生物工业菌种与种子的扩大培养.ppt

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1、生物工业菌种与种子的扩大培养现在学习的是第1页，共96页本章内容本章内容 一、工业生产常用的微生物及要求一、工业生产常用的微生物及要求 二、工业微生物菌种的选育与改良二、工业微生物菌种的选育与改良 三、工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏三、工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏四、种子的扩大培养四、种子的扩大培养 http:/现在学习的是第2页，共96页第一节第一节 工业生产常用微生物及要求工业生产常用微生物及要求 一、一、工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物工业上用的微生物主要有六类：工业上用的微生物主要有六类：1 1细菌（细菌（bacteriabacteria）例：枯草芽孢杆菌、乳杆菌例：枯草

2、芽孢杆菌、乳杆菌 2 2酵母菌（酵母菌（yeastyeast）例：啤酒酵母例：啤酒酵母 3 3霉菌（霉菌（mouldmould）例：曲霉、青霉例：曲霉、青霉 http:/现在学习的是第3页，共96页http:/第一节第一节 工业生产常用微生物及要求工业生产常用微生物及要求 一、一、工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物工业上用的微生物主要有六类：工业上用的微生物主要有六类：4 4放线菌（放线菌（actinomyeetesactinomyeetes）主要是生产各种抗生素。例：链霉菌生产链霉素；小单主要是生产各种抗生素。例：链霉菌生产链霉素；小单孢菌生产庆大霉素。孢菌生产庆大霉素。5 5担子菌（

3、担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）也就是菇类。例：灵芝、香菇也就是菇类。例：灵芝、香菇 6 6藻类（藻类（algaalga）一类自养性生物。例：螺旋藻、蓝绿藻一类自养性生物。例：螺旋藻、蓝绿藻 现在学习的是第4页，共96页第一节第一节 工业生产常用微生物及要求工业生产常用微生物及要求 二、微生物工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求 具备四个条件：具备四个条件：1.1.原料廉价、生长迅速、目的产物产量高；原料廉价、生长迅速、目的产物产量高；2.2.易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；3.3.抗杂菌和噬菌体的能力

4、强；抗杂菌和噬菌体的能力强；4.4.菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不生产任何有害菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不生产任何有害的生物活性物质和毒素，保证生产安全。的生物活性物质和毒素，保证生产安全。http:/现在学习的是第5页，共96页第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良 微生物筛选微生物筛选基因突变（菌种选育）基因突变（菌种选育）基因重组（菌种改良）基因重组（菌种改良）基因直接进化基因直接进化自然选育自然选育（非定向筛选）（非定向筛选）诱变育种诱变育种杂交杂交原生质体融合原生质体融合DNADNA重组重组（半定向筛选）（半定向筛选）点突变点突变易错易错PC

5、RPCR同序法同序法DNA shuffling DNA shuffling(体外同源重组体外同源重组)（定向筛选）（定向筛选）现在学习的是第6页，共96页http:/第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 1.1.定义定义(1)(1)自然选育自然选育n在生产过程中，不经过人工诱变处理，而根据菌种的在生产过程中，不经过人工诱变处理，而根据菌种的自发突变进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或者自自发突变进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或者自然分离。然分离。n用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变，从而用各种物理、化学的因素人工

6、诱发基因突变，从而进行的筛选，称为诱变育种。进行的筛选，称为诱变育种。(2)(2)诱变育种诱变育种现在学习的是第7页，共96页第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 2.2.两者间的区别两者间的区别(1)(1)选育过程选育过程n自然选育：被动选择，不对菌体做任何人工处理自然选育：被动选择，不对菌体做任何人工处理n诱变育种：主动选择，对菌体施加人工影响诱变育种：主动选择，对菌体施加人工影响 (2)(2)选育效果选育效果n要达到相同的水平，诱变育种所需要的时间要比自要达到相同的水平，诱变育种所需要的时间要比自然选育的时间短

7、很多；然选育的时间短很多；n对选育工艺而言，一般先对菌群做自然选育；然后再做诱对选育工艺而言，一般先对菌群做自然选育；然后再做诱变育种，使其生产性能进一步提高。变育种，使其生产性能进一步提高。现在学习的是第8页，共96页一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 3.3.自然选育自然选育自然选育又可以分为两种情况：自然选育又可以分为两种情况：n从自然界中分离获得菌株从自然界中分离获得菌株n从自发突变体中获得菌株从自发突变体中获得菌株（重点）（重点）http:/第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良现在学习的是第9页，共96页一、工业微生物菌种的选育一、工业微生

8、物菌种的选育 从自然界中分离获得菌株从自然界中分离获得菌株 一般过程：一般过程：土样（水样）的采集土样（水样）的采集 预处理预处理 增殖培养增殖培养 纯种分离纯种分离 产品的鉴定及筛选产品的鉴定及筛选 复筛复筛较优菌株较优菌株1-31-3株株生产性能测试生产性能测试初步工艺初步工艺条件摸索条件摸索保藏、进一步做生产试验或作为育种的出发菌株保藏、进一步做生产试验或作为育种的出发菌株 某些必要试验和毒性试验等某些必要试验和毒性试验等第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良现在学习的是第10页，共96页土样（水样）的采集土样（水样）的采集地点的确定要根据筛选的目的、微生物的

9、分布情况以及菌地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布情况以及菌种的主要特征与外界环境关系等进行综合、具体的分析来种的主要特征与外界环境关系等进行综合、具体的分析来决定。决定。I.I.地点的确定地点的确定一般的话，可以从土壤中采样，种类是最多的。一般的话，可以从土壤中采样，种类是最多的。II.II.采样的操作方法采样的操作方法 用小铲除去表层土壤，取离地面用小铲除去表层土壤，取离地面5-15cm5-15cm处的土样，放入预先处的土样，放入预先消毒好的塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况消毒好的塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备日后考查。等，以备日后考查。现在学习的是第

10、11页，共96页预处理预处理处理土样，为即将进行的培养做准备。处理土样，为即将进行的培养做准备。I.I.目的目的 II.II.操作方法操作方法 如果是水样，则不需要再制备悬液；如果是土样，则将采集如果是水样，则不需要再制备悬液；如果是土样，则将采集的土样按一定的比例溶解在去离子水中，振荡搅匀，制成样的土样按一定的比例溶解在去离子水中，振荡搅匀，制成样品悬液。等待划线。品悬液。等待划线。一般制成一般制成1010-2-2菌悬液，也就是菌悬液，也就是1g1g土样放入土样放入99ml99ml去离子去离子水中。水中。现在学习的是第12页，共96页http:/增殖培养增殖培养针对目标菌株可能较少、杂菌较多

11、而进行。操作目的是为针对目标菌株可能较少、杂菌较多而进行。操作目的是为了增加目标菌株的数量；如果目标菌株较多，则没有必要，了增加目标菌株的数量；如果目标菌株较多，则没有必要，直接分离即可。直接分离即可。I.I.目的目的 II.II.定义定义 给混合菌种提供一些有利于所需菌株生长或不利于其给混合菌种提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，有利他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，有利于分离，也叫富集培养。于分离，也叫富集培养。现在学习的是第13页，共96页增殖培养增殖培养(i)(i)定向培养定向培养 III.III.富集培养的方案富集培养的方案采用特定的

12、有利于目的微生物富集的条件进行培养。采用特定的有利于目的微生物富集的条件进行培养。使用专一性底物、使用专一性底物、pHpH条件、培养时间以及培养温条件、培养时间以及培养温度都是定向培养的方法。度都是定向培养的方法。http:/现在学习的是第14页，共96页增殖培养增殖培养III.III.富集培养的方案富集培养的方案(ii)(ii)从菌种的分类学角度考虑从菌种的分类学角度考虑 目标菌种目标菌种分离方法分离方法细菌细菌霉菌霉菌放线菌放线菌培养基中添加浓度一般为培养基中添加浓度一般为50 g/ml 50 g/ml 的抗真菌剂的抗真菌剂(如放线如放线菌酮和制霉素菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长，可以

13、抑制真菌的生长分离培养基中加入一定的抗生素，如青霉素和链霉素，分离培养基中加入一定的抗生素，如青霉素和链霉素，抑制细菌生长抑制细菌生长悬液中加入悬液中加入10%10%的酚数滴，就可以抑制霉菌和细菌的酚数滴，就可以抑制霉菌和细菌的生长的生长现在学习的是第15页，共96页III.III.富集培养的方案富集培养的方案(iii)(iii)随机分离随机分离n从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。菌。n技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选技术关键

14、：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。方法的确定。增殖培养增殖培养现在学习的是第16页，共96页纯种分离纯种分离单菌落分离法单菌落分离法 分离方法：分离方法：具体的操作主要有具体的操作主要有稀释分离法稀释分离法和和划线分离法划线分离法两种。两种。I.I.稀释分离法稀释分离法 操作步骤：操作步骤：将样品不断的稀释，使其分散到最低限度将样品不断的稀释，使其分散到最低限度然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。优势：优势：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的概率大。在培养基上分离

15、的菌落单一均匀，获得纯种的概率大。现在学习的是第17页，共96页I.I.稀释分离法稀释分离法单菌落单菌落 现在学习的是第18页，共96页单菌落分离法单菌落分离法 分离方法：分离方法：II.II.划线分离法划线分离法 操作步骤：操作步骤：首先倒培养基平板首先倒培养基平板然后用接种针（接种环）挑取样品，在然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上有规则的划线。平板上有规则的划线。优势：优势：简单、快捷简单、快捷注意点：注意点：采用单菌落分离法要注意菌体的分散度。有不采用单菌落分离法要注意菌体的分散度。有不同的菌体长在一起的话，有时会发生吻合现象，同的菌体长在一起的话，有时会发生吻合现象，形成异核菌落

16、。形成异核菌落。纯种分离纯种分离现在学习的是第19页，共96页II.II.划线分离法划线分离法斜线法斜线法曲线法曲线法方格法方格法放射法放射法四格法四格法 现在学习的是第20页，共96页产品鉴定及筛选产品鉴定及筛选从两个角度出发：从两个角度出发：产物角度、形态角度产物角度、形态角度I.I.从产物角度出发从产物角度出发也就是在培养时以产物的形成来有目的的设计培养也就是在培养时以产物的形成来有目的的设计培养基。基。例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 在培养基中加入在培养基中加入0.05%0.05%的的Z-PAOxZ-PAOx，每隔，每隔2-32-3天移去一半天移去一半培养物，补充新鲜培养基，

17、不断分析样品。培养物，补充新鲜培养基，不断分析样品。现在学习的是第21页，共96页II.II.从形态角度出发从形态角度出发也就是观察菌落的外观形态，它是微生物的一个也就是观察菌落的外观形态，它是微生物的一个重要表征。重要表征。例：多糖产生菌在适当的培养基上生长时，产生粘液例：多糖产生菌在适当的培养基上生长时，产生粘液性的菌落性的菌落 产品鉴定及筛选产品鉴定及筛选从两个角度出发：从两个角度出发：产物角度、形态角度产物角度、形态角度现在学习的是第22页，共96页第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 实例：碱性纤维素酶产生

18、菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 产生菌：产生菌：嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌 自然选育过程：自然选育过程：(a)(a)采样：采样：造纸厂土样造纸厂土样(b)(b)预处理：预处理：1g1g土样溶于土样溶于99ml99ml去离子水中，振荡均匀，去离子水中，振荡均匀，过滤，得菌悬液过滤，得菌悬液(c)(c)增殖培养：增殖培养：经经8080，3030分钟预处理分钟预处理 现在学习的是第23页，共96页自然选育过程：自然选育过程：(e)(e)鉴定筛选：鉴定筛选：选择有凹陷圈的菌落，而且越大越好，选择有凹陷圈的菌落，而且越大越好，得到初筛菌种。得到初筛菌种。(f)(f)复筛：复筛：通过生产性能测试，摸

19、索条件，分析产通过生产性能测试，摸索条件，分析产酶率，得到酶率，得到1-31-3株较好菌株株较好菌株(g)(g)保藏及进一步育种保藏及进一步育种第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 (d)(d)分离纯化：分离纯化：固体分离培养基采用固体分离培养基采用CMCCMC为唯一碳源，为唯一碳源，pH pH 10.510.5条件下涂布培养条件下涂布培养3-43-4天天 现在学习的是第24页，共96页4.4.诱变育种诱变育种 定义：定义：通过诱变剂处理菌种，大大提高菌种

20、的突变频率，通过诱变剂处理菌种，大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，称为诱变育种。称为诱变育种。原理：原理：采用物理、化学等诱变因素使微生物采用物理、化学等诱变因素使微生物DNADNA碱基对排列碱基对排列发生变化，造成突变，从而使细胞功能发生改变。发生变化，造成突变，从而使细胞功能发生改变。第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 现在学习的是第25页，共96页突变方向突变方向 正突变正突变 负突变负突变 对生产有利的突变称为正突变。对生产有

21、利的突变称为正突变。造成菌株衰退及生产质量下降的突造成菌株衰退及生产质量下降的突变称为负突变。变称为负突变。菌株发生正突变的概率低。菌株发生正突变的概率低。诱变育种的关键：诱变育种的关键：以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液，使个别存活的个体中悬浮液，使个别存活的个体中DNADNA碱基变异频率大碱基变异频率大幅提高；幅提高；4.4.诱变育种诱变育种 第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 现在学习的是第26页，共96页优势：优势：方法简便、工作速度快、效果显著。

22、方法简便、工作速度快、效果显著。用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，培育优良高产菌株。优良的正变异株，培育优良高产菌株。意义：意义：诱变育种不仅能提高菌种的生产性能，而且能改进产品的诱变育种不仅能提高菌种的生产性能，而且能改进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。质量、扩大品种和简化生产工艺等。4.4.诱变育种诱变育种 第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 现在学习的是第27页，共96页诱变育种的一般程序诱变育种的一般程序 ：出发菌株的选择出发菌株的

23、选择 菌悬液制备菌悬液制备 前培养前培养 诱变诱变 中间培养中间培养变异菌株分离筛选变异菌株分离筛选 4.4.诱变育种诱变育种 第二节第二节 工业微生物菌种的选育与改良工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育一、工业微生物菌种的选育 现在学习的是第28页，共96页出发菌株的选择出发菌株的选择1 1、定义、定义 工业上用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌工业上用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株株称为出发菌株(parent strain)(parent strain)。2.2.满足要求满足要求 对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高

24、现在学习的是第29页，共96页出发菌株的选择出发菌株的选择3.3.出发菌株种类出发菌株种类 出发菌株出发菌株特点特点从自然界中分离得到的野从自然界中分离得到的野生型菌株生型菌株自发突变经筛选得到的高自发突变经筛选得到的高产菌株产菌株（）已诱变过的菌株已诱变过的菌株对诱变因素敏感，容易发生变异对诱变因素敏感，容易发生变异与野生型菌株较相象，容易达到较好的与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果诱变效果多次诱变可能效果迭加，积累更多多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高，但难度大的提高，但难度大现在学习的是第30页，共96页菌悬液的制备菌悬液的制备方法：方法：同步培养法同步培养法 在诱变育种中，处

25、理材料一般采用生理状态一致的单倍在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，称为同步培养。状态，称为同步培养。现在学习的是第31页，共96页菌悬液的制备菌悬液的制备同步化方法：同步化方法：菌种菌种培养方法培养方法细菌细菌霉菌霉菌放线菌放线菌一般要求培养至生长旺盛的对数期，变异率较高，一般要求培养至生长旺盛的对数期，变异率较高，重复性好重复性好使用刚刚成熟的分生孢子（将其放在液体培养使用刚刚成熟的分生孢子（将其放在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，基中短时间培养，使孢子孵化，

26、处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。）并恰好未形成菌丝体，易于诱变。）现在学习的是第32页，共96页菌悬液的制备菌悬液的制备具体操作：具体操作：关键是制备一定浓度的关键是制备一定浓度的分散均匀分散均匀的单细胞或单孢子悬的单细胞或单孢子悬液。液。(1)(1)细胞的同步培养；细胞的同步培养；(2)(2)过滤或离心、洗涤，并收集菌体；过滤或离心、洗涤，并收集菌体；(3)(3)配制菌悬液配制菌悬液 现在学习的是第33页，共96页菌悬液的制备菌悬液的制备具体操作：具体操作：(i)(i)用生理盐水或缓冲溶液配制；用生理盐水或缓冲溶液配制；注意点：注意点：(ii)(ii)应注意分散度应注意分散度 ；

27、(iii)(iii)最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为胞的浓度大约为10106 610107 7个个/ml/ml，放线菌和细菌的，放线菌和细菌的浓度大约为浓度大约为10108 8个个/ml/ml。现在学习的是第34页，共96页前培养前培养诱变处理前，可以在加入嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培诱变处理前，可以在加入嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养养基中培养20-30min20-30min。前培养可以使变异率大幅提高。前培养可以使变异率大幅提高。现在学习的是第35页，共96页诱变诱变定义：定义：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。能够提高生

28、物体突变频率的物质称为诱变剂。诱变剂种类诱变剂种类 1.1.诱变剂诱变剂 物理诱变剂物理诱变剂 化学诱变剂化学诱变剂 紫外、紫外、X X射线、射线、射线、射线、射射线、线、射线、等离子、快中射线、等离子、快中子、超声波等子、超声波等 甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯(EMS)(EMS)、硫酸、硫酸二乙酯二乙酯(DES)(DES)、亚硝基胍、亚硝基胍(NTG)(NTG)现在学习的是第36页，共96页诱变诱变2.2.诱变机理诱变机理核酸物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提核酸物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变。因升到较高的能量水平，从而引

29、起分子激发而造成突变。因此，紫外线的诱变作用是由于它引起此，紫外线的诱变作用是由于它引起DNADNA分子结构变化而分子结构变化而造成的。造成的。现在学习的是第37页，共96页诱变诱变2.2.诱变机理诱变机理这种变化包括：这种变化包括：DNADNA链的断裂，链的断裂，DNADNA分子内和分子间分子内和分子间的交联形成嘧啶二聚体。的交联形成嘧啶二聚体。现在学习的是第38页，共96页诱变诱变3.3.诱变仪器诱变仪器 265nm265nm的紫外光，对应于功率为的紫外光，对应于功率为15W15W的紫外灯的紫外灯 4.4.诱变操作诱变操作(1)(1)将将10ml10ml菌悬液放在直径为菌悬液放在直径为9c

30、m9cm的培养皿中，液层厚的培养皿中，液层厚度约为度约为2mm2mm，启动磁力搅拌器；，启动磁力搅拌器；(2)(2)使用使用15W15W的紫外灯管，照射距离为的紫外灯管，照射距离为30cm30cm左右，照射时左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10min10min左左右。右。现在学习的是第39页，共96页诱变诱变5.5.注意点注意点 (1)(1)为准确起见，照射前紫外灯应先预热为准确起见，照射前紫外灯应先预热2030min2030min，然后再进行处理；然后再进行处理；(2)(2)不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，诱变剂不同的微

31、生物对于紫外线的敏感程度不一样，诱变剂量也不同。目前趋向采用低剂量、长时间处理；量也不同。目前趋向采用低剂量、长时间处理；(3)(3)为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。起来培养，然后再进行分离筛选。现在学习的是第40页，共96页中间培养中间培养1.1.目的目的 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程（生理延迟），需程（生理延迟），需3 3代以上的繁殖才能将突变性状表代以上的

32、繁殖才能将突变性状表现出来。现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现不同变异菌体同时存在于一个菌落内的可能，会出现不同变异菌体同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。菌株退化。2.2.后果后果 现在学习的是第41页，共96页中间培养中间培养3.3.操作操作 诱变处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的诱变处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细

33、胞。这样，稳定的变异就会显现出来。一般也就是过夜。稳定的变异就会显现出来。一般也就是过夜。现在学习的是第42页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选1.1.目的目的 从诱变后的突变菌体中将少数发生正突变的菌体挑出从诱变后的突变菌体中将少数发生正突变的菌体挑出来。来。2.2.分离筛选过程（以营养缺陷型突变体的筛选为例分离筛选过程（以营养缺陷型突变体的筛选为例 ）(1)(1)淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株 (富集培养富集培养)几个定义几个定义 营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株 通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质的能力，必通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质的能力，必须在其基本培养基中加入相

34、应缺陷的营养物质才能正须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。常生长繁殖的变异菌株。现在学习的是第43页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(1)(1)淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株 (富集培养富集培养)基本培养基基本培养基(MM)(MM)凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基。基。完全培养基完全培养基(CM)(CM)在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白胨、酵母膏等，氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白胨、酵母膏等，能满

35、足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基；能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基；现在学习的是第44页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选补充培养基补充培养基(SM)(SM)在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基。菌株生长的培养基。(1)(1)淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株 (富集培养富集培养)现在学习的是第45页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选分离方法：分离方法：采用抗菌素法或菌丝过滤法采用抗菌素

36、法或菌丝过滤法 菌种菌种采用方法采用方法原理原理细菌细菌酵母酵母丝状丝状真菌、霉真菌、霉菌、放线菌、放线菌菌抗生素抗生素法法菌丝过滤法菌丝过滤法青霉素青霉素制霉制霉菌素菌素野生型菌株能在野生型菌株能在MMMM中生长，而缺陷型中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在不能生长，于是将诱变处理液在MMMM中中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。陷型。在基本培

37、养基中，野生型的孢子能发在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此将诱变处理后的孢子在基本培养基此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。中培养一段时间后，再进行过滤。现在学习的是第46页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(2)(2)检出缺陷型检出缺陷型 (分离纯化分离纯化)目的：目的：从淘汰野生型之后的混合菌株中筛选出纯的缺陷从淘汰野生型之后的混合菌株中筛选出纯的缺陷型菌株。型菌株。方法：方法：影印法、夹层法、逐个检出法、限量补充培影印法、夹层法、逐个检出法、限量补充培养法养法 现在学习的是第47页，

38、共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(2)(2)检出缺陷型检出缺陷型 (分离纯化分离纯化)影印法检出缺陷型的操作影印法检出缺陷型的操作将诱变处理后的细胞涂布在将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基（完全培养基（CMCM）表表面上，经培养后长出菌落；面上，经培养后长出菌落；然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块覆盖于灭过然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块覆盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的平皿倒转过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一基本培养基基本培养基（MMMM）平板上；平板上；现在学习的是

39、第48页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(2)(2)检出缺陷型检出缺陷型 (分离纯化分离纯化)影印法检出缺陷型的操作影印法检出缺陷型的操作经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发现前一平板上某一部位长有菌落，而在后一培养现前一平板上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。陷型菌落。现在学习的是第49页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选影印法图例影印法图例(2)(2)检出缺陷型检出缺陷型 (分离纯化分离纯化)现在学习的是第50页，共96

40、页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)方法：方法：随机筛选、形态筛选以及理性化筛选随机筛选、形态筛选以及理性化筛选 随机筛选：随机筛选：菌种经过诱变处理后，进行平板分离，菌种经过诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。形态筛选：形态筛选：一种半理性化的筛选方式。利用形态突一种半理性化的筛选方式。利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。反应直接挑取高产变异菌株。现在学习的是第51页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分

41、离和筛选形态筛选方法形态筛选方法形态突变形态突变某些菌株的形态和生产性能直接相关，可以采用此种某些菌株的形态和生产性能直接相关，可以采用此种方法。如灰黄霉素产生菌。方法。如灰黄霉素产生菌。(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)现在学习的是第52页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选 理性化筛选理性化筛选分为两种情况：分为两种情况：初级代谢产物高产菌株的筛选、次级初级代谢产物高产菌株的筛选、次级代谢产物高产菌株的筛选。代谢产物高产菌株的筛选。平皿反应平皿反应平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平

42、板上作用后表现出一定的基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。此作为筛选的标志。(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)形态筛选方法形态筛选方法现在学习的是第53页，共96页联系联系区别区别初级初级代谢代谢次级次级代谢代谢初级代谢是次级代初级代谢是次级代谢的基础，它可以为谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提次级代谢产物合成提供前体物和所需要的供前体物和所需要的能量；能量；次级代谢途

43、径并次级代谢途径并不是独立的，与初不是独立的，与初级代谢途径有密切级代谢途径有密切关系，是它的延伸关系，是它的延伸或支路。或支路。定义定义产物产物合成期合成期能使营养物质转换能使营养物质转换成细胞结构物质、成细胞结构物质、维持微生物正常生维持微生物正常生命活动的生理活性命活动的生理活性物质或能量的代谢。物质或能量的代谢。为了避免在初级代为了避免在初级代谢过程中某些中间谢过程中某些中间产物积累所造成的产物积累所造成的不利作用而产生的不利作用而产生的一类有利于生存的一类有利于生存的代谢类型。代谢类型。生长繁殖所生长繁殖所必需，如氨必需，如氨基酸、核苷基酸、核苷酸、维生素，酸、维生素，酶、辅酶酶、辅

44、酶非生长繁殖非生长繁殖必需，如抗必需，如抗生素、毒素、生素、毒素、甾体化合物甾体化合物等等随菌体生长随菌体生长不断的合成不断的合成通常在细通常在细胞生长后胞生长后期形成期形成现在学习的是第54页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选例：如何从缺陷型菌种中筛选能够积累例：如何从缺陷型菌种中筛选能够积累C C的高产菌株？的高产菌株？思路：思路：了解涉及了解涉及C C这种物质在菌体中的代谢途径这种物质在菌体中的代谢途径 A AB BC CD DE E(i)C(i)C为中间产物，正常途

45、径不可能积累；为中间产物，正常途径不可能积累；两个结论：两个结论：(ii)E(ii)E为终产物，生长必需；为终产物，生长必需；现在学习的是第55页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选思路：思路：分析积累分析积累C C在代谢途径中的可能性在代谢途径中的可能性 (ii)(ii)切断切断CDCD，代谢终止，终产物，代谢终止，终产物E E不能继续合成；不能继续合成；(i)(i)若要积累若要积累C C，必须切断，必须切断CDCD的代谢；的代谢；(iii)E(iii)E生长必需，若不能合成，菌体无法生存；生长必需，若不能合成，菌体无法生存；A AB BC CD DE E小结：若想达到既能累积

46、小结：若想达到既能累积C C，又能保持菌体不断生长的，又能保持菌体不断生长的目的，目的，可在切断可在切断CDCD之后，人工添加之后，人工添加E E。(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)现在学习的是第56页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)思路：思路：分析积累分析积累C C在代谢途径中的可能性在代谢途径中的可能性 生物反应具有一个特点：生物反应具有一个特点：A AB BC CD DE E反馈抑制现象反馈抑制现象也就是说，即使也就是说，即使C CD D切断后，切断后，C C的积累量也不可能的积累量也不可能很多；

47、而很多；而E E的添加量也不能很大的添加量也不能很大 解决方案解决方案 总的原则：绕过反馈抑制总的原则：绕过反馈抑制现在学习的是第57页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)解决方案解决方案 筛选筛选类型类型思路思路方法方法原理原理初级初级代谢代谢产物产物高产高产菌株菌株的筛的筛选选需要绕需要绕过反馈过反馈调节调节a.a.降低终产降低终产物浓度物浓度b.b.筛选抗筛选抗反馈突变反馈突变菌株菌株c.c.控制细胞控制细胞膜渗透性膜渗透性利用营养缺陷型积累中间代谢物，采用低利用营养缺陷型积累中间代谢物，采用低浓度终产物供给浓度终产物供

48、给在含有抗代谢物在含有抗代谢物（结构类似物结构类似物）的培养基的培养基中培养，筛选抗性突变株，其中一些可分泌中培养，筛选抗性突变株，其中一些可分泌大量末端产物大量末端产物通过生理学或遗传学方法，改变膜透通过生理学或遗传学方法，改变膜透性，使胞内代谢物迅速渗漏到胞外，性，使胞内代谢物迅速渗漏到胞外，解除反馈抑制解除反馈抑制现在学习的是第58页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选结构类似物：在化学和空间结构上与代谢中间物（终结构类似物：在化学和空间结构上与代谢中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细

49、胞不能以其作为自身的营物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。养物质。现在学习的是第59页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)具体操作具体操作 两种方法：两种方法：(i)(i)将缺陷型菌株培养后，收集菌体，洗涤培养基，将缺陷型菌株培养后，收集菌体，洗涤培养基，制备成细胞悬液后，与制备成细胞悬液后，与MMMM培养基（融化并凉至培养基（融化并凉至5050）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5656个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱

50、此组织营养物的滤纸圆片，培养后若在组合区长出，组织营养物的滤纸圆片，培养后若在组合区长出，就可测得营养缺陷类型。就可测得营养缺陷类型。现在学习的是第60页，共96页变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选(3)(3)确定生长谱确定生长谱 (产品鉴定产品鉴定)具体操作具体操作 两种方法：两种方法：(ii)(ii)以不同组合的营养混合物与融化凉至以不同组合的营养混合物与融化凉至5050的的MMMM培培养基铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷养基铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于相应位置，培养后根据菌种在什么组合长出型菌株于相应位置，培养后根据菌种在什么组合长出可推知其营养缺陷