【药学】药物分析_第4章_药物定量分析与分析方法验证.ppt

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1、第四章 药物定量分析与分析方法验证,制作人：王玉华,第一节 定量分析样品的前处理方法,第二节 定量分析方法特点,第三节 药品质量标准分析方法验证,第四节 生物样品分析方法的基本要求（在体内药物分析课程中学习）,基本内容,基本要求,一、熟悉定量分析样品的前处理方法 二、定量分析方法特点 三、掌握定量分析方法验证的内容。,为什么要对定量分析的样品进行前处理？ 满足所选分析方法对试样的要求。,第一节 定量分析样品的前处理方法,1、一般情况下，原料药选择适当的溶剂溶解后，即可以选择相应的分析方法进行分析。 2、制剂，需要进行的前处理主要是要除去制剂敷料以及共存的其他组分；或者使药物溶解出来（如软膏制剂

2、） 3、含金属、含卤素药物的分析时，如果利用金属和卤素的特征进行分析，必须使该元素以无机结合状态存在，需要在测定前进行处理。本章的测定前处理仅涉及此部分内容。,一、 概述（一）含卤素有机药物 系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐 结构特点：CX,（二）含金属有机药物,1、金属原子不与碳原子直接相连，结合弱，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物 。M-O2、金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固。M-C,以上的结合形式，有的结合力弱，不需要有机破坏既可以转化为适合于分析的形式，有的结合力强，需要有机破坏才可以转化为适合于分析的形式。,含金属或卤

3、素的有机药物 定量分析前的处理方法,不经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法,直接测定法;经水解后测定法; 经还原分解后测定法,（一）直接测定法 适用于金属原子不直接与碳原子相连的含金属有机药物或某些CM键结合不牢固的有机金属药物。,1 配位滴定法,本法利用金属离子可与EDTA形成配合物，用EDTA滴定。如明矾（KAl(SO4)212H2O ）含量的测定的含量测定,2 氧化还原滴定法,本法利用不同价态的金属离子的氧化还原性，利用适当的滴定剂测定含量利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量例1 富马酸亚铁的含量测定 溶于热的稀硫酸后释放出亚铁离子，用铈量法测定,富

4、马酸亚铁,富马酸亚铁的含量测定,取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸 15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2 滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于16.99mg 。,例2 葡萄糖酸锑钠的含量测定 在酸性条件下加入碘化钾，用硫代硫酸钠滴定，碘量法测定,Sb5+ + 2KI Sb3+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6,H+,例2 葡萄糖酸锑钠的含量测定,（二）经水解后测定,1、碱水解后测定法 将含卤素有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，加

5、入氢氧化钠溶液加热回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Volhard法）测定。用于含有机卤化物中卤素结合不牢固的药物,三氯叔丁醇的含量测定,CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3,用酸水解后测定法 某些含金属的有机药物，用适当的酸性水溶液溶解并转化为可溶性盐，适合于分析。,例1 硬脂酸镁的测定 ChP（2005）,取本品约0.1g，精密称定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L) 5

6、0ml，煮沸至油滴澄清，继续加热10min，放冷至室温，加甲基橙指示液12滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于2.016mg的MgO。,例2 十一烯酸锌的测定 用适当浓度的盐酸溶解样品，使样品转化为十一烯酸和氯化锌，用EDTA直接滴定锌离子。,1、碱性条件下或酸性条件下还原后测定,（三）经还原分解后测定,本法是将含卤素有机药物在碱性条件下或酸性条件下，加还原剂（如锌粉）加热回流，药物产生还原裂解反应，使有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Fajans法）测定。,本法适用于有机药物分子结构中的碘与苯环或者杂环直接相连，结合较

7、为牢固。可以用此法将有机结合状态的卤素转化为无机状态，适合于分析。,例如 泛影酸的测定,取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9 I 3N2O4。,三、经有机破坏的分析方法,适用于金属原子与碳原子结合牢固的有机金属药物及卤素与碳原子结合牢固的有机卤素药物。,药物分析中常用的有机破坏的方法有： 湿法破坏 干法破坏,HNO3

8、-H2SO4法 H2SO4-硫酸盐法 H2SO4-HClO4法 H2SO4-KMnO4 分解剂 和 氧化剂 破坏共价键,(一)湿法破坏,应用实例：凯氏定氮法 用于蛋白质、氨基酸、含有氨基的药物、含有酰胺结构的药物的含量测定常量法和半微量法,1、消化： 药物置凯氏烧瓶中，加入硫酸、硫酸钾，有时还可以加入合适的催化剂如硫酸铜，加热，是药物中的有机结构氧化分解为二氧化碳和水，有机结合的氮转化为无机氨，并与过量的硫酸结合为硫酸铵或硫酸氢铵。,操作过程：,本法是往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。,采用了湿法破坏中的硫酸-硫酸盐法：,2、测

9、定法,将消化后的溶液转入C瓶中，加入过量的40%氢氧化钠溶液，前面连接水蒸气装置，后边连接冷凝管，接受瓶中加入硼酸，接受液用标准酸溶液进行酸碱中和滴定。计算含量。,凯氏定氮蒸馏装置,扑米酮的含量测定： 含有两个N原子,1、高温炽灼法 将药物高温灰化，无机物转化为无机元素或无机盐的形式，可供分析。,(二)干法破坏,适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏,注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在以下（2）一定要灰化完全,2、 氧瓶燃烧法,（1）原理,将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物

10、质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析,本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析,（ 2） 仪器与材料,仪器装置 燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,称样用材料及称样 A. 固体样品 无灰滤纸 B. 液体样品 纸袋,吸收液,A. 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态,氧气,B. 吸收液的选择 85页,氟 水 氯 NaOH溶液溴

11、H2O2-NaOH NaOH-硫酸肼饱和溶液碘 NaOH硫酸肼饱和溶液硫 NaOH或H2O2 硒 硝酸溶液,（3）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备 用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min。,样品的准备 取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,样品的燃烧 点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,根

12、据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,（4）注意事项,ChP（2005）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析,正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。,例 碘苯酯的含量测定,原理 碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。,此时，碘全部以碘酸盐的形式存在。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，淀粉为

13、指示液，滴定到蓝色消失即为终点 。 求 滴定度? 并写出含量计算的公式？,第二节 定量分析方法的 特点,容量分析法光谱法色谱法,一、容量分析法（一）容量分析法的特点 容量分析法是将已知浓度的滴定液由滴定管滴加到待测药物的溶液中，直到所加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止，然后根据滴定液的浓度和消耗的体积，就可以计算出被测药物的含量。,通常用于测定高含量和中含量组分，即被测组分的 含量在1以上。 容量分析法比较准确，一般相对误差可达0.2以下。 简便、快速、准确,滴定度（T）的概念 2. 滴定度的计算,（二）容量分析法的计算问题,3. 百分含量的计算 （1）直接滴定法 含量% = V F T

14、/W 100% F = 实际标定的浓度/理论规定的浓度 （2）间接滴定法,Sb5+ + 2KI Sb3+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6,H+,生成物滴定法例如 葡萄糖酸锑钠的含量测定,H+,剩余滴定法含量% = （ TVF )加入 (TVF)剩余 /W100% 两个溶液的滴定度相同这种情况下常需要做空白试验进行校正：含量% = （V 空白 V 剩余) T F /W100%,例如：司可巴比妥钠的含量测定 间接碘量法 做空白试验 90页,求滴定度？ 写出含量计算式？,二、光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法（200nm760nm) 灵敏度高，可达

15、10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特点 准确度高，SRD（%）为2% 5% 仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用 范围广。 2. 朗伯-比耳定律（LambertBeer定律 ）： A = ECL,A = E CL E：吸收系数 C:浓度（g/100ml） L:液层厚度要求供试品溶液的A应在0.3 0.7,3、应 用 情 况,定性鉴别：,max或E Amax /Amin 与标准品溶液的吸收光谱比较, 纯度检查：在某波长，药物无吸收，而,在某波长，药物无吸收，而所含杂质有吸收，可检查某杂质的限度。,如：肾上腺素中肾上腺铜的检查,肾上腺素 2mg/mL 的0.05mol/L HCl液,310

16、nm处测得的A0.05,肾上腺铜的E=435 ,求其限量,对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=CxD/W100 % 常用方法 吸收系数法： 标准曲线法：如比色法 计算分光光度法：数学分离法, 含量测定,（二）荧光分析法,1、原理：物质在受到激发光（ex）照射后产生了较长波长的荧光（em） 当激发光强度、波长或所用溶剂温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系。,灵敏度高，可达10-10g/ml 10-12g/ml ； 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比 及 自熄灭作用 ；用基准物溶液校正仪器 灵 敏度，防止样品液荧 光衰减； 灵敏2、特点

17、度 高，但干扰因素多。 制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和 选 择性。用样品量少，操作简单， 方法快速，应用范围较广。,3、含量测定 常用的方法对照品比较法: Cx = (Rx-Rxb)/(Rs-Rsb) Cs Ch.P收载地高辛片、利血平片、 洋地黄毒苷片。,4、应 用, 鉴别：ex和em 荧光激发光谱, 发射光谱, 含量测定：,a.标准曲线法,b.比例法（对照法）,按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC,三、色谱分析法,方法分类,（一）HPLC法,色谱柱的理论板数： n=5.54(tR/Wh/2)2 2、 系统性试验 分离度： R

18、 = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 拖尾因子： T = W0.05h/2d1 应在0.9 1.05 重复性： 连续进样5次，RSD不大于2.0%,1、一般要求：色谱柱、流动相,重复性 取各品种项下的对照溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测定值的相对标准差应2.0%,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3. 测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法,应用示例： RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法 如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法,常用反相 HPLC 色谱法,流动相：水、甲醇-水、乙腈-水固定相：十八烷基硅

19、烷键合硅胶 （ODS或C8）,4、应用 定性： 根据tR 含量测定：a、内标法 b、外标法,杂质检查,1. 峰面积归一化法 2. 不加校正因子的主成分自身对照法 （高低浓度对照法） 3. 加校正因子的内标法 4. 外标法：测定杂质的浓度,（二）GC法,1、一般要求（ChP 2005）载气：N2色谱柱：填充柱 毛细管柱进样口温度：高于柱温30-50进样量：不大于数微升检测器：常用氢焰离子化检测器（FID）检测温度一般高于柱温,不得低于100,以免水气凝结,常用250-350.,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 2. 测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 标准溶液加

20、入法： 供试品两等份，其中一份 加入对照品一定量，测定得两张图谱。 Ax加/Ax=（Cx+Cx）/Cx 在相同背景下测定，误差小,3、系统适用性试验（ChP 2005）,色谱柱的理论板数（n）, 分离度（R）, 拖尾因子,重复性 取各品种项下的对照溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测定值的相对标准差应2.0%,4、应用 定性：根据tR,含量测定：a内标法 b外标法 c标准溶液加入法,杂质检查,1. 峰面积归一化法 2.内标法加校正因子测定法 3. 外标法：测定杂质的浓度 4. 标准溶液加入法: 是对外标法的改进 加入杂质的 对照品溶液,第三节 药品分析方法的验证,一、目的,通过验证去证

21、明所建立的分析方法是可信的，能够真实地反映药品内在的质量。,二、用途,（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。,（二）药物原分析方法进行修订或变更时，分析方法需经验证。,三、需验证的分析项目,1. 鉴别试验；2. 杂质定量或限度检查；3. 原料或制剂中有效成分含量测定；4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等） 的测定；5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量 等的测试方法。,验证内容有：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围、耐用性，共八项内容。,四、验证内容,一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示 测定回收率R（rec

22、overy）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。,1、 原料药 用对照品做回收率 2、 制剂 要考察辅料对回收率的影响如何考虑辅料（背景）的影响？,回收试验 空白（敷料组成）+已知量A的对照品，测定，测定值的均值为 M,模拟了被测定物的环境，从而真实反映测定方法的准确程度,3、如果被测定物的背景是不能够模拟的，该如何考虑背景的影响？ 前提：具有已知含量的供试品 比如中药的有效成分的测定？,加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品，测定值为M,回收率% = （测定平均值 空白值）/加入量100%,含量测定方法的回收率测定总结：,原料药：用对照品进行测定,制剂

23、：采用在空白辅料中加入对照品的方法。如不能得到制剂的全部组分，即空白辅料，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，前提是制剂中被测定物的含量是已知的。加样回收试验,中药分析的准确度用加样回收试验衡量。,二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果 之间的接近程度。 （一）精密度表示方法 相对标准差(relative standard deviation, RSD)也称变异系数 (coefficient of variation, CV) RSD=标准偏差/平均值100%=SD/X 100%,1、 重复性 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。在规定的范围内，至

24、少用9次测定结果评价，即制备三个不同浓度样品各测三次的结果进行评价。,2. 中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。在实验地点没有变化的情况下考察随机变动因素的影响，如不同日期、不同分析人员、不同设备。 只是地点没有变化。,3. 重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。所有的因素都发生了变化。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。,三、专属性 是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等) 存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。 鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。,四、检测限（limit of detection, LO

25、D) 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。 （一）常用的方法 1. 目视法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。See图4-5 2.仪器分析方法 GC和HPLC法：进样已知低浓度的样品 LOD = S/N = 2或3 see图4-6 此时的溶液浓度即为LOD,五、定量限（limit of quantitation, LOQ) 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 一般以S/N=10 时的溶液浓度进行实验，确定具有一定准确度和精密度的最低量。,六、线性 是指在设定的范围内，测定结果（响应值）与试样中被测物浓度呈正比关系的程度。 UV法

26、：首先制备一个标准系列，浓度点n =5; A = 0.3.0.7。以C对A建立回归方程 ：C = aA + b ;r 0.9999。 HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n =5 7; 以C对A建立回归方程：C = aA + b ; r 0.9999。 数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。,七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性的测量浓度 的区间。,原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%- 120%。 制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%- 130%。 溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20%。,八、耐用性 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承

27、受程度。典型的变动因素有：样品提取次数、提取时间等。 HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱的牌子，柱温，流速等。 GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检 测器温度等。,九、分析方法效能指标的具体应用： 1、 非定量分析：如鉴别试验和杂质的限量检查时，只要求做专属性、耐用性，检测限 2、定量分析：除了检测限和定量限不要求外，其余六项指标均要求做。 3、微量定量分析：除检测限视情况而定外，其余七项指标均要求做。,十、各种含量测定方法对效能指标的要求 1. 容量分析法：用原料药精制品(含量99.5)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2；进行回收率试验。回

28、收率一般在99.7-100.3之间。,2. UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1。制剂的测定，回收率一般应在98-102之间。,线性：吸光度A一般在0.2-0.7，浓度点n5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.999(n5)，方程的截距应近于零。,3. HPLC法： 要求 RSD2，回收率 98-102之间。 线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为5-7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。,专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除,生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内（或日内）精密度及批间（或日间）精密度。,批内精密度：是同一次测定的精密度。所得RSD应争取达到5以内，但不能超10。,批间精密度：是不同次测定的精密度。所得RSD应控制在15以内。,附录药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则规定一般RSD应小于15%，在LOQ附近RSD应小于20%。,