关的研究指出Hp感染是慢性萎缩性胃炎发生的主要致病原因，其作用的机制是Hp会分泌出对胃粘膜有损害的细胞毒素以及黏附因子，这个状态是慢性的持久度，长期的影响就会导致胃黏膜萎缩和肠化，这是胃癌发生的重要助力。所以要预防这样的致病因素需要对根除Hp，以胃黏膜萎缩和肠化情况发生，而且还会出现回光返照现象24。西方对该病症的治疗方法采用的是药物治疗，西药包括根除幽门螺旋杆菌、保护胃黏膜、抗胆汁反流、改善胃动力等，在必要时进行内镜下治疗。过去经常

14、使用的药物是Hp根除剂、胃黏膜保护剂和质子泵抑制剂，用来进行对胃黏膜病状的治疗。目前常见诊疗方案为联用抗生素和抑酸药，奥美拉唑、阿莫西林和克拉霉素对Hp的根除是有效的，也是解决病患的常用方案。但是时间长后Hp就会出现抗性，相关的治疗药品就会逐渐无效，其根除率在不停下降，逐渐使用四联，对其的解释是其中包含了一种质子泵抑制剂，两种不同的抗生素还要加上一种铋剂，常用抗生素为克拉霉素和阿莫西林，铋剂则为枸橼酸铋钾和果胶铋56。艾普拉唑是近年来被应用的新抑制剂，它属于的类型是是质子泵，它对胃酸的产生有很好的阻碍作用，并且将其应用也可以解决Hp带来的负面影响。艾普拉唑无疑有了很大的优势相对于之前相同类型药

15、品。药动学方面都具备一定的优势。与传统方法对比，艾普拉唑联合铋剂标准四联疗法，可以获得更为理想的治疗效果79。中医药对疑难杂症的特殊疾病的治疗上与西方的治疗手段不同，具有特色，其效果也有与西方治疗效果的优势，中医将归为胃脘痛、呃逆、痞满等范围，通顺体内的浊气，强健脾胃，对身体的血液循环有一定的促进作用，肝有很好的疗效、使得人身体轻盈等多方面良好是效果1011。当前单纯的西医诊治对CAG的医治效果欠佳，在医疗过程中收集到了很多的观测资料，其可以分析出只使用的西医诊治CAG没有达到理想的医疗效果，得病的人会出现疾病重现以及对药物出现副作用的反映情况。并且只是用西方的医疗手段治疗CAG需要患者有一定

16、是身体基础，病患者有不良的身体状态就会在使用药物时收到限制。且内镜下治疗具有一定的操作难度，患者可能存在胃黏膜穿孔及远期瘢痕等并发症，因此近些年来对慢性萎缩性胃炎的治疗上中西医联合治疗理念开始得到普遍应用12。近年来，中西医结合治疗的理念开始得到广泛的应用13，且中西医结合治疗慢性萎缩性胃炎的研究增多，如俞天斌14在中西医结合治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效中表明中西医结合治疗CAG临床效果更优；如黄妙兴15采用胃苏颗粒联合四联疗法治疗幽门螺杆菌阳性慢性萎缩性胃炎，临床总有效率为92.00%，表示胃苏颗粒联合四联疗法治疗Hp阳性CAG的临床疗效显著,能够提高Hp根除率,改善胃黏膜分泌功能,抑制炎症

17、反应,且安全性较好；如王飞16在益气健脾汤联合西药治疗慢性萎缩性胃炎中，临床总有效率为93.48%，且表明慢性萎缩性胃炎患者使用益气健脾汤联合西药治疗的效果较好,可以降低炎症指标水平,且无重大不良反应,安全性较高。细胞的衰败死亡原因是在基因控制下细胞井然有序的渐渐衰败，受一系基因的激活、表达以及调控。早在一九七二年此方面相关的权威专家 Kerr 等17提出细胞凋亡的观点，细胞的衰败死亡是生命的基本规律，其有助于个体的形成，对体内的器官细胞组成有很好的平衡、有助于人的年轻。CAG癌前病变向胃癌的转化是多因素共同作用的结果，胃黏膜细胞的凋亡及增殖失衡证实与这一过程相关。细胞的衰败死亡的生命规律现象

18、对胃黏膜来说是其主要的形式，在胃癌癌前病变的发展历程中，细胞凋亡不断在减少，增长时间不断在延长，胃粘膜组织病变细胞不断累积，最终形成胃癌18。Bcl-2和Bax都是归属于Bcl-2蛋白家族，分别是抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，是作用截然相反的同源蛋白，通过对线粒体内信号传导调控来影响细胞凋亡的过程。Bcl-2蛋白是一种分布于线粒体外膜上的跨膜蛋白，与膜上的抗凋亡蛋白相互作用以破坏其对凋亡的抑制作用，引起线粒体等细胞器功能丧失，凋亡因子释放，它也能够作用于线粒体引起线粒体膜通透性的改变，最终导致细胞凋亡1921。Hockenbery等22发现Bcl-2可以阻止氧气的氧化作用，Bcl-2的过度表达使得细

19、胞发生损害，Bcl-2过表达可以抑制细胞色素c的释放，转变了cyt-c依托使得caspase有活性，并且伴有氧化还原信号，从而也抑制了活性氧族的转变，在同一时间线粒体膜电位出现下降的状态、延长了细胞的生命周期。Bax蛋白具有抵抗Bcl-2蛋白促进细胞凋亡，Bax是水溶性蛋白，主要分布于细胞浆，其调控凋亡的方式为通过细胞浆转移至线粒体膜上，迅速形成同源二聚体，促使细胞凋亡23。Bcl-2与Bax之间的比例是决定细胞凋亡水平的关键，Bcl-2过表达时会与Bax构成异源二聚体，从而抑制细胞凋亡。1.2 研究目的及意义实验用萎缩性胃炎小白鼠模型，遵循单一变量原则和对照原则，随机进行分组，阳性对照及阴性

20、对照进行观察，从动物体实验探讨艾普拉唑联合参七肚痛汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠的干预作用，从细胞凋亡的角度探讨其治疗的可能作用机制，进一步为中西医结合治疗CAG的临床推广提供实验室依据，促进中西医结合治疗理论的传承及临床应用的发展。1.3 在临床药物治疗或药物开发中的应用及发展趋势近年来，使用中医医疗手段治疗慢性萎缩性胃炎的研究有了一定量的增加，如姚民武等24，采用黄芪建中汤联合合募配穴灸法辅助治疗脾胃虚寒型幽门螺杆菌阳性慢性萎缩性胃炎临床总有效率为92.75%；相关学者陈志坚25采用，黄芪出品的养胃汤做为医疗手段与西方的医疗手段相结合共同治疗脾胃虚弱型慢萎缩性胃炎临床总有效率为90.00%:高

21、建华26等发表半夏泻心汤中医疗法治疗此疾病总有效率达93.33%，；宫晶书27采用柴胡疏肝散合半夏泻心汤加减治疗肝胃郁热证慢性萎缩性胃炎总有效率达 91.07%，治疗此疾病郁热症疗效显著。慢性萎缩性胃炎在中医届的叫法是痞满、胃痞、胃痛等病证进行研究，中医、中西医结合及外治方面治疗该疾病在临床上具有的独特优势，取得较好的效果。中西医结合治疗理念对慢性萎缩性胃炎的治疗上开始得到广泛的应用。第2章 艾普拉唑联合参七肚痛汤对CAG模型大鼠的干预作用2.1 实验材料2.1.1 实验动物SD（Sprague-Dawley）大鼠120只，雌雄各半，体重在200g左右，SPF级。2.1.2 实验药品及试剂1)

22、 受试药艾普拉唑肠溶片，参七肚痛汤，药物组成主要为：人参10克，黄芪15克，山药30克，延胡索10克，三七6克，丹参30克，郁金10克，佛手30克，百合30克，白芍20克，炙甘草10克，半夏10克。2) 化学试剂盐酸雷尼替丁胶囊，MNNG，无水乙醇，氯化钠，去离子水，去氧胆酸钠，氨水，蛋白酶测试盒，水合氯醛、福尔马林。2.1.3 实验仪器Lambda-6紫外可见分光光度计，BA 110S万分之一电子天平，显微镜，离心机，切片机，包埋机。2.1.4 其他仪器镊子，滤纸，烧杯，离心管（规格：2ml，5ml，15ml，50ml），量筒，药匙，移液枪（规格：200l，1ml，5ml），枪头（规格：20

23、0l，1ml，5ml），注射器（规格：1ml，5ml，10ml），手术剪刀，棉球，冰盒等。2.2 实验方法2.2.1 大鼠慢性萎缩性胃炎模型复制SPD级SD大鼠（20020g）,雌雄各半，实验室适应性饲养5天后，剔除不合格大鼠，随机分成空白对照组，模型复制组。实验期间实验室室温在1826范围内，相对湿度在4070%范围内，一般大鼠饲养盒内温度比环境高12，湿度高510%。噪音85分贝以下，氨浓度20ppm以下，通风换气812次/小时。模型一：空白对照组大鼠进行一般性饲养，给予足够量的饲料；模型复制组大鼠每日用去离子水配成120g/ml的MNNG溶液5ml/Kg灌胃，0.03%雷尼混入丁饲料供实

24、验鼠食用，每周禁食次，每次禁食16-18，禁食次日灌胃40%乙醇1.5ml/只，禁食当天不再给予MNNG溶液以及雷尼替丁。在造模后第20周、22周抽取复制组大鼠，进行医疗检查，得出数据。模型二：空白对照组大鼠进行一般性饲养，给予足够量的饲料；复制组实验鼠每单日持续喝进20mmol/L去氧胆酸钠溶液一个月，每双日持续自由饮用0.1%的氨水溶液，每隔10d灌服60%乙醇2ml/只，在第30天开始分别给予30%乙醇及10mmol/L去氧胆酸钠溶液或0.1%的氨水溶液食用，每7天轮换一次。在造模后第12周、14周抽取实验鼠观测数据情况。2.2.2 模型判定标准1) 肉眼观测：粘膜有白有红，以白为主，皱

25、襞有消失迹象，粘膜有晶状体出现。2) 病理染色检查固有腺萎缩程度： 轻度：固有腺体数减少到原来的三分之一以下。 中度：固有腺体数减少数目大概在其本身的-之间； 重度：固有腺体数减少超过，有消失迹象肠上皮化生程度： 轻度：肠化区面积积小于占腺体和表皮上皮总面积； 中度：肠化区占腺体和表面上皮总面积的-之间； 重度：肠化区占腺体和表面上皮总面积大于。2.2.3 分组及给药确认大鼠造膜成功后，分组剩下的实验品、联合参七肚痛汤低、中、高剂量组及艾普拉唑组，1) 空白对照组、模型组给予等量生理盐水；2) 艾普拉唑组：灌胃给予艾普拉唑10，每天一次；3) 联合参七肚痛汤组： 低剂量组：灌胃给予艾普拉唑10

26、和低剂量参七肚痛汤（0.15g/ml）20ml/Kg，每天一次； 中剂量组：灌胃给予艾普拉唑10和中剂量参七肚痛汤（0.30g/ml）20ml/Kg，每天一次； 高剂量组：灌胃给予艾普拉唑10和高剂量参七肚痛汤（0.60g/ml）20ml/Kg，每天一次；2.2.4 主要评价指标1) 大鼠一般生理状况及体重变化观察实验期间，观测实验鼠的身体状态，给药一周后，每周定期检测大鼠体重变化、测定大鼠摄食量及饮水量，观测实验鼠状态。2) 对CAG模型大鼠的胃组织病理学观察实验收尾时，要对实验鼠进行消灭，胃组织用15%中性福尔马林溶液进行固定。观察指标42： 显微镜下测量胃粘膜固有层厚度、粘膜肌层厚度，并

27、计算两者之间的比值：粘膜肌层厚度/胃粘膜固有层厚度 胃黏膜慢性炎症程度：a) 正常：单个核细胞每高倍视野不超过个。b) 轻度：慢性炎性细胞不超过黏膜层的；c) 中度：慢性炎性细胞不超过黏膜层的；d) 重度：慢性炎性细胞占据黏膜全层。 固有腺萎缩程度：a) 轻度：固有腺体数减少三分之一以内；b) 中度：固有腺体数减少介于原有腺体的-之间；c) 重度：固有腺体数减少超过。3) 对CAG模型大鼠的胃液量及酸度值进行测定取胃液离心，3500rpm/min，离心大概有10min，记录胃液量，取上清液，使用酸度检测工具测定 4) 对CAG模型大鼠的胃蛋白酶活性进行测定吸取上清液测量体积并转入管，离心10m

28、in，取上清按试剂盒说明书测定胃蛋白酶活性。2.2.5 统计及分析采用SPSS 22.0统计分析软件进行统计学处理，计量资料以（x s）表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间比较若方差齐用SNK法，若方差不齐Dunnett T3法。P0.05为差异有统计学意义。计数资料数据采用Chi-Square test检验（卡方检验），P0.05为表示差异具有统计学意义。2.2.6 实验难点1) 采用何种方法进行模型复制，如何判定模型复制成功；2) 艾普拉唑联合参七肚痛汤对CAG模型大鼠治疗的主要评价指标；3) 适宜的给药剂量和给药次数第3章 艾普拉唑联合参七肚痛汤对CAG大鼠的机制研究3.1 实验材料

29、3.1.1 实验动物SD（Sprague-Dawley）大鼠120只，雌雄各半，体重大概在200g左右，SPF级。3.2.2 实验药品及试剂1) 受试药艾普拉唑肠溶片，参七肚痛汤，药物组成主要为：人参10克，黄芪15克，山药30克，延胡索10克，三七6克，丹参30克，郁金10克，佛手30克，百合30克，白芍20克，炙甘草10克，半夏10克。2) 化学试剂ELISA试剂盒、TBST缓冲液、ECL发光液、水合氯醛、福尔马林。3.2.3 实验仪器切片机、光学显微镜、Minichemi发光成像仪检测、离心机、切片机、包埋机、电子天平。3.2.4 其他仪器镊子，滤纸，烧杯，离心管（规格：2ml，5ml，

30、15ml，50ml），量筒，药匙，移液枪（规格：200l，1ml，5ml），枪头（规格：200l，1ml，5ml），注射器（规格：1ml，5ml，10ml），手术剪刀，棉球，冰盒等。3.2.5 蛋白质印记法（Western Blot）试剂配制1) 1.5mol Tris-HCl，PH8.8：18.16g Tris溶于60ml dd H2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100ml，4保存。2) 1.0mol Tris-HCl，PH6.8：12.12g Tris溶于60ml dd H2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100ml，4保存。3) 10%SDS：10gSDS溶于90ml dd H

31、2O，轻柔搅拌，溶解后加水定容至100m。4) 10TBS（Tris buffer solution），PH7.6：24.2g Tris，80g NaCl，溶于700 ml dd H2O 用1mol HCl（约15ml）调节PH至7.6，加dd H2O 至1000ml。5) TBS-T，PH7.6：前述TBS-T加Tween-20使浓度为0.1%。6) 5电泳缓冲液，PH8.3:15g Tris，72g甘氨酸，5gSDS溶于1000 ml dd H2O，4保存。（若有沉淀出现，用前加热至室温即可）。7) 转移缓冲液（25mM Tris、192mM甘氨酸、20%甲醇），PH8.3：3.03g T

32、ris，14.4g 甘氨酸，200ml甲醇加dd H2O至1000ml。（勿用酸碱调节PH）8) 10mM PMSP液：异丙醇8ml，PMSF 0.01742g溶解后定容至10ml。（使用时按照10ml裂解液：1ml 10mM PMSF）9) 裂解缓冲液；包含50mmol/L Tris-HCl（PH8.0）,150mmol/L NaCl，1%TritonX：配置100ml的裂解缓冲液，需称取Tris0.61g溶解于60 ml dd H2O，用浓盐酸调节PH8.0，然后NaCl 0.88g，TritonX-100 1ml，加水至总量为100ml。10) PBS 800ml蒸馏水中加入NaCl 1

33、8g；KCL 2.0g，Na2HPO4 1.44g和KH2PO4 0.24g，用浓盐酸调节PH至7.4，定容至L，高压灭菌。11) 10%过硫酸铵（APS）：称取APS 0.5g溶解于5 ml dd H2O中，分装避光保存于4。12) 1%溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝溶解于10 ml dd H2O中，分装保存于4。13) 30%丙烯酰胺（Acr: Bis = 29:1）：称取丙烯酰胺（Acr）29g，甲叉丙烯（Bis）1g，用去离子水溶解并稀释至100ml，储存在棕色瓶中于4保存。14) Sample Buffer：3.8mldd H2O，1.0ml 0.5M Tris-HCl，0.8ml甘油，

34、1.6ml 10% SDS，0.4ml-疏基乙醇，0.4ml 1%溴酚蓝。3.2 实验方法3.2.1 CAG大鼠模型复制同2.2.13.2.2 模型判定标准同2.2.23.2.3 分组及给药同2.2.33.3.4 标本采集采取标本前各组不给实验鼠喂食但是给予水24h，10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，麻醉状态下，结扎贲门，取胃，将胃沿胃大弯剪开，除去胃容物，生理盐水冲洗干净，与15%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，经HE染色组织病理学切片观察。3.3.5 主要评价指标1) 蛋白质印迹法（Western blot）检测Bcl-2及Bax蛋白： 提取总蛋白取适量胃组织，按1g组织中加入冰预冷的1

35、0ml裂解液，10mM PMSF 1ml冰上制成10%的组织匀浆，取1ml匀浆，使用4低温离心，12000rpm，30min，取少量上清液进行蛋白定量，余下-20保存备用。 蛋白质定量（考马斯蓝量染色法）考马斯亮蓝G-250 是一种染料，其中的元素是蛋白质。，最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质作用后就会变成考马斯亮蓝G-250蛋白质时，其实应该是一个复合药物。吸收峰的峰值从观测的数据看发生变化为595 nm，其吸光度与蛋白质含量有一定的关系，并且随着蛋白质的含量越多，吸收光度的能力就越强，所以要对蛋白质的含量做实验数据的收集观测。按下表操作。加入物空白管测定管PBS150l145l考马斯亮蓝

36、染液2.85ml2.85ml蛋白质提取液5l摇匀，室温放置5分钟，空白调零，于595nm处比色绘制标准曲线，计算测定管的浓度 SDS-PAGE分离蛋白a) 制胶：装配好制胶玻璃板后，按下表配制12%的分离胶12的凝胶溶液体积10 mldd H2O3.3ml30丙烯酰胺溶液4ml1.5M Tris 2.5ml10SDS100l10过硫酸胺100lTEMED4l将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。混匀后将液体注入到胶玻璃片距离梳齿下1cm，操作中注意防止产生气泡，实验操作后大概半小时再对其用ddH2O进行封闭。按下表配制5的聚集胶5的凝胶溶液体积5mldd H2O3.4ml30丙烯

37、酰胺溶液0.83ml1.0M Tris 0.63ml10SDS50l10过硫酸胺50lTEMED5l将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED混匀。在注入聚集胶之前，要弄干上面的水。操作过程中阻止气泡的产生。插入梳齿，聚胶30min，小心拔除梳齿，用ddH2O清洗梳孔，电泳槽中加入电泳缓冲液至所需量，准备上样。 蛋白质样品处理用Sample Buffer 按1：1稀释样品，95加热变性5分钟。 上样及电泳将电泳槽内注满1电泳缓冲液，除去气泡，两边空白的泳道点上等量的Sample Buffer ，其余泳道上样量为20l含40g蛋白，盖上盖子，实验开始的电压是80V，染料与分离胶结合后，再

38、逐渐调高电压，当染料到达分离胶底部约80min，关闭电源 转膜准备6块滤纸和一块NC膜，其大小与胶一样，将滤纸浸泡在实验所需液体中时间保持在五分钟，用以除去气泡，凝胶电泳完成后取出。按照海绵3块滤纸凝胶NC膜剩余滤纸按顺序放海绵，注意要防止气泡的产生。然后进行固定，放入转移内槽及外槽，注入已经冷却好了的转移缓冲液。转移200mA稳流，4，1.5h。 封闭BC膜转移完成后，将膜取出来放在准备好的滤纸上放平，再做好标记，室温下干燥数分钟。用western blotting封闭液封闭NC膜，室内温度下振荡1小时后4过夜。 一抗结合一抗用封闭液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(-actin

39、)的比例去配制），室内温度振摇2小时，TBS-T洗膜3次，保持10分钟以内。 二抗结合二抗用TBS-T稀释（按1：600配制），室温振摇孵育1.5小时，用TBS-T洗膜3次，和第一次趋同。 显色a) 在试管中先加入1mlHRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A500l、试剂B500l、C500l，将它们混合均匀b) 放置在干燥处，不能受到阳关曝晒，30min内使用。c) 室温下染色时间为530min，可根据颜色变化掌握染色时间。d) 等目的条带显色后，用少量PBS清洗。 观察、照相，将条带转换进电脑后进行分析3.3.6 统计及分析采用SPSS 22.0统计分析软件进行统计学处理，计量资料以（x s

40、）表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间比较若方差齐用SNK法，若方差不齐Dunnett T3法。P0.05为差异有统计学意义。计数资料数据采用Chi-Square test检验（卡方检验），P0.05为表示差异具有统计学意义。第4章 可行性论证经查阅大量文献和相关资料，了解到艾普拉唑与之前所用到的相同类型的药品相比较、药动学方面都具备一定的优势。艾普拉唑是新型抑制类药剂，它的类型是质子泵，对胃酸的产生有一定的阻碍作用，还能有效的缓解Hp带来的影响283029。近年来，中西医结合治疗的理念开始得到普遍的应用，且中西医联合治疗慢性萎缩性胃炎的研究增多，临床疗效较佳，安全性较高。所以从中西医联合

41、及外治方面治疗慢性萎缩性胃炎在临床上具有的独特优势。中医将慢性萎缩性胃炎归为胃脘痛、呃逆、痞满等范围，参七肚痛汤药物组成主要为：人参10克，黄芪15克，山药30克，延胡索10克，三七6克，丹参30克，郁金10克，佛手30克，百合30克，白芍20克，甘草10克。药材人参的口味有些许甘甜，其药性有一定的寒性、但是也有一定的温度，没有毒素。本草经注集：“对五府六脏有滋补的功效，安精神，定魂魄。缓解人们的紧张情绪，去除体内的浊气，对眼睛也有好处。使得人开心增长智力，还能温暖肠胃，治疗心中的郁闷和腹部肿胀，还对霍乱上吐下泻有治疗作用。调节人体的内分泌，消除口渴的病态，活血化瘀，功效强大。药材郁金，有刺激

42、性、味道苦，药性寒冷。归心、肝、胆经。有活血化瘀，痛，疏通胸气，缓解心中郁闷，清凉解毒，利胆退黄。本草备要：“行气，解郁；泄血，破瘀。”纲目：“补气血，治疗腹痛疾病，有利于产后的恢复，”李杲曰：“治阳毒入胃，下血频痛。”黄芩药材味道是苦的，形状扁平，是寒性很强的药物，没有毒。主要是为了治疗热病，黄胆症状，治疗肠胃疾病，治疗腹泻，祛除身体积水，还有治疗创伤。本经：“诸热黄胆，肠 泄痢，逐水。”别录：“治疗口痰，温暖胃部，治疗小腹疼痛疾病，消食，有利于肠道顺畅。药材延胡索，辛、味道苦，寒。养肝养脾。活血，行气，止痛。用于胸部疼痛疾病。本草纲目中提到其作用可以，活血化瘀，气血顺畅，止痛，有利于通便排

43、泄。本经逢原：“延胡索色黄入脾胃，能活血止痛，治小便溺血。得五灵脂同入肝经散血破滞。”百合味甘，平，无毒。可以有效祛除身体的浊气，消除腹胀，缓解心痛，利于通便，对身体有良好的滋补作用，养阴清热，滋补精血。消除身体浮肿，胪胀，痞满，寒热，通身疼痛等病状。药材半夏，辛，药性较温；有一定的毒素。养脾养胃，疏通肺部。削弱燥热湿气，治疗口痰疾病，治疗呕吐，消痞散结功效良好。炙甘草甘，平。归心、肺、脾、胃经 滋阴养血，益气通阳，复脉定悸健脾益气。脘腹或四肢挛急作痛,缓急止痛。现代越来越多的研究显示，胃黏膜发生不良的转换其原因与细胞的新陈代谢有一定的关系，细胞的新陈代谢是一个动态的过程，其作用变化的情况对胃

44、黏膜发生致病有一定的影响31。细胞衰败影响胃粘膜上皮细胞，胃黏膜上皮的细胞在新陈代谢过程中出现病变，长期以往，就会导致胃癌。通过研究所得的数据来看，胃黏膜细胞衰败是数量增加，会导致黏膜萎缩、肠化乃至癌变都有密切关系，细胞衰败死亡是胃癌发生的重要因素3234。所以从细胞凋亡的角度探讨艾普拉唑联合参七肚痛汤对CAG的作用机制是可行的。实验用了复合造膜法即N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）溶液灌胃+雷尼替丁自由食用+饥饱失常和去氧胆酸钠+氨水+酒精+两种综合法分别copy慢性萎缩性胃炎大实验鼠，实验方法目前较成熟，造模方法简单，创造实验模型的周期不长，且实验模型易形成，具有良好的持久稳定性

45、，在模型中注入病因子CAG，发病的原因在模型上发病状况相同，病理改变具有临床CAG胃黏膜的病理特点，所以模型实验数据可靠3541。为本实验探讨艾普拉唑联合参七肚痛汤治疗CAG癌前病变提供了较为合适的动物模型，并为研究艾普拉唑联合参七肚痛汤治疗CAG的干预作用及其可能的细胞凋亡机制提供重要技术保障。综上所述，该实验方案可行，实验技术成熟，具备可行性。第5章 预期结果及分析5.1 对CAG大鼠的干预作用5.1.1 大鼠的一般生理状况及体重变化预期结果：实验大鼠造膜期间，与空白对照组比较，模型组大鼠可能出现毛发松散，较无光泽，精神较萎靡，体重增长缓慢，食欲下降等现象；实验给药结束后，空白对照组、艾普

46、拉唑组、联合参七肚痛汤各剂量组大鼠的体重应高于模型组，且联合参七肚痛汤中、高剂量组大鼠的体重高于艾普拉唑组。5.1.2 对CAG大鼠模型胃组织病理学的影响10倍视野下随机选取胃窦部分分别观察显微镜下粘膜肌层厚度/胃粘膜固有层厚度、胃黏膜慢性炎症程度及固有腺体萎缩程度的预期结果差异： 与空白对照组相比，模型组炎症应该更严重，空白组未见明显炎症；各给药组与模型组比较，联合参七肚痛汤中、高剂量组炎症程度可能会显著降低，联合参七肚痛汤低剂量组炎症程度相对降低。 与空白对照组比较，模型组萎缩应该更严重，空白组未见明显萎缩；各给药组与模型组比较，联合参七肚痛汤中、高剂量组萎缩程度可能会显著降低，联合参七肚

47、痛汤低剂量组萎缩程度相对降低。 与空白对照组比较，模型组粘膜肌层厚度/胃粘膜固有层厚度值应该小于空白对照组；各给药组与模型组比较，各给药组粘膜肌层厚度/胃粘膜固有层厚度值可能升高；联合参七肚痛汤各剂量组可能会有不同程度的改善胃萎缩现象。5.1.3 对CAG模型大鼠胃液量及酸度的影响预期结果：与空白对照组比较，模型组大鼠胃液量应该减少,胃液酸度降低；与模型组比较，联合参七肚痛汤各剂量组大鼠的胃液分泌量和胃液酸度可能存在不同程度的升高。5.1.4 对CAG模型大鼠胃蛋白酶活性的影响预期结果：与空白对照组比较，模型组大鼠的胃蛋白酶活性可能显著降低；与模型组比较，联合参七肚痛汤各剂量组大鼠胃蛋白酶活性可能存在不同程度的升高现象5.1.5 预期结果分析讨论慢性萎缩性胃炎临床上病理结果主要表现为胃