第五章 酶分子的修饰优秀课件.ppt

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1、第五章第五章 酶分子的修饰酶分子的修饰第1页，本讲稿共15页PS:PS:PS:PS:肽链上某个氨基酸的改变会引起酶的化肽链上某个氨基酸的改变会引起酶的化学结构和空间构象的改变，从而改变酶的某学结构和空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能。些特性和功能。氨基酸置换修饰 将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。第2页，本讲稿共15页氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰一、功能：一、功能：1 1、通过修饰可以提高酶活力、通过修饰可以提高酶活力 例如，酪氨酸例如，酪氨酸例如，酪氨酸例如，酪氨酸-RNA-RNA-RNA-RNA合成酶可催化酪氨酸和与其相对应的合成酶可催化酪氨酸和与其相对应的合

2、成酶可催化酪氨酸和与其相对应的合成酶可催化酪氨酸和与其相对应的tRNAtRNAtRNAtRNA反反反反应生成酪氨酸应生成酪氨酸应生成酪氨酸应生成酪氨酸-tRNA-tRNA-tRNA-tRNA，若将该酶第，若将该酶第，若将该酶第，若将该酶第51515151位的苏氨酸（位的苏氨酸（位的苏氨酸（位的苏氨酸（ThrThrThrThr51515151）由）由）由）由脯氨酸置换，修饰后的酶对脯氨酸置换，修饰后的酶对脯氨酸置换，修饰后的酶对脯氨酸置换，修饰后的酶对ATPATPATPATP的亲和性提高近的亲和性提高近的亲和性提高近的亲和性提高近100100100100倍，酶活力倍，酶活力倍，酶活力倍，酶活力提

3、高提高提高提高25252525倍。倍。倍。倍。2 2、通过修饰可以增强酶的稳定性、通过修饰可以增强酶的稳定性 例如，例如，例如，例如，T T T T4 4 4 4-溶菌酶分子中的第溶菌酶分子中的第溶菌酶分子中的第溶菌酶分子中的第3 3 3 3位的异亮氨酸（位的异亮氨酸（位的异亮氨酸（位的异亮氨酸（IluIluIluIlu3 3 3 3）置换成）置换成）置换成）置换成半胱氨酸后，该半胱氨酸（半胱氨酸后，该半胱氨酸（半胱氨酸后，该半胱氨酸（半胱氨酸后，该半胱氨酸（CysCysCysCys3 3 3 3）可以与第）可以与第）可以与第）可以与第97979797位的半胱氨位的半胱氨位的半胱氨位的半胱氨（

4、CysCysCysCys97979797）酸形成二硫键，修饰后的）酸形成二硫键，修饰后的）酸形成二硫键，修饰后的）酸形成二硫键，修饰后的T4-T4-T4-T4-溶菌酶，其活力保持溶菌酶，其活力保持溶菌酶，其活力保持溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。第3页，本讲稿共15页3 3 3 3、通过修饰可以使酶的专一性发生改变、通过修饰可以使酶的专一性发生改变、通过修饰可以使酶的专一性发生改变、通过修饰可以使酶的专一性发生改变 例如，采用化学方法，将枯草杆菌蛋白酶活性中例如，采

5、用化学方法，将枯草杆菌蛋白酶活性中例如，采用化学方法，将枯草杆菌蛋白酶活性中例如，采用化学方法，将枯草杆菌蛋白酶活性中 心上心上心上心上的丝氨酸置换成半胱氨酸后，酶对蛋白质和多肽的水解活的丝氨酸置换成半胱氨酸后，酶对蛋白质和多肽的水解活的丝氨酸置换成半胱氨酸后，酶对蛋白质和多肽的水解活的丝氨酸置换成半胱氨酸后，酶对蛋白质和多肽的水解活性消失，而出现了催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性消失，而出现了催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性消失，而出现了催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性消失，而出现了催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性。性。性。性。第4页，本讲稿共15页氨基酸置换修饰氨基酸置换修

6、饰二、方法二、方法1、化学修饰法化学修饰法2、定点突变技术定点突变技术第5页，本讲稿共15页化学修饰法化学修饰法 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰法。化学修饰即通过化学用化学修饰法。化学修饰即通过化学手段将某些化学物质结合到蛋白质分手段将某些化学物质结合到蛋白质分子上或将蛋白质分子的某一部分去掉子上或将蛋白质分子的某一部分去掉或改变为其他基团的修饰方法或改变为其他基团的修饰方法。第6页，本讲稿共15页 例如，例如，Bender和和Kosland成功地利用成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修

7、饰后，该的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。第7页，本讲稿共15页 但以上讲的化学修饰具有明显的不专一但以上讲的化学修饰具有明显的不专一性，我们不想要的副反应也是不可避免的。性，我们不想要的副反应也是不可避免的。比如，往往是想修改的地方没有得到修改，比如，往往是想修改的地方没有得到修改，而不想改的地方却被改变，因此，修改的而不想改的地方却被改变，因此，修改的结果也很难判断，得到有用产品的概率很结果也很难判断，得到有用产品的概率很小。蛋白质具有复杂的空间结构，

8、外来化小。蛋白质具有复杂的空间结构，外来化学基团无力作用于分子内部一些疏水侧链学基团无力作用于分子内部一些疏水侧链氨基酸，所以，化学修饰对蛋白质缺陷的氨基酸，所以，化学修饰对蛋白质缺陷的改造具有很大的局限性，难以发挥作用。改造具有很大的局限性，难以发挥作用。而定点突变技术的出现，解决了这一难题。而定点突变技术的出现，解决了这一难题。第8页，本讲稿共15页定点突变技术定点突变技术现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。突变技术（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的

9、操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。第9页，本讲稿共15页定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程：定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程：（1 1 1 1）新的酶分子结构的设计：）新的酶分子结构的设计：）新的酶分子结构的设计：）新的酶分子结构的设计：根据已知的酶根据已知的酶根据已知的酶根据已知的酶RNARNARNARNA或蛋白的化学结构和空间结构及其特性，特别是根据或蛋白的化学结构和空间结构及其特性，特别是根据或蛋白的化学结构和空间结构及其特性，特别是根据或蛋白的化学结构和空间结构及其特性，特别是根据

10、酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，设酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，设酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，设酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，设计出欲获得的新的酶计出欲获得的新的酶计出欲获得的新的酶计出欲获得的新的酶RNARNARNARNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。确定欲置换的核苷酸或氨基

11、酸及其位置。确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。（2 2 2 2）突变基因碱基序列的确定：）突变基因碱基序列的确定：）突变基因碱基序列的确定：）突变基因碱基序列的确定：对于核算类酶，根据欲获得的酶对于核算类酶，根据欲获得的酶对于核算类酶，根据欲获得的酶对于核算类酶，根据欲获得的酶RNARNARNARNA的核苷酸排列次序，依照互补原则，的核苷酸排列次序，依照互补原则，的核苷酸排列次序，依照互补原则，的核苷酸排列次序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及其位置。确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及其位置。确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置

12、换的碱基及其位置。确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及其位置。对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的码，确定其对应的码，确定其对应的码，确定其对应的mRNAmRNAmRNAmRNA上的核苷酸序列，由于一种氨基酸所对应的密码子上的核苷酸序列，由于一种氨基酸所对应的密码子上的核苷酸序列，由于一种氨基酸所对应的密码子上的核苷酸序列，由于一种氨基酸所对应

13、的密码子不止一个，不同的物种对同义密码子的使用有很大差别，所以在确定所使不止一个，不同的物种对同义密码子的使用有很大差别，所以在确定所使不止一个，不同的物种对同义密码子的使用有很大差别，所以在确定所使不止一个，不同的物种对同义密码子的使用有很大差别，所以在确定所使用的密码子时，要充分考虑到物种间的差异；再依据碱基互补原则，确定用的密码子时，要充分考虑到物种间的差异；再依据碱基互补原则，确定用的密码子时，要充分考虑到物种间的差异；再依据碱基互补原则，确定用的密码子时，要充分考虑到物种间的差异；再依据碱基互补原则，确定此此此此mRNAmRNAmRNAmRNA所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要

14、置换的碱基及其位置。所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。第10页，本讲稿共15页 （3 3 3 3）突变基因的获得：）突变基因的获得：）突变基因的获得：）突变基因的获得：根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，首先用首先用首先用首先用DNADNADNADNA合成仪合成有合成仪合成

15、有合成仪合成有合成仪合成有1 1 1 12 2 2 2个碱基被置换了的寡核苷酸，再用个碱基被置换了的寡核苷酸，再用个碱基被置换了的寡核苷酸，再用个碱基被置换了的寡核苷酸，再用此寡核苷酸为引物通过聚合酶链反应（此寡核苷酸为引物通过聚合酶链反应（此寡核苷酸为引物通过聚合酶链反应（此寡核苷酸为引物通过聚合酶链反应（PCRPCRPCRPCR）或）或）或）或M M M M13131313质粒等定位突质粒等定位突质粒等定位突质粒等定位突变技术获得所需的大量突变基因。这称为寡核苷酸诱导的定位突变技术获得所需的大量突变基因。这称为寡核苷酸诱导的定位突变技术获得所需的大量突变基因。这称为寡核苷酸诱导的定位突变技

16、术获得所需的大量突变基因。这称为寡核苷酸诱导的定位突变。现在普遍采用的聚合酶链反应（变。现在普遍采用的聚合酶链反应（变。现在普遍采用的聚合酶链反应（变。现在普遍采用的聚合酶链反应（PCRPCRPCRPCR）技术以获得所需的基因。）技术以获得所需的基因。）技术以获得所需的基因。）技术以获得所需的基因。第11页，本讲稿共15页聚合酶链反应技术简称为PCR(polyme rase chain reaction)技术，是木里斯（Mollis）根据1971年柯拉那（Khorana）等人提出的基本原理，于1985年发明的DNA扩增技术。该技术的基本过程包括双链DNA的热变性（解链）、引物与单链DNA的退火

17、结合、引物的延伸3个步骤，这3个步骤反复进行，一般经过30次循环，可使目的基因扩增几百万倍。第12页，本讲稿共15页第13页，本讲稿共15页 利用定位突变技术进行酶分子修饰，突变基因中所需置利用定位突变技术进行酶分子修饰，突变基因中所需置利用定位突变技术进行酶分子修饰，突变基因中所需置利用定位突变技术进行酶分子修饰，突变基因中所需置换的碱基数目一般只有换的碱基数目一般只有换的碱基数目一般只有换的碱基数目一般只有1 1 1 1至至至至2 2 2 2个，就能达到修饰目的。现个，就能达到修饰目的。现个，就能达到修饰目的。现个，就能达到修饰目的。现举例如下：举例如下：举例如下：举例如下：酪氨酸酪氨酸酪

18、氨酸酪氨酸-tRNA-tRNA-tRNA-tRNA合成酶的修饰是将合成酶的修饰是将合成酶的修饰是将合成酶的修饰是将51515151位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨酸的密码子是酸的密码子是酸的密码子是酸的密码子是ACU,ACC,ACA,ACG,ACU,ACC,ACA,ACG,ACU,ACC,ACA,ACG,ACU,ACC,ACA,ACG,而脯氨酸的密码子为而脯氨酸的密码子为而脯氨酸的密码子为而脯氨酸的密码子为CCU,CCC,CCA,CCG,CCU,CCC,CCA,CCG,CCU,CCC,CCA,CCG,CCU,CCC

19、,CCA,CCG,虽然苏氨酸和脯氨酸各有四个密码子，但是在虽然苏氨酸和脯氨酸各有四个密码子，但是在虽然苏氨酸和脯氨酸各有四个密码子，但是在虽然苏氨酸和脯氨酸各有四个密码子，但是在mRNAmRNAmRNAmRNA上只需将密码子上的第一个碱基上只需将密码子上的第一个碱基上只需将密码子上的第一个碱基上只需将密码子上的第一个碱基A A A A换成换成换成换成C,C,C,C,在对应的基因上只需将在对应的基因上只需将在对应的基因上只需将在对应的基因上只需将T T T T换成换成换成换成G G G G即可达到置换目的。即可达到置换目的。即可达到置换目的。即可达到置换目的。T4-T4-T4-T4-溶菌酶的修饰

20、是将第溶菌酶的修饰是将第溶菌酶的修饰是将第溶菌酶的修饰是将第3 3 3 3位的异亮氨酸（密码子为位的异亮氨酸（密码子为位的异亮氨酸（密码子为位的异亮氨酸（密码子为AUU,AUC,AUA,AUU,AUC,AUA,AUU,AUC,AUA,AUU,AUC,AUA,对应基因上的碱基次序为对应基因上的碱基次序为对应基因上的碱基次序为对应基因上的碱基次序为TAA,TAG,TATTAA,TAG,TATTAA,TAG,TATTAA,TAG,TAT）置换成半）置换成半）置换成半）置换成半胱氨酸（密码子为胱氨酸（密码子为胱氨酸（密码子为胱氨酸（密码子为UGU,UGCUGU,UGCUGU,UGCUGU,UGC，对应

21、基因上的碱基次序为，对应基因上的碱基次序为，对应基因上的碱基次序为，对应基因上的碱基次序为ACA,ACGACA,ACGACA,ACGACA,ACG），），），），只需在对应基因的位点上置换只需在对应基因的位点上置换只需在对应基因的位点上置换只需在对应基因的位点上置换2 2 2 2个碱基，由个碱基，由个碱基，由个碱基，由ACACACAC置换置换置换置换TATATATA即可。即可。即可。即可。第14页，本讲稿共15页（4 4）新酶的获得：）新酶的获得：）新酶的获得：）新酶的获得：将上述定位突变获得的突变基因进行体外重组，插入到适宜将上述定位突变获得的突变基因进行体外重组，插入到适宜将上述定位突变获

22、得的突变基因进行体外重组，插入到适宜将上述定位突变获得的突变基因进行体外重组，插入到适宜的基因载体中，然后通过转化、转导、介导、基因枪、显微的基因载体中，然后通过转化、转导、介导、基因枪、显微的基因载体中，然后通过转化、转导、介导、基因枪、显微的基因载体中，然后通过转化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进行表达，就可获得经过修饰的新酶。行表达，就可获得经过修饰的新酶。行表达，就可获得经过修饰的新酶。行表达，就可获得经过修饰的新酶。第15页，本讲稿共15页