现代生物技术的综合实验.ppt

《现代生物技术的综合实验.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《现代生物技术的综合实验.ppt（49页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、现代生物技术的综合实验现在学习的是第1页，共49页n本课程实验项目（本课程实验项目（54学时）学时）实验实验1、质粒、质粒DNA的制备与质量鉴定的制备与质量鉴定 （包含琼脂糖凝胶电泳）（包含琼脂糖凝胶电泳）实验实验2、质粒、质粒DNA的片段化与分离的片段化与分离 实验实验3、大分子、大分子DNA的制备和质量鉴定的制备和质量鉴定实验实验4、PCR反应反应实验实验5、PCR产品纯化及克隆产品纯化及克隆实验实验6、感受态细胞制备及转化、感受态细胞制备及转化实验实验7、利用不同的方法筛选和鉴定转化子、利用不同的方法筛选和鉴定转化子 （综合设计实验，综合设计实验，18学时学时）现在学习的是第2页，共49

2、页n实验要求实验要求q两人一组，独立实验两人一组，独立实验q每次实验完成均要求写实验报告及思考题每次实验完成均要求写实验报告及思考题q不得旷课，特殊情况可补实验不得旷课，特殊情况可补实验q每次实验安排每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶人配制琼脂糖凝胶n本课程考核本课程考核q前前6个实验共计个实验共计50分（实验报告和思考题）分（实验报告和思考题）（本部分成绩也是（本部分成绩也是基因工程基因工程的平时成绩）的平时成绩）q综合实验（包括设计报告）共计综合实验（包括设计报告）共计50分分现在学习的是第3页，共49页实验一实验一 质粒质粒DNA的制备与质量鉴定的制备与质量鉴定一、实验目的一、实验目的 学习

3、并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。的提取方法。现在学习的是第4页，共49页二、实验原理二、实验原理 在碱性溶液中，双链在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且分子量相对较小，且呈环状呈环状超螺旋结构超螺旋结构，即使，即使在高碱性在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的构型又恢复到原来的构型；而线性的大分

4、子量细菌染色体而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分及小分子量的子量的RNA则留在上清液中，再用酚则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留氯仿处理，可去除残留蛋白质，混杂的蛋白质，混杂的RNA可用可用RNA酶酶(RNAase)消除。消除。现在学习的是第5页，共49页三、实验材料与主要试剂三、实验材料与主要试剂 实验材料：实验材料：含含pEGFP质粒

5、质粒的大肠杆菌的大肠杆菌DH5 主要试剂：主要试剂：溶液溶液I：50 mM葡萄糖，葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液溶液II：0.2 mol/L NaOH溶液（内含溶液（内含1%SDS）,现配现用现配现用 溶液溶液III（pH4.8）:60 mL 5 mol/L醋酸钾，醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，冰醋酸，28.5 mL H2O；饱和酚饱和酚/氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（25:24:1）、酚）、酚/氯仿（氯仿（1:1，V/V）TE缓冲液（缓冲液（pH8.0）:10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，

6、含含RNA酶（酶（RNaseA）:20 g/ml 醋酸钠（醋酸钠（pH5.2）、）、70%乙醇、无水乙醇乙醇、无水乙醇现在学习的是第6页，共49页现在学习的是第7页，共49页四、实验步骤四、实验步骤1)吸取吸取1.4 ml菌液至菌液至1.5 ml离心管中。离心管中。2)离心离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复否需要重复12次）。次）。3)加入加入150 L 溶液溶液，用旋涡振荡器，用旋涡振荡器充分悬浮菌体充分悬浮菌体。4)加入加入200 L溶液溶液，加盖后温和颠倒，加盖后温和颠倒56次，直至呈透明状。次，直至呈透明状。此步

7、骤在此步骤在5分钟内完成。分钟内完成。5)加入加入150 L预冷的溶液预冷的溶液，加盖后反复颠倒混匀，直至出，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴现白色絮状沉淀，冰浴5min。6)离心离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心管。，移取上清液于另一干净离心管。现在学习的是第8页，共49页7)7)向上清液中向上清液中加等体积加等体积的苯酚的苯酚/氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（25:24:1），振荡混），振荡混匀抽提，离心匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出现分层。，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约移取上层水相溶液（约450500L）于

8、另一干净离心管，加等）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液，溶液将出现分层。将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠体积的醋酸钠（pH5.2）和）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。10)离心离心(14 000r/min，10min，4)，倒掉上清液。，倒掉上清液。现在学习的是第9页，共49页11)加加0.5 ml 预冷的预冷的70%酒精振荡，洗酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心沉淀一次，离心5 min，倒掉上清

9、液。，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥真空抽干或室温自然干燥.13)加加2030L TE缓冲液使缓冲液使DNA完全溶解，室温放置完全溶解，室温放置10min，降解，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒-20保存备用。保存备用。14)1%琼脂糖凝胶配制：称取琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入溶液，加热熔化，稍降温后，加入5L溴化乙锭溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。现在学习的是第10页，共49页15)每位

10、同学各取每位同学各取5L质粒质粒DNA加入加入1L 6loading buffer，混匀，混匀，进行行点样。点样。16)电泳条件：电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录系统检测，观察实验结果，并拍照记录。五、实验结果五、实验结果 观察并分析电泳图片观察并分析电泳图片六、实验报告六、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。现在学习的是第11页，共49页实验二实验二 质粒质粒DNA的片断化及分离的片断化及分离 一、实验目的一、实验目的 1、学习利用紫外分光光度法

11、鉴定学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量质量 2、采用、采用型限制性核酸内切酶切割质粒型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。糖凝胶电泳分析酶切效果。现在学习的是第12页，共49页二、实验原理二、实验原理 DNA吸收光谱峰在吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下处，测定此波长下DNA溶液的溶液的OD值，值，当当OD260=1时，双链时，双链DNA含量约为含量约为50 g/mL，据此可用紫外分光光，据此可用紫外分光光度计测定溶液中度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质吸收峰在含量。由于蛋白质吸收峰在280 nm处，在测定处，在测定DNA含量时，通过计算含量

12、时，通过计算OD260/OD280值，可了解所测值，可了解所测DNA的纯度，的纯度，如该值为如该值为1.82.0时，时，DNA纯度高。纯度高。已知已知型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该处切型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该处切断双链断双链DNA，形成一定长度和序列的，形成一定长度和序列的DNA片段。酶切反应需片段。酶切反应需Mg2+等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶对盐离子有不同等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高（的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高（5%），会使），会使酶的识别位点发生改变，产生

13、星活性。绝大多数酶的反应温度酶的识别位点发生改变，产生星活性。绝大多数酶的反应温度37。现在学习的是第13页，共49页三、实验材料：三、实验材料：实验一提取的质粒实验一提取的质粒DNA四、试剂四、试剂 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Xba I；缓冲液；缓冲液10M Buffer；0.1%BSA;0.5TBE Buffer；1%琼脂糖琼脂糖五、实验步骤五、实验步骤 1、DNA的测定的测定 空白测定空白测定(Blank)：吸取：吸取200 l TE缓冲液至比色杯，进行空白测定。缓冲液至比色杯，进行空白测定。DNA测定测定(Sample)：取质粒：取质粒DNA 1 l至一干净的离心管，加入至一干净

14、的离心管，加入199 l TE缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260 nm及及280 nm的光吸收值；计录的光吸收值；计录DNA浓度及浓度及OD260/OD280比值。比值。现在学习的是第14页，共49页现在学习的是第15页，共49页2 2、酶切反应、酶切反应 酶切反应液的配制酶切反应液的配制:Xba I I 1l 10M buffer 2l 0.1%BSA 2l DNA 5l(根据质粒浓度来确定用量根据质粒浓度来确定用量)ddH2O 10l 酶切反应条件：酶切反应条件：3737水浴水浴2 23 3小时小时。3 3、电泳检测、

15、电泳检测 反应结束后，向反应液中加入反应结束后，向反应液中加入2.5l 102.5l 10loading bufferloading buffer，混匀，用以停止酶切反应，所有混匀，用以停止酶切反应，所有22.5l22.5l样品均点在同一个点样样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：孔中。电泳条件：120V,20120V,20分钟左右。分钟左右。现在学习的是第16页，共49页六、实验结果六、实验结果 观察并分析电泳图片。观察并分析电泳图片。七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。现在学习的是第17页，共49页实验三实验三 大分子大分

16、子DNA的制备和质量鉴定的制备和质量鉴定 一、实验目的一、实验目的 采用采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织中提法从植物组织中提取基因组取基因组DNA，并进行，并进行DNA纯度分析和琼脂糖凝胶电泳检纯度分析和琼脂糖凝胶电泳检测。测。现在学习的是第18页，共49页二、实验原理二、实验原理 核酸是生物有机体的重要成分，在细胞中核酸常与蛋白质结合在一起，核酸是生物有机体的重要成分，在细胞中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。蛋白被释放出

17、来。在浓在浓NaCl溶液溶液(12mol/L)中，中，DNA核蛋白的溶解度很大，核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液溶液(0.14mol/L)中，中，DNA核蛋核蛋白的溶解度很小，白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的的NaCl溶液将溶液将DNA核蛋白和核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。核蛋白从样品中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓度盐溶液中沉淀核酸与酸性是一种阳离子去污剂，具有从低浓度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液中多聚糖的特

18、性。在高浓度盐溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。物，只是不能沉淀核酸。分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去。现在学习的是第19页，共49页有效制备大分子有效制备大分子DNA的两个原则：的两个原则：1）防止和抑制内源）防止和抑制内源DNase对对DNA的降解。的降解。2）尽量减少对溶液中）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；所有操作均须的机械剪切破坏；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。温和，避免剧烈震荡。现在学习的是第20页，共49页三、实验材料：三、实验材料：植物叶片约植物叶片约0.2克克四、

19、实验试剂四、实验试剂 1M Tris-HCl(pH8.0)(提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏)CTAB分离缓冲液：分离缓冲液：2%CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2%巯基乙醇巯基乙醇(EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易从基因组DNA中除去)洗涤缓冲液：洗涤缓冲液：76%乙醇，乙醇，10mmol/L乙酸铵乙酸铵 氯仿氯仿-异戊醇异戊醇(2

20、4:1)、异丙醇、异丙醇、TE缓冲液缓冲液 液氮液氮现在学习的是第21页，共49页五、实验步骤五、实验步骤1.CTAB分离缓冲液置于分离缓冲液置于60水浴中预热；水浴中预热；2.2人一组，摘取人一组，摘取0.5g叶片，置于研钵中，倒入液氮，尽快叶片，置于研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎；将叶片研碎；3.取约取约0.2g叶片粉末加入到叶片粉末加入到2.0mL离心管中，加入离心管中，加入1ml预热的预热的CTAB分离缓冲液，轻轻转动使之混匀；分离缓冲液，轻轻转动使之混匀；4.样品置于样品置于65保温保温30min；5.加等体积加等体积(1mL)的氯仿的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀；异戊醇，轻轻颠倒混

21、匀；6.室温下室温下14000 rpm离心离心10min；现在学习的是第22页，共49页7.上层水相吸入另一干净上层水相吸入另一干净1.5mL离心管中，加入离心管中，加入2/3体积的异体积的异丙醇，轻轻混匀，静置丙醇，轻轻混匀，静置5min，使核酸沉淀下来；，使核酸沉淀下来；8.室温下室温下10000 rpm离心离心10min；9.弃去上清液，加入弃去上清液，加入500L洗涤缓冲液，悬浮混匀；洗涤缓冲液，悬浮混匀；10.4条件下，条件下，14000 rpm离心离心10min；11.在室温下使在室温下使DNA沉淀干燥至周围透明，中间有少许白色为止；沉淀干燥至周围透明，中间有少许白色为止；12.将

22、将DNA沉淀溶于沉淀溶于20L TE中，中，-20保存备用；保存备用；13.取取5uL DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取DNA的完的完整性；整性；14.利用核酸蛋白检测仪进行利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。浓度和纯度检测。（方法同实验二）（方法同实验二）现在学习的是第23页，共49页六、实验结果六、实验结果 基因组基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片的浓度和纯度；观察并分析电泳图片七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。现在学习的是第24页，共49页实验四实验四 PC

23、R反应反应一、实验目的一、实验目的 了解了解PCR的基本原理，掌握的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。的基本操作技术。现在学习的是第25页，共49页二、实验原理二、实验原理PCR技术是通过模拟技术是通过模拟体内体内DNA复制复制的方式，在体外选择性地的方式，在体外选择性地将将将将DNADNA某个特殊区域某个特殊区域某个特殊区域某个特殊区域扩增出来的技术。扩增出来的技术。PCR的过程：的过程：q高温变性高温变性：将反应体系置于高温下变性，使模板双链：将反应体系置于高温下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。解链为两条单链。q低温退火低温退火：引物与模板链结合，形成部分双链：引物与模板链结合，形

24、成部分双链DNA。q中温延伸中温延伸：Taq DNA聚合酶使引物从聚合酶使引物从5端向端向3端延伸，端延伸，4种种dNTP掺入合成新的掺入合成新的DNA互补链。互补链。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的围内的DNA序列以指数形式扩增。序列以指数形式扩增。现在学习的是第26页，共49页三、实验材料三、实验材料 质粒：质粒：pEGFP 四、试剂四、试剂1.10 PCR buffer、rTaq 酶酶2.dNTP mixtures：dATP,dTTP,dGTP,dCTP 各各2.5mM3.引物引物(2.5M)GFP-F

25、:5:5-TAGTCGACT-TAGTCGACTATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-5GTGAGCAAGGGCGAGGAG-5 (Tm=65.5)GFP-R:5:5-GCGTCTAGA-GCGTCTAGATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3CTTGTACAGCTCGTCCATG-3 (Tm=61.5)4.2.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 现在学习的是第27页，共49页五、实验步骤五、实验步骤1、PCR反应混合液的配制反应混合液的配制(50l)10 PCR buffer 5l dNTP mixture 4l 前向引物前向引物(P1)8l 反向引物反向引物 (P2)8l

26、 DNA 模板模板 0.5l rTaq酶酶 0.5l 灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水 24l 所有试剂所有试剂按量仔细添加按量仔细添加按量仔细添加按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加反应混合液蒸发，可添加30l矿物油覆盖。矿物油覆盖。现在学习的是第28页，共49页2、PCR仪的参数设置仪的参数设置 94 4 min 94 30sec 40 cycles 61 30sec 72 50sec 72 5 min3、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后，取反应结束后，取5l PCR产品，加入产品，加入1l 6loading bu

27、ffer，混匀后点，混匀后点样，电泳样，电泳20min。其余其余45l PCR产品保存在产品保存在-20冰箱中，下次实验使用。冰箱中，下次实验使用。现在学习的是第29页，共49页六、实验结果六、实验结果 观察并分析电泳图片观察并分析电泳图片七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。现在学习的是第30页，共49页实验五实验五 PCR产品纯化及克隆产品纯化及克隆一、实验目的一、实验目的 学习学习PCR产物纯化的实验技术，掌握基因工程操作产物纯化的实验技术，掌握基因工程操作技术中最常用的技术中最常用的T-A克隆方法克隆方法。现在学习的是

28、第31页，共49页二、实验原理二、实验原理 PCR产物一般都含有过量的引物、产物一般都含有过量的引物、Taq酶及酶及dNTP等成分，直等成分，直接影响后续的接影响后续的DNA连接酶的连接反应连接酶的连接反应;实验中可采用苯酚实验中可采用苯酚/氯仿氯仿/异异戊醇、氯仿依次使反应体系中的蛋白质杂质变性的方法纯化戊醇、氯仿依次使反应体系中的蛋白质杂质变性的方法纯化DNA产品，然后在酸性条件下用无水乙醇沉淀产品，然后在酸性条件下用无水乙醇沉淀DNA。利用普通的利用普通的Taq DNA聚合酶所扩增的聚合酶所扩增的PCR产物的产物的3-端具有端具有一个一个A突出末端，突出末端，T载体的载体的5-端具有一个

29、端具有一个T突出末端，二者正突出末端，二者正好互补，然后用好互补，然后用T4 DNA连接酶在体外将目的片段与线性化载连接酶在体外将目的片段与线性化载体连接的方法称为体连接的方法称为T-A克隆。克隆。现在学习的是第32页，共49页三、实验材料三、实验材料 实验四的实验四的 PCR产品产品 pMD19-T Vector四、试剂四、试剂TE 缓冲液缓冲液苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(25/24/1)、氯仿、氯仿醋酸钠（醋酸钠（pH5.2）、无水乙醇、）、无水乙醇、70%乙醇乙醇T4 DNA连接酶混合物连接酶混合物(Solution I)现在学习的是第33页，共49页现在学习的是第34页，共49页

30、五、实验步骤五、实验步骤1、PCR产品纯化产品纯化将将PCR产品（约产品（约45l）小心转入）小心转入1.5ml离心管中，加入离心管中，加入55l TE缓冲液至总体积缓冲液至总体积100l，混匀；，混匀；加入加入100l苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇，涡旋混合异戊醇，涡旋混合1 min，14000 rpm离心离心5 min；将上层水相转移至新离心管，加入将上层水相转移至新离心管，加入100l氯仿，涡旋混合氯仿，涡旋混合1 min，14000 rpm离心离心5 min；再将上层水相转移至新离心管，加再将上层水相转移至新离心管，加10l醋酸钠（醋酸钠（pH=5.2）和和250l无水乙醇，颠倒混匀，将离

31、心管插入冰中放置无水乙醇，颠倒混匀，将离心管插入冰中放置 30 min；现在学习的是第35页，共49页在在4，14000 rpm离心离心10 min，弃去上清液，观察，弃去上清液，观察DNA沉淀；沉淀；加入加入500l预冷预冷 70乙醇，洗涤乙醇，洗涤DNA沉淀沉淀,4 14000 rpm离心离心5min，弃去上清液；空气干燥，弃去上清液；空气干燥DNA沉淀，加沉淀，加5l无菌无菌水溶解水溶解 DNA。2、连接反应、连接反应经纯化的经纯化的PCR产品产品4.5l转移到转移到PCR管中，加入管中，加入0.5l pMD19-T载体，再加入载体，再加入5l T4 DNA连接酶混合物（连接酶混合物（S

32、olution I），轻轻混匀，稍加离心即可；），轻轻混匀，稍加离心即可；连接反应混合物放置在连接反应混合物放置在PCR仪中，仪中，16连接过夜；连接过夜；连接产物用于下次转化实验。连接产物用于下次转化实验。现在学习的是第36页，共49页六、实验结果六、实验结果 本次实验结果必须等到下次实验完成后才能确定是否连接本次实验结果必须等到下次实验完成后才能确定是否连接成功。成功。七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。（下周不用交报告，实验六完成后再交下周不用交报告，实验六完成后再交）现在学习的是第37页，共49页实验六实验六 感受态

33、细胞的制备和转化感受态细胞的制备和转化一、实验目的一、实验目的1.了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。义。2.学习用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。学习用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习外源学习外源DNA转化大肠杆菌受体细胞的方法。转化大肠杆菌受体细胞的方法。现在学习的是第38页，共49页二、实验原理二、实验原理 转化转化是将外源是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺

34、陷的变异株系统缺陷的变异株(R-，M-)，这些变异株可以容忍外源，这些变异株可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些化学试剂如受体细胞经过一些化学试剂如CaCl2、RbCl等处理后，细等处理后，细胞膜的通透性会发生暂时性的改变，成为能允许外源胞膜的通透性会发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分分子进入的子进入的感受态细胞感受态细胞。进入受体细胞的。进入受体细胞的DNA分子通过复制，分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。现在学习的是第39页，共49页 三、实

35、验材料三、实验材料 E.coli DH5菌株：菌株：R-，M-，Amp-实验五的连接产物：实验五的连接产物：pMD19/GFP四、试剂四、试剂 1、含氨苄青霉素、含氨苄青霉素(Amp,100mg/L)的的LB固体培养基固体培养基 2、X-gal储存液（储存液（20mg/ml）3、IPTG储存液（储存液（200mg/ml）4、0.10 mol/L CaCl2溶液溶液现在学习的是第40页，共49页五、实验步骤五、实验步骤1、受体菌的培养、受体菌的培养 从从LB平板上挑取新鲜活化的平板上挑取新鲜活化的E.coli DH5单菌落，接种于单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，液体培养基中，37下振

36、荡培养下振荡培养12h左右，直至对数左右，直至对数生长后期。生长后期。将该菌悬液以将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于100mL LB液体培养液体培养基中，基中，37振荡培养振荡培养2-3h至至OD600=0.5左右。左右。(实验老师已帮大家完成实验老师已帮大家完成)现在学习的是第41页，共49页2、感受态细胞的制备、感受态细胞的制备(CaCl2法法)吸取吸取1.5mL培养液到一灭菌的离心管中，将离心管插入冰培养液到一灭菌的离心管中，将离心管插入冰中放置中放置10min，然后于，然后于4下下10 000 rpm离心离心10min。弃去上清，用弃去上清，用1mL预冷的预冷的0

37、.10mol/L CaCl2 溶液轻轻悬浮溶液轻轻悬浮细胞，将离心管插入冰中放置细胞，将离心管插入冰中放置30min，4下下10 000rpm离心离心10min。弃去上清，加入弃去上清，加入100 l预冷的预冷的0.10mol/L CaCl2溶液，轻轻溶液，轻轻悬浮细胞，冰中放置几分钟，即成悬浮细胞，冰中放置几分钟，即成感受态细胞感受态细胞。现在学习的是第42页，共49页3、连接产物的转化、连接产物的转化 向制备的感受态细胞中加入向制备的感受态细胞中加入10l连接产物，轻轻摇匀，插连接产物，轻轻摇匀，插入冰中，放置入冰中，放置30min。含有混合物的离心管置入含有混合物的离心管置入42水浴中热

38、击水浴中热击90秒，热击后迅秒，热击后迅速插入冰中，冷却速插入冰中，冷却3-5min。向离心管中加入向离心管中加入900 L LB液体培养基，混匀后液体培养基，混匀后37振振荡培养荡培养12h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因码的抗生素抗性基因(Ampr)。现在学习的是第43页，共49页4、转化产物的涂布、转化产物的涂布筛选培养基筛选培养基(含含X-gal和和IPTG)的准备：在事先制备好的的准备：在事先制备好的含含100 mg/L Amp的的LB平板表面（平板表面（中央位置中央位置）加）加40l X-gal储存液和储存液和4 l I

39、PTG储存液，用无菌玻棒将溶液涂布储存液，用无菌玻棒将溶液涂布均匀，置于超净工作台上，使培养基表面的液体完全被均匀，置于超净工作台上，使培养基表面的液体完全被吸收。吸收。取取500 l复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，待菌液待菌液完全被培养基吸收完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿边后，用封口膜封住培养皿边缘，倒置培养皿，缘，倒置培养皿，37培养过夜。培养过夜。现在学习的是第44页，共49页全班做两个对照全班做两个对照:(由班长和学委各做一个由班长和学委各做一个)阴性对照组：阴性对照组：以以10l无菌水代替连接产物，其它操作相同。此组正常情况下在无菌

40、水代替连接产物，其它操作相同。此组正常情况下在含含Amp的的LB平板上应没有菌落出现。平板上应没有菌落出现。阳性对照组：阳性对照组：以以1l的质粒的质粒DNA代替连接产物，其它操作相同。此组正常代替连接产物，其它操作相同。此组正常情况下应产生大量白色菌落情况下应产生大量白色菌落。现在学习的是第45页，共49页六、实验结果六、实验结果 第二天上午十点左右回实验室观察平板上是否长出转化子第二天上午十点左右回实验室观察平板上是否长出转化子(直径约直径约1mm)，各自拍照记录实验结果，然后将平板保，各自拍照记录实验结果，然后将平板保存在存在4冰箱中，作为综合实验的筛选材料。冰箱中，作为综合实验的筛选材

41、料。七、实验报告七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。现在学习的是第46页，共49页实验七实验七 利用不同的方法筛选和鉴定转化子利用不同的方法筛选和鉴定转化子1、指导思想、指导思想 学生经过前期的实验已经基本掌握了本门实验课学生经过前期的实验已经基本掌握了本门实验课程的基本理论和基本技术。所以设置一个综合性的实程的基本理论和基本技术。所以设置一个综合性的实验，以培养学生的综合能力和创新能力。验，以培养学生的综合能力和创新能力。本实验内容包括了以前所有实验的基本原理和基本技本实验内容包括了以前所有实验的基本原理和基本技术，学生可以根据实验要

42、求，运用学过的知识和技能，自术，学生可以根据实验要求，运用学过的知识和技能，自己设计实验方案，筛选出转基因菌株。己设计实验方案，筛选出转基因菌株。现在学习的是第47页，共49页2、实验目的、实验目的 通过不同方法组合，筛选获得转基因菌株。通过不同方法组合，筛选获得转基因菌株。3、实验要求、实验要求根据实验要求，运用学过的知识和技能以及查阅相关资根据实验要求，运用学过的知识和技能以及查阅相关资料，先料，先设计实验方案设计实验方案，提交老师批阅认可；，提交老师批阅认可；独立进行实验准备和实验，筛选出阳性转化子；独立进行实验准备和实验，筛选出阳性转化子；实验结束，撰写综合性实验报告，即小论文实验结束，撰写综合性实验报告，即小论文1篇。篇。小论文要求：字数不少于小论文要求：字数不少于3000，包括论文题目、作者、摘要、，包括论文题目、作者、摘要、关键词、引言、材料与方法、结果与分析、结论或讨论、参关键词、引言、材料与方法、结果与分析、结论或讨论、参考文献。考文献。现在学习的是第48页，共49页4、涉及的内容或知识点、涉及的内容或知识点抗性筛选抗性筛选转化子转化子蓝白斑筛选蓝白斑筛选重组子重组子菌落直接菌落直接PCR的分子鉴定的分子鉴定转基因大肠杆菌转基因大肠杆菌质粒提取及酶切鉴定质粒提取及酶切鉴定转基因大肠杆菌转基因大肠杆菌现在学习的是第49页，共49页