荧光光谱的原理与运用幻灯片.ppt

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1、荧光光谱的原理与运用荧光光谱的原理与运用第1页，共42页，编辑于2022年，星期二概述概述基本原理基本原理荧光分析方法荧光分析方法荧光法的应用荧光法的应用第2页，共42页，编辑于2022年，星期二荧光荧光当某种当某种常温物质常温物质经某种波长的入射光（通常是经某种波长的入射光（通常是紫外线或紫外线或X射线射线）照射，吸收光能后进入）照射，吸收光能后进入激发态激发态，并立即退激发并，并立即退激发并发出比发出比入射光入射光的波长的波长长的出射光长的出射光（通常波长在可见光（通常波长在可见光波段）；且一旦停止入射光，发光现象也随之波段）；且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消立即消失失。如右图为含有

2、奎宁的通宁水在紫外线的照射下发出荧光。第3页，共42页，编辑于2022年，星期二荧光的分类荧光的分类自发荧光自发荧光诱发荧光诱发荧光物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况:如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光物体经物体经荧光染料染色荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光后再通过紫外线照射发出荧光第4页，共42页，编辑于2022年，星期二荧光分析法荧光分析法荧光分析是指利用某些物质在被短波长光（一般为荧光分析是指利用某些物质在被短波长光（一般为紫紫外光外光）激发后产生荧光的）

3、激发后产生荧光的特性及其强度特性及其强度进行物质的进行物质的定性和定量定性和定量的分析的方法。的分析的方法。第5页，共42页，编辑于2022年，星期二荧光光谱法的特点荧光光谱法的特点灵敏度高灵敏度高最低检出限：质量分数最低检出限：质量分数10-610-9数量级，适用于痕量物质检测数量级，适用于痕量物质检测灵敏度比紫外灵敏度比紫外-可见分光光度法约高可见分光光度法约高24个数量级个数量级选择性好选择性好 只只要要利利用用单单色色器器控控制制激激发发光光和和荧荧光光的的波波长长，通通过过前前后后两两次次波波长长的的选选择择，可可得得到到比吸收光度计更强的选择性。比吸收光度计更强的选择性。应用还不够

4、广泛，尚待拓宽应用还不够广泛，尚待拓宽 多多数数物物质质本本身身不不会会产产生生荧荧光光，一一些些物物质质在在加加入入某某种种试试剂剂后后能能够够产产生生荧荧光光；对对环环境境因素（温度，酸度、溶解氧）极为敏感因素（温度，酸度、溶解氧）极为敏感第6页，共42页，编辑于2022年，星期二荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理第7页，共42页，编辑于2022年，星期二（1）分子的激发）分子的激发 基态基态激发态激发态(S1、S2、激发态振动能级）、激发态振动能级）单重态单重态：分子中所有电子自旋：分子中所有电子自旋都配对都配对的电子状态的电子状态三重态三重态：有：有两个两个电子的自旋电子的自旋不

5、配对不配对而平行的状态而平行的状态1.分子的激发与失活分子的激发与失活第8页，共42页，编辑于2022年，星期二1.分子的激发与失活分子的激发与失活（2）分子的失活）分子的失活处于处于激发态激发态的分子很不稳定，可能经过的分子很不稳定，可能经过辐射跃迁辐射跃迁和和非辐射非辐射跃迁跃迁的衰变过程而返回的衰变过程而返回基态基态。辐射跃迁辐射跃迁非辐射跃迁非辐射跃迁荧光荧光磷光磷光振动松弛振动松弛内转化内转化系间窜越系间窜越第9页，共42页，编辑于2022年，星期二l l 2l l 1l l 3l l 2T1S0S1S2荧荧光光磷磷光光系系间间窜窜越越内内转转化化内内转转化化系间窜越系间窜越振动松弛

6、振动松弛2.分子内的激发和衰变过程分子内的激发和衰变过程第10页，共42页，编辑于2022年，星期二l振动弛豫：振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中同一电子能级中的较的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。激发态分子常常首先发生振动驰豫。激发态分子常常首先发生振动驰豫。l内转换：内转换：相同多重态的两个电子能级间，相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能电子由高能级回到低能级的分子内过程。级的分子内过程。无辐射跃迁 第11页，共42页，编辑于2022年，星期二l系间窜越：系间窜越：激

7、发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变多重态发生变化化的过程。含有重原子的分子中（如的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最等），系间窜跃最常见。常见。l外转换：外转换：激发态分子激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。荧光熄灭或猝灭。第12页，共42页，编辑于2022年，星期二辐射跃迁辐射跃迁l荧光：荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达

8、受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。基态，发出荧光。由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。荧光波长一般比激发光波长长。第13页，共42页，编辑于2022年，星期二l磷光：磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的

9、形式再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。回到基态，发出的光线称为磷光。由由于于激激发发三三重重态态能能量量较较激激发发单单重重态态低低，所所以以磷磷光光的的波波长长比荧光的波长稍长。比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。磷光很少应用于分析。第14页，共42页，编辑于2022年，星期二3 3.荧光产生的过程：荧光产生的过程：（1 1）处于）处于基态最低振动能级基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照的荧光物质分子受到紫外线的照 射，吸收了和它所具有的特

10、征频率相一致的光线，跃迁到射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发第一电子激发态态的各个振动能级；的各个振动能级；（2 2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过 无辐射跃迁无辐射跃迁降落到降落到第一电子激发态的最低振动能级第一电子激发态的最低振动能级；（3 3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降 落到落到基态的各个不同振动能级基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是，同时发射出相应的光量子，这就是荧荧光光；（4 4）到达基态的各个不同振动能级

11、的分子再通过无辐射跃迁最后回到）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振基态的最低振动能级动能级第15页，共42页，编辑于2022年，星期二4.荧光与结构的关系 l电子跃迁类型电子跃迁类型 *的的荧荧光光效效率率高高，系系间间窜窜跃跃至至三三重重态态的的的的速速率率常常数数较小，有利于荧光的产生。较小，有利于荧光的产生。l共轭效应共轭效应 含有含有*跃迁能级的跃迁能级的芳香族化合物芳香族化合物的荧光最常见且最强。的荧光最常见且最强。具有具有较大共轭体系较大共轭体系或或脂环羰基结构脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能的脂肪族化合物也可能产生荧光。产生荧光。第16页，共42

12、页，编辑于2022年，星期二荧光产生的过程：荧光产生的过程：（1 1）处于）处于基态最低振动能级基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照的荧光物质分子受到紫外线的照 射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态第一电子激发态的各个振动能级；的各个振动能级；（2 2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过 无辐射跃迁无辐射跃迁降落到降落到第一电子激发态的最低振动能级第一电子激发态的最低振动能级；（3 3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降）降落到第一电子激

13、发态的最低振动能级的分子继续降 落到落到基态的各个不同振动能级基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是，同时发射出相应的光量子，这就是荧光荧光：（4 4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的基态的最低振动能级最低振动能级第17页，共42页，编辑于2022年，星期二2.2.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1 1）分分子子必必须须具具有有与与所所照照射射的的辐辐射射频频率率(紫紫外外-可可见见光光）相相适应的结构适应的结构（共轭（共轭键），才能吸收激发光键），才能吸收激发光 （2

14、 2）吸吸收收了了与与其其本本身身特特征征频频率率相相同同的的能能量量之之后后，必必须须具具有有一定的荧光量子产率一定的荧光量子产率。第18页，共42页，编辑于2022年，星期二（1）荧光与结构的关系 l电子跃迁类型电子跃迁类型 *的的荧荧光光效效率率高高，系系间间窜窜跃跃至至三三重重态态的的的的速速率率常常数较小，有利于荧光的产生。数较小，有利于荧光的产生。l共轭效应共轭效应 含有含有*跃迁能级的跃迁能级的芳香族化合物芳香族化合物的荧光最常见且的荧光最常见且最强。具有最强。具有较大共轭体系较大共轭体系或或脂环羰基结构脂环羰基结构的脂肪族化合物的脂肪族化合物也可能产生荧光。也可能产生荧光。第1

15、9页，共42页，编辑于2022年，星期二l取取代代基基效效应应：苯苯环环上上有有吸吸电电子子基基常常常常会会妨妨碍碍荧荧光光的的产生；而给电子基会使荧光增强。产生；而给电子基会使荧光增强。化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 荧光波长荧光波长/nm/nm C6H6（苯）（苯）10 10 270310 C6H5COOH C6H5NO230310390 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN1718202020270320285365285345310405280360 C6H5Cl C6H5BrC6H5I750275345290380第20页，共42页，编

16、辑于2022年，星期二l平面刚性结构效应平面刚性结构效应 可可降降低低分分子子振振动动，减减少少与与溶溶剂剂的的相相互互作作用用，故故具具有有很很强强的的荧荧光光。如如荧荧光光素素和和酚酚酞酞有有相相似似结结构构，荧荧光光素素有有很很强强的的荧光，酚酞却没有。荧光，酚酞却没有。第21页，共42页，编辑于2022年，星期二（2）荧光量子产率l物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示：）表示：l与失活过程的速率常数与失活过程的速率常数k k有关：有关：l凡凡是是使使荧荧光光速速率率常常数数k kf f增增大大而而使使其其他他失失活活过过程程（系系间间窜窜越

17、越、外外转转换换、内内转转换换）的的速速率率常常数数减减小小的的因因素素（环环境境因因素素和和结结构构因因素）都可使荧光增强。素）都可使荧光增强。第22页，共42页，编辑于2022年，星期二3.3.荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系l荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与与荧光物质的吸光程度荧光物质的吸光程度发射荧光的能力发射荧光的能力有关：有关：F=K（I0I）I0 入射光辐射强度；入射光辐射强度；I 透射光辐射强度；透射光辐射强度；K取决于荧光量子产率（取决于荧光量子产率（）。）。第23页，共42页，编辑于2022年，星期二Lam

18、bert-Beer 定律：定律：=第24页，共42页，编辑于2022年，星期二 溶液浓度较低时：溶液浓度较低时：当入射光的当入射光的1 1 和和 I0一定时一定时：F=K c 即：即：在在低低浓浓度度时时，溶溶液液的的荧荧光光强强度度与与荧荧光光物物质质的的浓浓度度成成正比。正比。这是荧光法定量的基础。这是荧光法定量的基础。但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当 kbc 0.05时才成立。时才成立。对于较浓溶液，由于对于较浓溶液，由于猝灭现象猝灭现象和和自吸收自吸收等原因，等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。使荧光强度和浓度不呈线性关系。第25页，共42页，

19、编辑于2022年，星期二4.4.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素（1 1）内部因素）内部因素l自猝灭自猝灭发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。l自吸收自吸收荧光化合物的发射的波长与其吸收的波长重叠，荧光化合物的发射的波长与其吸收的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，而使荧光被减弱。收，而使荧光被减弱。l荧光强度荧光强度F与光源的辐射强度与光源的辐射强度I0有关，因此有关，因此增大光增大光源辐

20、射功率源辐射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。可提高荧光测定的灵敏度。第26页，共42页，编辑于2022年，星期二（2）环境因素 pHpH值值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pHpH有关。有关。pHpH的变化影响了荧光基团的电荷状态，的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。从而使其荧光发生变化。溶解氧溶解氧 往往使往往使荧光强度降低荧光强度降低化合物化合物 相对荧光相对荧光强度强度 C6H5OH 18 C6H5O 0C6H5NH2 20C6H5NH3 +0温度温度 温度降低温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，会减少碰撞和非辐射失活

21、的概率，因此会因此会增加荧光强度增加荧光强度。第27页，共42页，编辑于2022年，星期二荧光分析仪荧光分析仪第28页，共42页，编辑于2022年，星期二光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器发射单色器发射单色器发射单色器发射单色

22、器荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计与与与与紫紫紫紫外外外外-可可可可见见见见分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计有有有有何何何何异异异异同同同同点？点？点？点？荧光分光光度计荧光分光光度计扫描激发光谱，选择激发波长扫描激发光谱，选择激发波长扫描发射光谱扫描发射光谱消除干扰消除干扰波长范围：波长范围：波长范围：波长范围：200800nm200800nm最广泛应用的连续光源最广泛应用的连续光源最广泛应用的连续光源最广泛应用的连续光源第29页，共42页，编辑于2022年，星期二l光源：光源：氙灯、氙灯、高压汞蒸气灯高压汞蒸气灯l单色器：单色器：激发单色器激发单色器选择激发

23、光波长选择激发光波长荧光单色器荧光单色器选择选择(测量测量)发射光（荧光）波长，发射光（荧光）波长，与激发光入射方向垂直。与激发光入射方向垂直。l样品池：样品池：采用低荧光材料，通常为石英池采用低荧光材料，通常为石英池l检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管第30页，共42页，编辑于2022年，星期二 荧光法的应用第31页，共42页，编辑于2022年，星期二1.1.荧光激发光谱和发射光谱荧光激发光谱和发射光谱（1 1）荧荧光光发发射射光光谱谱：固固定定激激发发光光的的波波长长，测测量量不不同同荧荧光光波波长长处处荧荧光光的的强强度度，得得到到荧荧光光光光谱谱，即即荧荧光强度光强度荧光波长图荧光波

24、长图。（2 2）荧荧光光激激发发光光谱谱（吸吸收收光光谱谱）：在在荧荧光光最最强强的的波波长长处处测测量量随随激激发发光光波波长长的的改改变变而而变变化化的的荧荧光光强强度度，得得到到荧荧光光激激发发光光谱谱。即即荧荧光光强强度度-激激发发光光波波长图。长图。第32页，共42页，编辑于2022年，星期二第33页，共42页，编辑于2022年，星期二a.Stokesa.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。激发光谱与发射光谱之间的波长差值。荧光荧光的波长总是大于的波长总是大于激发光的波长，这是由于振动弛豫和内转换过程损失了一定的能激发光的波长，这是由于振动弛豫和内转换过程损失了一

25、定的能量。量。b.b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光迁回到基态，产生波长一定的荧光。c.c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）样）成镜像对称成镜像对称关系。关系。激发光谱与发射光谱的关系第34页，共42页，编辑于2022年，星期二2.定量分析方法定量方法

26、：定量方法：标准曲线法：标准曲线法：配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强强度度，在在标标准准曲曲线上求出浓度。线上求出浓度。比较法：比较法：在在线线性性范范围围内内，测测定定标标样样和和试试样样的的荧荧光光强强度度，再再进进行行比较。比较。定量依据：定量依据：低浓度时，溶液荧光强度与荧光物质浓度成低浓度时，溶液荧光强度与荧光物质浓度成正比正比 F=KCF=KC第35页，共42页，编辑于2022年，星期二3.3.无机物的荧光分析无机物的荧光分析l无机物能够直接产生荧光并用

27、于测定的很少。无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光可通过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近分析的元素已近7070种。种。l荧光试剂是具有两个或以上与荧光试剂是具有两个或以上与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。的芳香结构。OH NSO3NaN=NOH HOON8-8-羟基喹啉羟基喹啉石榴石榴茜素茜素R R第36页，共42页，编辑于2022年，星期二l

28、无机化合物的分析：无机化合物的分析：l铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法荧光分析法；l氟、硫、铁、银、钴、镍采用氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法荧光熄灭法测定；测定；l铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法催化荧光法测定；测定；l铬、铌、铀、碲采用铬、铌、铀、碲采用低温荧光法低温荧光法测定；测定；l铈、铕、锑、钒、铀采用铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法固体荧光法测定。测定。第37页，共42页，编辑于2022年，星期二4.4.有机物的荧光分析有机物的荧光分析l荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发荧光法在

29、有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。生荧光。名名 称称 结结 构构 式式 应应 用用 9-蒽基重氮甲烷蒽基重氮甲烷 某些羧酸某些羧酸 丹磺酰氯丹磺酰氯 伯胺、仲胺、酚伯胺、仲胺、酚或氨基酸或氨基酸 CH2N2N(CH3)2SO2Cl第38页，共42页，编辑于2022年，星期二锌锌()存在下诺氟沙星与存在下诺氟沙星与牛血清白蛋白的结合作用牛血清白蛋白的结合作用以以ex=280 nm，分别加入，分别加入NFLX和和Zn(II)后，后，BSA的的最最大荧光峰位置不变大荧光峰位置不变，但是，但是荧光强

30、度均降低荧光强度均降低，这说明，这说明NFLX和和BSA以及以及Zn(II)和和BSA之间之间存在相互作用，存在相互作用，发生了能量转移发生了能量转移，可见，可见NFLX和和Zn(II)对对BSA的均有的均有荧光猝灭荧光猝灭作用。作用。第39页，共42页，编辑于2022年，星期二鱼腥草中钛含量分析鱼腥草中钛含量分析钛与苯基荧光酮生成钛与苯基荧光酮生成 络合物及相应空络合物及相应空白的吸收光谱白的吸收光谱钛与钛与苯基荧光酮苯基荧光酮生成橙色生成橙色络合物，络合物，最大吸收波长最大吸收波长为为5 4 0 n m，试剂空试剂空白的最大吸收白的最大吸收 波长为波长为4 6 0 n m，故故选定测量波选定测量波长为长为5 4 0 n m.第40页，共42页，编辑于2022年，星期二鱼腥草中钛含量分析鱼腥草中钛含量分析第41页，共42页，编辑于2022年，星期二谢谢！第42页，共42页，编辑于2022年，星期二