荧光分析幻灯片.ppt

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1、荧光分析第1页，共23页，编辑于2022年，星期二光致发光光致发光分子吸收光能后的发光现象分子吸收光能后的发光现象 （荧光、磷光）（荧光、磷光）电致发光电致发光分子吸收电能后的发光现象分子吸收电能后的发光现象化学发光化学发光分子吸收化学能后的发光现象分子吸收化学能后的发光现象荧光和磷光的特点：荧光和磷光的特点：*及及 *n的电子跃迁，的电子跃迁，分子必须含分子必须含有不饱和官能团。有不饱和官能团。第2页，共23页，编辑于2022年，星期二2、分子荧光分析法的基本原理、分子荧光分析法的基本原理一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生1、电子自旋状态的多重性、电子自旋状态的多重性 单重态单

2、重态分子中所有电子自旋都配对的电子态。用分子中所有电子自旋都配对的电子态。用“S”表示。表示。基态为单重态的分子具有最低的能量。用基态为单重态的分子具有最低的能量。用“S0”表示。表示。激发过程不伴随自旋变化，形成第一激发单重态为激发过程不伴随自旋变化，形成第一激发单重态为S1，依次为依次为S2、S3等等 三重态三重态分子中价电子呈自旋平行的电子态。用分子中价电子呈自旋平行的电子态。用“T”表表示。示。激发过程伴随自旋变化，形成第一激发三重态为激发过程伴随自旋变化，形成第一激发三重态为T1，依次为依次为T2、T3等等第3页，共23页，编辑于2022年，星期二激发单重态和激发三重态分子的性质区别

3、激发单重态和激发三重态分子的性质区别（1）S态分子具有抗磁性，磁场中无能级分裂。态分子具有抗磁性，磁场中无能级分裂。T态分子具有顺磁性。态分子具有顺磁性。（2）电子在不同多重态间的跃迁需换向，不）电子在不同多重态间的跃迁需换向，不易发生。易发生。（3）激发单重态能量高于相应激发三重态的）激发单重态能量高于相应激发三重态的能量。能量。S2T2 S1 T1S0 T1是亚稳态是亚稳态（4）激发态分子平均寿命很短（）激发态分子平均寿命很短（10-8秒）秒）亚稳态分子平均寿命可达数秒钟亚稳态分子平均寿命可达数秒钟第4页，共23页，编辑于2022年，星期二2、内部转换（、内部转换（IC）和系间窜跃（）和系

4、间窜跃（ISC）振动弛豫振动弛豫电子由较高振动能级很快电子由较高振动能级很快（10-12s）转至同一激发态的最低振动能级。）转至同一激发态的最低振动能级。（无辐射去激过程）（无辐射去激过程）内部转换（内部转换（IC）相同多重态间的无辐相同多重态间的无辐射去激过程。（射去激过程。（S2S1）系间窜跃（系间窜跃（ISC）不同多重态间的无辐不同多重态间的无辐射去激过程。（射去激过程。（S1 T1）第5页，共23页，编辑于2022年，星期二发光机理发光机理(Jablonski Diagram)荧光寿命荧光寿命:109107 s磷光寿命磷光寿命:10410 s分子吸光与发光示意图分子吸光与发光示意图第6

5、页，共23页，编辑于2022年，星期二第7页，共23页，编辑于2022年，星期二3、荧光和磷光光谱的产生及类型、荧光和磷光光谱的产生及类型辐射去激辐射去激处于处于S1或或T1的最低能级的分子返回的最低能级的分子返回S0态时伴随的态时伴随的发光现象。发光现象。快速荧光快速荧光分子从分子从S1态最低能级返回态最低能级返回S0态各个振动能级所产态各个振动能级所产生的辐射光。（生的辐射光。（10-910-6s内完成）内完成）stokes位移位移荧光的波长总是比激发光波长长，能量比激荧光的波长总是比激发光波长长，能量比激发光小。发光小。磷光磷光分子从分子从T1态的最低能级返回态的最低能级返回S0态各个振

6、动能级产生态各个振动能级产生的辐射光。（的辐射光。（10-410s）磷光的波长比荧光更长，能量更小。磷光的波长比荧光更长，能量更小。慢速荧光慢速荧光分子经过系间窜跃至分子经过系间窜跃至T1后，因相互碰撞或激活后，因相互碰撞或激活作用又回到作用又回到S1态，然后再返回态，然后再返回S0态产生的荧光。态产生的荧光。同一物质在相同条件下产生的荧光波长相同（同一物质在相同条件下产生的荧光波长相同（S1 S0）第8页，共23页，编辑于2022年，星期二二、荧光的激发光谱和荧光发射光谱二、荧光的激发光谱和荧光发射光谱1、荧光的激发光谱、荧光的激发光谱 固定荧光发射波长，连续变化激发波长测固定荧光发射波长，

7、连续变化激发波长测得的荧光强度对波长的变化图象。峰值波长得的荧光强度对波长的变化图象。峰值波长为激发波长。为激发波长。2、荧光发射光谱（荧光光谱）、荧光发射光谱（荧光光谱）固定激发波长，连续变化发射波长，测得固定激发波长，连续变化发射波长，测得的荧光强度对波长的变化图象。峰值波长为的荧光强度对波长的变化图象。峰值波长为发射波长。发射波长。发射波长总是大于激发波长。（发射波长总是大于激发波长。（stokes位移）位移）第9页，共23页，编辑于2022年，星期二吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱蒽的蒽的激发光谱（吸收光谱）激发光谱（吸收光谱）和和发射光谱（荧光光谱）发射光谱（荧光光谱）激发光谱激发光

8、谱:Excitation Spectrum,激发波长激发波长:ex发射光谱发射光谱 Emission Spectrum,发射波长发射波长:em第10页，共23页，编辑于2022年，星期二荧光光谱的特点荧光光谱的特点StokesStokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长较长的波长.荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关.镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系系.第11页，共23页，编辑于2022年，星期二荧光定量分析的基础荧光定量分析的基础

9、 荧光强度荧光强度(F)与物质浓度与物质浓度(c)的关系的关系在在稀溶液稀溶液中：中：F2.3Kb cI02.3KAI0 荧光物质的荧光效率荧光物质的荧光效率(量子产率量子产率)：F荧光强度（相对强度）的单位为任意单位荧光强度（相对强度）的单位为任意单位荧光物质的吸光系数荧光物质的吸光系数 b液层厚度液层厚度 I0入射光强度入射光强度 K检测效率（由仪器决定）检测效率（由仪器决定）第12页，共23页，编辑于2022年，星期二当溶液浓度很稀时（当溶液浓度很稀时（A0.05）F=KC （荧光定量分析的依据）（荧光定量分析的依据）当当A 0.05时，时，F与与C偏离线性，偏离线性，F下降。下降。Fc

10、第13页，共23页，编辑于2022年，星期二荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系1.1.共轭效应共轭效应 *跃迁跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基芳香族化合物、五元杂环上取代苯基.共轭体系越大共轭体系越大,越易产生荧光越易产生荧光,荧光效率也增大荧光效率也增大.(CH=CH)3=0.68(CH=CH)2=0.28第14页，共23页，编辑于2022年，星期二2.刚性结构和共平面效应刚性结构和共平面效应酚酞酚酞(无荧光无荧光)8羟基喹啉羟基喹啉(弱荧光弱荧光)红色荧光红色荧光CO-OOCOO-COCOO-ONO-NOMgNO荧光黄荧光黄第15页，共23页，编辑于2022年，星期二联二苯联二

11、苯 =0.2芴芴 =1.03,4-苯并芘苯并芘(强荧光物质强荧光物质)CH2第16页，共23页，编辑于2022年，星期二3.取代基的作用取代基的作用 给电子基增强荧光给电子基增强荧光：OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN吸电子基减弱荧光：吸电子基减弱荧光：COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I 与与 体系作用小的取代基影响不明显体系作用小的取代基影响不明显：SO3R,NH3,SH,F,R。COOHNO2I无荧光无荧光NH2OH比比荧光强荧光强50倍倍第17页，共23页，编辑于2022年，星期二 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光

12、和刚性会加强荧光:碱性碱性有荧光有荧光COOHOH无荧光无荧光OHCOOH水杨酸水杨酸中性、碱性中性、碱性均有荧光均有荧光OHOHCO第18页，共23页，编辑于2022年，星期二8.7.4 影响荧光强度的主要因素影响荧光强度的主要因素1.浓度浓度：稀溶液，：稀溶液，F c (bc0.05)2.光源光源：F I0 ，应强度大，稳定。应强度大，稳定。3.温度温度：T 低，低，增加。增加。荧光素钠的乙醇溶液荧光素钠的乙醇溶液,T0时时,每降低每降低10,增加增加3%,-80 时时=100%.4.酸度酸度：有荧光有荧光无荧光无荧光OHO第19页，共23页，编辑于2022年，星期二3、荧光光度计、荧光光

13、度计I0ItF氙灯氙灯(或高压汞灯）或高压汞灯）（200-800 nm)光电倍增管光电倍增管荧光光度计示意图荧光光度计示意图第20页，共23页，编辑于2022年，星期二一、基本装置及主要构件一、基本装置及主要构件1、光源、光源 高压汞灯、氙弧灯高压汞灯、氙弧灯2、单色器、单色器 滤光片（荧光计）：只能定量测定荧光强度，不能扫描滤光片（荧光计）：只能定量测定荧光强度，不能扫描激发光谱和发射光谱。激发光谱和发射光谱。光栅（荧光分光光度计）：即可作定量测定，也可扫描光谱。光栅（荧光分光光度计）：即可作定量测定，也可扫描光谱。激发光单色器的作用：从光源发射的光中分离出所需的激发光。激发光单色器的作用：

14、从光源发射的光中分离出所需的激发光。发射光单色器的作用：除去杂散光和杂质发射的荧光。发射光单色器的作用：除去杂散光和杂质发射的荧光。3、样品池（液池）、样品池（液池）四面透光的石英方形池（四面透光的石英方形池（1 cm 1 cm)4、检测器、检测器 光电倍增管（光电倍增管（PMT）5、记录系统、记录系统第21页，共23页，编辑于2022年，星期二4、荧光定量分析、荧光定量分析1、标准曲线法、标准曲线法 F=KC2、比较法、比较法 3、多组分混合物的测定、多组分混合物的测定F A发发/A激激=K（A）A发发/A激激CA+K（B）A发发/A激激CB F B发发/A激激=K（A）B发发/A激激CA+K（B）B发发/A激激CB 也可固定（也可固定（B激），在（激），在（A发）发）、（、（B发）处测发）处测F A发发/B激激 和和F B发发/B激激，解联立方程，解联立方程第22页，共23页，编辑于2022年，星期二MFS与与UV/Vis 法比较：法比较：原理原理UV/Vis 吸收吸收MFS 发射发射测定方法测定方法I0ItF灵敏度灵敏度,选择性选择性10-510-6molL-110-710-9 molL-1I0F第23页，共23页，编辑于2022年，星期二