荧光免疫技术幻灯片.ppt

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1、荧光免疫技术第1页，共67页，编辑于2022年，星期二第二节第二节 荧光抗体技术荧光抗体技术一、标本的制作一、标本的制作二、荧光抗体的制备二、荧光抗体的制备三、荧光抗体染色与结果判断三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构四、荧光显微镜的基本结构第三节第三节 荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定三、荧光酶免疫测定第2页，共67页，编辑于2022年，星期二第四节第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用一、荧光抗体技术的应用二、荧光免

2、疫测定的应用二、荧光免疫测定的应用思考题思考题小结小结第3页，共67页，编辑于2022年，星期二第一节第一节 概概 述述第4页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光荧光（fluorescencefluorescence）荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。光。一、荧光的基本知识一、荧光的基本知识第5页，共67页，编辑于2022年，星期二发射光谱和激发发射光谱和激发光谱光谱 发射光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样

3、品发射是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。荧光的强度。激发光谱激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光的基本知识荧光的基本知识第6页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光效率荧光效率定义定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式计算公式:荧光效率荧光效率=荧光的基本知识荧光的基本知识第7页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光寿命荧光寿命定义定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时荧光物质被激发后所

4、产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识荧光的基本知识第8页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光淬灭荧光淬灭 定义定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（2020）、苯胺、酚、硝）、苯胺、酚、硝基苯、基苯、I I-等等。荧光的基本知识荧光的基本知识第9页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光偏振荧光偏振 FHFL PFHFL荧光的基本知识荧光的基本知识第10页，共67页，编辑于20

5、22年，星期二荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大吸收光谱最大发射光谱最大发射光谱应用应用异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm（黄绿色）（黄绿色）FATFAT、荧光偏振免疫测定、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明四乙基罗丹明(RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或双标记的衬比染色或双标记FATFAT四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC)(TRITC)550nm550nm620nm620nm（橙红色）（橙红

6、色）FITCFITC的衬比染色或双标记的衬比染色或双标记FATFAT藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（红色）（红色）双标记双标记FATFAT、流式细胞术、流式细胞术7-7-氨基氨基-4-4-甲基香豆素甲基香豆素354nm354nm430nm430nm（蓝色）（蓝色）双标记或多标记双标记或多标记FATFATEuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm613nm613nm时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光物质荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。常用的荧光物质常用的荧光物质 二、荧光物质二、荧光物质第11页，共67页，

7、编辑于2022年，星期二第二第二节节 荧光抗体技术荧光抗体技术第12页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光抗体技术的基本原理荧光抗体技术的基本原理 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。自身抗体进行定性和滴度测定。第13页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光抗体技术的内容荧光抗体技术的内容 荧光抗体制备荧光抗体制备 标本

8、制作标本制作 荧光抗体染色荧光抗体染色 荧光显微镜检查荧光显微镜检查第14页，共67页，编辑于2022年，星期二抗体要求抗体要求 高特异性高特异性 高亲和力高亲和力 经纯化提取经纯化提取IgGIgG 一、荧光抗体的制备一、荧光抗体的制备第15页，共67页，编辑于2022年，星期二v有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。而未结合的色素及其降解产物易于清除。v荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。v荧光色泽与背景组织的色泽对

9、比鲜明。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。v与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。v标记方法简单、安全无毒。标记方法简单、安全无毒。v与蛋白质的结合物稳定，易于保存。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光素要求荧光抗体的制备荧光抗体的制备第16页，共67页，编辑于2022年，星期二抗体的荧光素抗体的荧光素标记标记v标标记记原原理理:利利用用抗抗体体蛋蛋白白的的自自由由氨氨基基与与FITCFITC的的异异硫硫氰氰基基在在碱碱性性溶溶液液中中形形成成硫硫碳碳酰胺键，使抗体与酰胺键，使抗体与FITCFITC结合成荧光抗体。结合成荧光抗

10、体。v标记方法标记方法:搅拌法：搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短，短，荧光素用量少，但有非特异性染色。荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特非特异染色较低。异染色较低。荧光抗体的制备荧光抗体的制备第17页，共67页，编辑于2022年，星期二v去除游离荧光素及其降解产物：去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤透析或凝胶过滤v去除荧光素未结合和结合过度的抗体：去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法阴离子

11、交换层析法v去除交叉反应或非期望抗体：去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯荧光抗体的纯化化荧光抗体的制备荧光抗体的制备第18页，共67页，编辑于2022年，星期二v荧光素与蛋白结合率：荧光素与蛋白结合率：F/P=F/P=v抗体效价：抗体效价：双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验v抗体特异性：抗体特异性：吸收试验、抑制试验吸收试验、抑制试验v抗体抗体特异性染色滴度：抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释倍比稀释荧光抗体的荧光抗体的鉴定鉴定荧光抗体的制备荧光抗体的制备第19页，共67页，编辑于2022年，星期二v-20-20：保存保存1 12 2年年v真

12、空干燥：真空干燥：长期保存长期保存荧光抗体的保荧光抗体的保存存荧光抗体的制备荧光抗体的制备第20页，共67页，编辑于2022年，星期二组织切片：组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：培养细胞：单层培养细胞单层培养细胞标本的类标本的类型型二、标本的制作二、标本的制作第21页，共67页，编辑于2022年，星期二冷冻切片：冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清

13、晰。石蜡切片：石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织切片的组织切片的类型类型标本的制作标本的制作第22页，共67页，编辑于2022年，星期二固定剂：固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保保 存：存：44、-20-20标本标本的固定和的固定和保存保存标本的制作标本的制作第23页，共67页，编辑于2022年，星期二直接直接法法直接荧光抗体染色法示意图直接荧光抗体染色法示意图 荧光素标记的特异性荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原抗体直接与相应抗原反应。反应。三、荧光抗体染色及结果判断三、荧光抗体染色及结果判断第24页，共67页，编辑

14、于2022年，星期二间接法间接法特异性抗体与相应抗原反特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。再与第一抗体结合。间接荧光抗体染色法示意图间接荧光抗体染色法示意图 荧光抗体染色及结果判断第25页，共67页，编辑于2022年，星期二双标记双标记法法 两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断荧光抗体染色及结果判断第26页，共67页，编辑于2022年，星期二 设立实验对照设立实验对照:阳性对照和阴性对照阳性

15、对照和阴性对照 区分特异和非特异染色区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果荧光抗体染色结果判断判断荧光抗体染色及结果判断荧光抗体染色及结果判断第27页，共67页，编辑于2022年，星期二 “-”“-”：无或仅见极微弱荧光。无或仅见极微弱荧光。“+”“+”：荧光较弱但清楚可见。荧光较弱但清楚可见。“+”“+”：荧光明亮。荧光明亮。“+”“+”：耀眼强荧光。耀眼强荧光。特异荧光强度特异荧光强度“+”“+”以上判定为阳性，对照光应呈以上判定为阳性，对照光应呈“-”“-”或或“”“”。根据呈根据呈+的血清最高稀释度判定特

16、异性抗体效价。的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。荧光抗体染色结果荧光抗体染色结果判断判断荧光抗体染色及结果判断荧光抗体染色及结果判断第28页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光显微荧光显微镜镜 利用一定波长的激发光对样品利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。位、定量观察检测。四、荧光显微镜的基本结构四、荧光显微镜的基本结构第29页，共67页，编辑于2022年，星期二光源：光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：滤光片：隔热、激发和吸收滤光片隔热

17、、激发和吸收滤光片光路：光路：透射光、落射光透射光、落射光聚光器：聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：镜头：消色差镜头消色差镜头 荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构第30页，共67页，编辑于2022年，星期二隔热滤光片：隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，的光域，提供合适的激发光。提供合适的激发光。吸收滤光片：吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。位

18、于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微荧光显微镜镜滤光片滤光片荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构第31页，共67页，编辑于2022年，星期二透射光：透射光：照明光线从标本照明光线从标本下经聚光器透过标本进入下经聚光器透过标本进入物镜。物镜。落射光：落射光：照明光线从标本上照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路透射荧光显微镜光路(a)(a)落射荧光显微镜光路落射荧光显微镜光路(b)(b)荧光显微荧光显微镜镜光路光路荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构第32页，共67页，编辑于

19、2022年，星期二第三第三节节 荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的类型第33页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光免疫分析的基本原理荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。定量测定。第34页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光抗体技荧光抗体技术术荧光免疫荧光免疫测定测定均相荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneous fluorescence hom

20、ogeneous fluorescence immunoassayimmunoassay）非均相荧光免疫测定非均相荧光免疫测定（heterogeneous fluorescence heterogeneous fluorescence immunoassayimmunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术的类型荧光免疫技术的类型第35页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光免疫测定的

21、方法类型荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定：非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定第36页，共67页，编辑于2022年，星期二自发荧光寿命短自发荧光寿命短:1ns1ns10ns10ns镧系元素寿命长镧系元素寿命长:10s10s1000s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定镧系短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光元素特异荧光 基本原理基本原理时间分辨检测原理示意图时间分辨检测原理示意图时间分辨时间分辨一、时间分辨荧光免疫测定一、时间分辨荧光免疫测定第37页，

22、共67页，编辑于2022年，星期二stokesstokes位移位移:激发光谱和发射光谱的波长差激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素镧系元素StokesStokes位移大位移大(273nm)(273nm)，激发光谱，激发光谱 和发射光谱不重叠和发射光谱不重叠stokesstokes位移位移基本原基本原理理时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第38页，共67页，编辑于2022年，星期二发射光谱带较窄：发射光谱带较窄：613nm10nm613nm10nm，干扰少，干扰少 激发光谱带较宽：激发光谱带较宽：300nm300nm350nm350nm，灵敏度高，灵敏度高基本原基本原理理发射光谱和激发光谱发

23、射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第39页，共67页，编辑于2022年，星期二比活性：比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源荧光激发光源10001000次次/S/S激发，比活性提高激发，比活性提高基本原基本原理理荧光标记物的相对比活性荧光标记物的相对比活性时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第40页，共67页，编辑于2022年，星期二结合结合-二酮体二酮体EuEu3+3+解离解离酸性增强液酸性增强液荧光增强荧光增强EuEu3+3+标记抗原抗标记抗原抗体复合物体复合物基本原理基本原理信号增强信号增强时间分辨荧光免疫测定时

24、间分辨荧光免疫测定第41页，共67页，编辑于2022年，星期二 镧系元素镧系元素铕铕(Eu(Eu3+3+)（最常用）（最常用）钐钐(Sm(Sm3+3+)铽铽(Tb(Tb3+3+)钕钕(Nd(Nd3+3+)镝镝(Dy(Dy3+3+)标记物标记物荧光物质荧光物质荧光寿命荧光寿命(ns)(ns)荧光物质荧光物质荧光寿命荧光寿命(ns)(ns)非特异荧光背景非特异荧光背景1 11010SmSm3+3+-NTA-NTA6500065000人血清蛋白人血清蛋白4.14.1SmSm3+3+-PTA-PTA6000060000球蛋白球蛋白3.03.0EuEu3+3+-NTA-NTA714000714000细胞

25、色素细胞色素C C3.53.5EuEu3+3+-PTA-PTA925000925000FITCFITC4.54.5TbTb3+3+-PTA-PTA9600096000丹黄酰氯丹黄酰氯1414DyDy3+3+-PTA-PTA10001000罗丹明罗丹明B B3.03.0常见荧光物质的荧光寿命时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第42页，共67页，编辑于2022年，星期二标记方标记方法法 双功能螯合剂：双功能螯合剂：1-1-（对（对-苯偶氮）苯偶氮）-EDTA-EDTA异硫氰酸苯基异硫氰酸苯基-EDTA-EDTA异硫氰酸苯甲基异硫氰酸苯甲基-DTTA-DTTA二乙烯三胺五乙酸（二乙烯三胺五乙酸

26、（DTPADTPA）标记方法：标记方法：一步法：先螯合一步法：先螯合EuEu3+3+，再连接蛋白质，再连接蛋白质二步法：先连接蛋白质，再螯合二步法：先连接蛋白质，再螯合EuEu3+3+时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第43页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类方法类型型 双抗体夹心法双抗体夹心法 固相抗体竞争法固相抗体竞争法 固相抗原竞争法固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第44页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类方法类型型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图双抗体夹心法双抗体夹心法固相抗体和固相抗体和E

27、uEu3+3+标记抗体与待检标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体抗原结合，形成固相抗体-待检待检抗原抗原-Eu-Eu3+3+标记抗体复合物，酸标记抗体复合物，酸性增强液下，性增强液下，EuEu3+3+解离，解离，340nm340nm激激发光下发射发光下发射613nm613nm荧光。荧光。时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第45页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类方法类型型固相抗体竞争法固相抗体竞争法 待检抗原和待检抗原和EuEu3+3+标记抗原与固相抗体竞争结合标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧测定荧光强度，荧光强

28、度与待检抗原含量成反比。光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第46页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类方法类型型固相抗原竞争法固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的待检抗原和固相抗原竞争结合定量的EuEu3+3+标记抗体，温育标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第47页，共67页，编辑于2022年，星期二灵敏度高灵敏度高：最小检出量最小检出量1010-18-18mol/Lm

29、ol/L分析范围宽：分析范围宽：4 45 5个数量级个数量级标记物稳定：有效使用期长标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化测量快速，易自动化易受污染，本底增高易受污染，本底增高方法评价方法评价时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第48页，共67页，编辑于2022年，星期二光线通过偏振滤光片后，光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称形成一个方向的平面光称为偏振光为偏振光。偏振荧光偏振荧光(绿光绿光,525nm,525nm550nm)550nm)偏振光偏振光(蓝光蓝光,485nm),485nm)荧光物质荧光物质基本原基本原理理二、荧光偏振免疫测定二、荧光偏振免疫测定第49页，共67页

30、，编辑于2022年，星期二 抗原抗体竞争反应抗原抗体竞争反应AgAgF F分子小，转动速度快，偏振荧光弱分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgAgF F-Ab-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则若待检抗原多，则AgAgF F-Ab-Ab少，少，AgAgF F多，偏振荧光弱多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图荧光偏振免疫测定原理示意图 基基本本原原理理荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定第50页，共67页，编辑于2022年，星期二方法评方法评价价 样品用量少样品用量少 荧光素标记试剂稳定

31、，使用寿命长荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好重复性好 快速，易自动化快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定第51页，共67页，编辑于2022年，星期二基本原基本原理理荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 碱性磷酸酶标记抗体或抗原，碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，固相载体包被抗原或抗体，酶分解酶分解4-MUP4-MUP，脱磷酸根基团，脱磷酸根基团形成形成4-MU4-MU，360nm360nm激发光照射，激发光照射，发出发出4

32、50nm450nm荧光。荧光。三、荧光酶免疫测定三、荧光酶免疫测定第52页，共67页，编辑于2022年，星期二酶和荧光底酶和荧光底物物荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物 标记酶标记酶底物底物荧光产物荧光产物激发光激发光(nm)(nm)荧光荧光(nm)(nm)相应信号相应信号碱性磷酸酶碱性磷酸酶4-MUP4-MUP4-MU4-MU3603604504501010-半乳糖苷酶半乳糖苷酶4-MUG4-MUG4-MU4-MU3603604504501010辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HPAHPA二聚体二聚体3173174144140.030.03荧光酶免疫测定荧光酶免疫测

33、定第53页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类方法类型型 双抗体夹心法双抗体夹心法 双抗原夹心法双抗原夹心法 固相抗原竞争法固相抗原竞争法荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定第54页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类型方法类型双抗体夹心法双抗体夹心法固相抗体和酶标记抗体与固相抗体和酶标记抗体与待检原反应，形成固相抗待检原反应，形成固相抗体体-抗原抗原-酶标抗体复合酶标抗体复合物，加入底物进行酶促物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。检抗原含量成正比。荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图 荧光酶免疫测定荧光酶免疫测

34、定第55页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类方法类型型双抗原夹心法双抗原夹心法 固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原抗原-待检抗体待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定第56页，共67页，编辑于2022年，星期二方法类方法类型型固相抗原竞争法固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留除去未结

35、合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。含量成反比。荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定第57页，共67页，编辑于2022年，星期二方法评方法评价价 用酶和荧光底物的化学反应用酶和荧光底物的化学反应 作为放大系统，提高灵敏度作为放大系统，提高灵敏度背景荧光干扰测定，用固相背景荧光干扰测定，用固相 荧光酶免疫测定效果好荧光酶免疫测定效果好荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定第58页，共67页，编辑于2022年，星期二第四第四节节 荧光免疫技术在医学检验中的应用荧光免疫技术在医学检验中的应用第59页，

36、共67页，编辑于2022年，星期二自身抗体自身抗体检测检测抗核抗体抗核抗体(均质型均质型)抗核抗体抗核抗体(核膜型核膜型)抗核抗体抗核抗体(斑点型斑点型)一、荧光抗体技术的应用一、荧光抗体技术的应用第60页，共67页，编辑于2022年，星期二病原体病原体检测检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术的应用荧光抗体技术的应用第61页，共67页，编辑于2022年，星期二免疫病理免疫病理检测检测肿瘤（人肝癌细胞）肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用荧光抗体技术的应用第62页，共67页，编辑于2022年，星期二细胞表面抗原和受体细胞表面抗

37、原和受体检测检测将游离细胞作荧光抗体特异染色后，将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。理各种数据。特殊应用：流式细胞特殊应用：流式细胞分析分析荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CDCD抗原、抗原受体、补体受体、抗原、抗原受体、补体受体、FcFc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。群的鉴定和计数。荧光抗体技术的应用荧光抗体技术的应用第63页，共67

38、页，编辑于2022年，星期二|时间分辨荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原原/抗体等抗体等|荧光偏振免疫测定：荧光偏振免疫测定：药物、维生素、激素、常规生化项目等药物、维生素、激素、常规生化项目等|荧光酶免疫测定：荧光酶免疫测定：病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等物等二、荧光免疫测定的应用二、荧光免疫测定的应用第64页，共67页，编辑于2022年，星期二1 1荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？2 2常用

39、的荧光物质有哪些？常用的荧光物质有哪些？3 3荧光免疫技术有哪些类型？荧光免疫技术有哪些类型？4 4荧光抗体技术的基本原理是什么？荧光抗体技术的基本原理是什么？3 3什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？4 4荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？5 5荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型?思考题思考题第65页，共67页，编辑于2022年，星期二6 6时间分辨荧光免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型时间分辨荧光免疫测定的原理是什么？有哪

40、些方法类型?7 7荧光偏振免疫测定的原理是什么？荧光偏振免疫测定的原理是什么？8 8荧光酶免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型荧光酶免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型?9 9如何评价各种类型的荧光免疫测定？如何评价各种类型的荧光免疫测定？1010荧光免疫测定有何应用？荧光免疫测定有何应用？思考题思考题第66页，共67页，编辑于2022年，星期二荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，包括荧光抗体技术合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，包括荧光抗体技术和荧光免疫测定。和荧光免疫测定。荧光抗体技术是以荧光素标记抗体荧光抗体技术是以荧光素标记抗体,与抗原反应与抗原反应,在荧光显微镜下在荧光显微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行定性和定位检测观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行定性和定位检测,分分为直接法、间接法和双标记法等。为直接法、间接法和双标记法等。荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，检荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，进行定量测定，分为均相测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，进行定量测定，分为均相和非均相。和非均相。小小 结结第67页，共67页，编辑于2022年，星期二