生化分离高级纯化技术.ppt

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1、生化分离高级纯化技术现在学习的是第1页，共63页第一节 层析技术概述v一、层析技术的原理v二、层析技术的类别v三、大规模生物分子纯化层析方法 现在学习的是第2页，共63页一、层析技术的原理v1、层析的由来：层析分离始于层析分离始于20世纪初，世纪初，1903年俄国植物学家向填充碳酸钙的柱中注入植年俄国植物学家向填充碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚萃取物，发现柱中出现数条相互分离的色带，层析法物色素的石油醚萃取物，发现柱中出现数条相互分离的色带，层析法（Chromatography）的命名由此开始，又称色谱或色层。）的命名由此开始，又称色谱或色层。v2、层析技术的原理 根据混合物中，溶质在互不混

2、溶的两相之间分配的差别，引起移动速度不同而进根据混合物中，溶质在互不混溶的两相之间分配的差别，引起移动速度不同而进行分离的方法（行分离的方法（如下图）。互不相溶的两相分别称如下图）。互不相溶的两相分别称固定相（固定相（stationary phase）和和流动相（流动相（mobile phase）。料液中溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，产生分配平衡。分配系数大的溶质料液中溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，产生分配平衡。分配系数大的溶质在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小，溶质之间的移动速度的不同而分离。，溶质之间的移动速度的不同而分

3、离。现在学习的是第3页，共63页柱层析设备和操作示意图收集器料液流动相三通阀泵泵层析柱ABCD浓度时间（或洗脱液体积）ABCD现在学习的是第4页，共63页二、层析技术的类别v1、流动相与固定相、流动相与固定相 A、根据流动相的相状态：、根据流动相的相状态：气相层析法气相层析法、液相层析法液相层析法、超临界超临界流体层析法。流体层析法。B、固定相为固体、液体和以固体为载体的液体薄层，分别为：、固定相为固体、液体和以固体为载体的液体薄层，分别为：吸吸附层析法、液体的分配层析法、液体薄层的分配层析法附层析法、液体的分配层析法、液体薄层的分配层析法。v2、固定相的形状、固定相的形状 固定相或层析装置形

4、状不同，液相层析法又分：固定相或层析装置形状不同，液相层析法又分：纸层析法（纸层析法（Paper chromatography）薄层层析法（薄层层析法（Thin-layer chromatography）柱层析法（柱层析法（Column chromatography）现在学习的是第5页，共63页3、压力、压力 以固体（包括以固体为载体的液体薄层）为固体相的液相柱层析中，以固体（包括以固体为载体的液体薄层）为固体相的液相柱层析中，根据操作压力不同，分为：根据操作压力不同，分为：低压（小于低压（小于 0.5 MPa）液相层析法）液相层析法 中压（中压（0.54.0 MPa）液相层析法）液相层析法

5、高压（高压（4.0 40 MPa）液相层析法）液相层析法v4、分配机理、分配机理 根据溶质和固定相之间的相互作用机理（液液分配、各种吸附作根据溶质和固定相之间的相互作用机理（液液分配、各种吸附作用），液相层析法可分为：用），液相层析法可分为：凝胶过滤层析凝胶过滤层析 亲和层析亲和层析 离子交换层析离子交换层析 反相层析反相层析 疏水性相互作用层析疏水性相互作用层析现在学习的是第6页，共63页5、分离操作方式、分离操作方式 操作方式不同：操作方式不同：洗脱展开层析（洗脱展开层析（elution developmentelution development）（洗脱层析）（洗脱层析）迎头分析（迎头分

6、析（frontal analysisfrontal analysis）顶替展开（顶替展开（displacement developmentdisplacement development）v6、料液流向：、料液流向：轴向流层析轴向流层析 径向流层析径向流层析现在学习的是第7页，共63页三、适用于大规模生物分子纯化的层析方法分离方法分离方法分离原理分离原理特特 点点 应应 用用凝胶过滤凝胶过滤 分子大小分子大小 分辨率为中等，但对脱盐效果分辨率为中等，但对脱盐效果优良；流速较低，容量受样本优良；流速较低，容量受样本体积的限制体积的限制 大规模纯化的最后步骤，任一大规模纯化的最后步骤，任一阶段可脱

7、盐，尤其适用于两种阶段可脱盐，尤其适用于两种缓冲液交替缓冲液交替 离子交换离子交换 电电 荷荷 分辨率高，流速快，容量很高，分辨率高，流速快，容量很高，体积不受限制体积不受限制 最适用于大量样品处理的前阶最适用于大量样品处理的前阶段段 聚焦层析聚焦层析 等电点等电点分辨率高，流速快，容量很高，分辨率高，流速快，容量很高，柱大小限制体积柱大小限制体积 适用于纯化后阶段适用于纯化后阶段 疏水层析疏水层析 疏水性疏水性 分辨率好，流速很快，容量高，分辨率好，流速很快，容量高，体积不受限制体积不受限制 适用于分离任一阶段，样品离适用于分离任一阶段，样品离子强度高时，即在盐析、离子子强度高时，即在盐析、

8、离子交换或亲和层析后使用交换或亲和层析后使用 亲和层析亲和层析亲和性亲和性 分辨率非常高，流速高，样品分辨率非常高，流速高，样品体积不受限制体积不受限制 适用于分离任一阶段，尤其样适用于分离任一阶段，尤其样品体积大、浓度很低而杂质含品体积大、浓度很低而杂质含量很高时量很高时 现在学习的是第8页，共63页第二节 凝胶过滤层析v一、凝胶过滤层析的原理一、凝胶过滤层析的原理v二、凝胶过滤层析介质二、凝胶过滤层析介质v三、凝胶过滤层析的应用和特点三、凝胶过滤层析的应用和特点现在学习的是第9页，共63页一、凝胶过滤层析的原理一、凝胶过滤层析的原理1、原理：、原理：凝胶过滤层析凝胶过滤层析（Gel fil

9、tration chromatography，GFC）又）又称称分子排阻层析分子排阻层析、分子筛层析分子筛层析，以凝胶颗粒为固定相，根据料液中溶，以凝胶颗粒为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析，当料液通过层析柱时，大质相对分子质量的差别进行分离的液相层析，当料液通过层析柱时，大于凝胶孔径的分子不能进入凝胶孔内，被凝胶孔排阻，只能在胶外颗粒于凝胶孔径的分子不能进入凝胶孔内，被凝胶孔排阻，只能在胶外颗粒之间的孔隙中流动和分配，流经路程短，很快被洗脱出来。小于凝胶孔之间的孔隙中流动和分配，流经路程短，很快被洗脱出来。小于凝胶孔的分子进入凝胶孔内，在凝胶孔内外分配，在凝胶孔内部

10、穿行，移动速的分子进入凝胶孔内，在凝胶孔内外分配，在凝胶孔内部穿行，移动速度慢，滞后流出，大小不同的分子得以分离。度慢，滞后流出，大小不同的分子得以分离。分 离 原 理现在学习的是第10页，共63页洗脱体积（洗脱体积（Ve）：在凝胶过滤层析中，使溶质从柱中流出：在凝胶过滤层析中，使溶质从柱中流出 时所时所通过的流动相体积；通过的流动相体积；外水体积（外水体积（V0）：凝胶颗粒之间的空隙的总体积；：凝胶颗粒之间的空隙的总体积；柱总体积（柱总体积（Vt）：Vt=V0ViVm 内水体积（内水体积（Vi）：凝胶颗粒内部空隙总体积；：凝胶颗粒内部空隙总体积；凝胶体积（凝胶体积（Vm）：凝胶颗粒基质本身所

11、占的体积；：凝胶颗粒基质本身所占的体积；在限定的层析条件下，在限定的层析条件下，Vt和和V0都恒定值，而都恒定值，而Ve随水分离物分子质随水分离物分子质量的变化而变化。量的变化而变化。其分离效果可用分配系数（其分离效果可用分配系数（Kav）来表示，）来表示，现在学习的是第11页，共63页v（1）Kav 0时，则时，则Ve V0，洗脱体积等于孔隙体积，完全，洗脱体积等于孔隙体积，完全 排阻排阻（组分（组分）；v（2）Kav1时，则时，则Ve V0 Vi，洗脱体积等于孔隙体积和内，洗脱体积等于孔隙体积和内水体积之和，小分子完全进入凝胶内部（组分水体积之和，小分子完全进入凝胶内部（组分）；）；v（3

12、）0 Kav 1，内水体积只有一部分被组分利用，扩散渗透，内水体积只有一部分被组分利用，扩散渗透（组分（组分）。）。v料液体积小于洗脱体积时，两种溶质才可能完全分离。料液体积小于洗脱体积时，两种溶质才可能完全分离。溶质的分配系溶质的分配系数只与相对分子质量、分子形状、凝胶结构（孔径大小）有关，与洗数只与相对分子质量、分子形状、凝胶结构（孔径大小）有关，与洗脱液的脱液的PH值和离子强度等物性无关。值和离子强度等物性无关。讨论：现在学习的是第12页，共63页洗洗 脱脱 曲曲 线线现在学习的是第13页，共63页2、凝胶过滤介质、凝胶过滤介质 v（1 1）介质种类）介质种类A、琼脂糖凝胶（、琼脂糖凝胶

13、（Sepharose）：）：除凝胶过滤层析除凝胶过滤层析(GFC)外，琼脂糖凝胶化学修饰后主要用于离外，琼脂糖凝胶化学修饰后主要用于离子交换层析、疏水性相互作用层析及亲和层析。子交换层析、疏水性相互作用层析及亲和层析。B、Sephadex G：利用葡聚糖交联制备。交联剂一般用环氧氯丙烷利用葡聚糖交联制备。交联剂一般用环氧氯丙烷（epichloryohdrin）,用量越大，交联度越高，凝胶网状结构用量越大，交联度越高，凝胶网状结构越紧密，吸水量小，分为越紧密，吸水量小，分为G10200八种型号。八种型号。C、聚丙烯酰胺凝胶（、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）：）：现在学习的是第14页，共63

14、页v（2 2）凝胶特性参数）凝胶特性参数vA、排阻极限（、排阻极限（exclusion limit）：）：是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量。不同凝胶是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量。不同凝胶介质具有不同的排阻极限。如介质具有不同的排阻极限。如Sephadex G50的分子排阻为的分子排阻为30KD。vB、分级范围（、分级范围（fractionation range）：）：能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。质量范围。Sephadex G-50的分级范围为的分级范围为1.530KD。vC

15、、溶胀率、溶胀率:每克干凝胶溶胀后所吸收水分的百分数，即每克干凝胶溶胀后所吸收水分的百分数，即 溶胀率溶胀率100(溶胀平衡后重量干燥重量溶胀平衡后重量干燥重量)/干燥重量干燥重量 Sephadex G-50的溶胀率为的溶胀率为50030现在学习的是第15页，共63页vD、床体积（、床体积（bed volume）：）：1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。干燥凝胶溶胀后所占的体积。Sephadex G-50的床体积为的床体积为911cm3/g干胶。干胶。vE、空隙体积（、空隙体积（void volume）：）：层析柱中凝胶之间孔隙的体积层析柱中凝胶之间孔隙的体积(V0)，一般用平均相对分子量为，一般用

16、平均相对分子量为2，000KD的水溶性蓝色葡聚糖（的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）测定。）测定。vF、凝胶粒径：、凝胶粒径：凝胶一般为球形，粒径越小分离效率越高。粒径多用筛目或微凝胶一般为球形，粒径越小分离效率越高。粒径多用筛目或微米表示。如软凝胶粒径为米表示。如软凝胶粒径为50150m(100200目目)。现在学习的是第16页，共63页v特点：特点：操作简便、过滤介质相对价廉，适合大规模分离纯化。但仅操作简便、过滤介质相对价廉，适合大规模分离纯化。但仅根据溶质相对分子量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小。根据溶质相对分子量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小。3、凝胶过滤

17、的特点及应用、凝胶过滤的特点及应用现在学习的是第17页，共63页v（1）分离纯化：）分离纯化：用于相对分子量从几百到用于相对分子量从几百到106数量级的物质分离纯化，是蛋数量级的物质分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒（核酸以及病毒（50400nm）的分离与分析使用的方法。如图的分离与分析使用的方法。如图GFC分离鼠血清分离鼠血清IgG。又如利用。又如利用Sephadex G25凝胶柱处理青霉凝胶柱处理青霉素溶液中高分子杂质。素溶液中高分子杂质。应用：现在学习的是第18页，共63页v（2）脱盐：）脱盐：经盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一

18、般不能直接进行离子经盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换层析分离，可首选交换层析分离，可首选GFC脱盐。脱盐。v（3）相对分子量的测定：）相对分子量的测定：在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成线性关系。用于未知物质相对分子积）与相对分子质量的对数成线性关系。用于未知物质相对分子质量的测定。质量的测定。首先用标准蛋白质分布凝胶过滤试验确定分配系数与相对分子首先用标准蛋白质分布凝胶过滤试验确定分配系数与相对分子量关系，推算未知蛋白质相对分子量。量关系，推算未知蛋白质相对分子量。现

19、在学习的是第19页，共63页（1）求出标准蛋白质分子量与洗脱体积的关系）求出标准蛋白质分子量与洗脱体积的关系 标标准蛋白准蛋白质质分子量分子量lgMVe 蓝蓝色葡聚糖色葡聚糖200005.30120 牛血清蛋白牛血清蛋白670004.82637胃蛋白胃蛋白酶酶360004.55644 Cytc130004.11450（2）绘制标准蛋白质分子量与洗脱体积标准曲线图）绘制标准蛋白质分子量与洗脱体积标准曲线图lgMVe（3）根据未知蛋白质洗脱体积求出相对分子量）根据未知蛋白质洗脱体积求出相对分子量现在学习的是第20页，共63页第二节 亲和纯化技术v一、生物亲和作用v二、亲和层析原理v三、亲和层析介质

20、v四、亲和层析分离过程v五、亲和层析柱的再生v六、纯化大分子物质实例 现在学习的是第21页，共63页v亲和结合亲和结合(affinity binding)：通过亲和作用发生的结合称为特异性结合（通过亲和作用发生的结合称为特异性结合（specific binding）或亲和结合）或亲和结合(affinity binding)。v生物亲和作用（生物亲和作用（bioaffinity）：）：生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合的这种特异性相互作用称生物亲和作用与其中某一种分子相结合的这种特异性相互作用称生物亲

21、和作用（bioaffinity）或简称亲和作用）或简称亲和作用(affinity)。v亲和纯化技术（亲和纯化技术（Affinity purification）：）：利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）;亲和层析法（亲和层析法（Affinity chromatography）为代表。）为代表。现在学习的是第22页，共63页一、生物亲和作用v A、静电作用：、静电作用：亲和作用分值对的结合部位上带有相反电荷，产生静电引力。在

22、中性亲和作用分值对的结合部位上带有相反电荷，产生静电引力。在中性PH下，蛋下，蛋白质分子上的谷氨酸、半胱氨酸等酸性氨基酸残基可带负电荷，而精氨酸、赖氨酸、白质分子上的谷氨酸、半胱氨酸等酸性氨基酸残基可带负电荷，而精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸残基可带正电荷。组氨酸等碱性氨基酸残基可带正电荷。v B、氢键：、氢键：亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或氮原子，结合部位之间可以产生氢键作用。亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或氮原子，结合部位之间可以产生氢键作用。v C、疏水性相互作用：、疏水性相互作用：亲和作用分子对的一方分子中含有芳香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位亲和作用分子对的一

23、方分子中含有芳香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位上也含有疏水区，两者之间发生疏水性相互作用。如亮氨酸、甲硫氨酸等氨基酸残基上也含有疏水区，两者之间发生疏水性相互作用。如亮氨酸、甲硫氨酸等氨基酸残基含有碳氢链，苯丙氨酸、色氨酸等含有芳香环。含有碳氢链，苯丙氨酸、色氨酸等含有芳香环。v D、配位键：、配位键：v E、弱共价键：、弱共价键：1、亲和作用的本质、亲和作用的本质现在学习的是第23页，共63页2、生物常见亲和关系、生物常见亲和关系 vA、酶：、酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；vB、抗体：、抗体：抗原、病毒、细胞；抗原、病毒、细胞；

24、vC、激素：、激素：受体蛋白、载体蛋白；受体蛋白、载体蛋白；vD、外源凝集素（、外源凝集素（Lectin）：）：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；vE、核酸：、核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；vF、细胞：、细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。细胞表面特异蛋白、外源凝集素。现在学习的是第24页，共63页3、影响亲和作用的因素、影响亲和作用的因素 v A、离子强度：、离子强度：亲和结合作用源于静电引力，则提高离子强度就会减弱或破坏亲和作用；如亲和结合作用源于静电引力，则提高离子强度就会减

25、弱或破坏亲和作用；如源于疏水性相互作用，则随离子强度提高而增大。源于疏水性相互作用，则随离子强度提高而增大。vB、PH值：值：蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常数（数（pka）不同。）不同。vC、抑制氢键形成的物质：、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成。脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成。vD、温度：、温度：温度升高使分子原子热运动加剧，结合部位的静电作用、氢键及金属配温度升高使分子原子热运动加剧，结合部位的静电作用、氢键及金属配位键将弱。但可使疏水性作用增强。位键将弱。但可使疏水性作用增

26、强。vE、螯合剂：、螯合剂：亲和分子对金属离子形成的配位键，加入亲和分子对金属离子形成的配位键，加入EDTA等螯合剂除去金属离子，等螯合剂除去金属离子，可使亲和结合作用消失。可使亲和结合作用消失。现在学习的是第25页，共63页二、亲和层析原理v 把具有特异亲和力的一对分子的一方作为配基（把具有特异亲和力的一对分子的一方作为配基（ligand），与），与不溶性载体结合，使之固定化，装入层析柱，然后把含有目的物质不溶性载体结合，使之固定化，装入层析柱，然后把含有目的物质的混合物作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的混合物作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入层

27、析柱。混合物中只有能与配基发生结合反应形成络的条件下进入层析柱。混合物中只有能与配基发生结合反应形成络合物的目的物质被吸收，不能发生结合反应的杂质分子则直接流出。合物的目的物质被吸收，不能发生结合反应的杂质分子则直接流出。变换通过层析柱的溶液组成，促使配基与亲合物（目的物）解离，变换通过层析柱的溶液组成，促使配基与亲合物（目的物）解离，即可获得纯化目的产物。即可获得纯化目的产物。现在学习的是第26页，共63页亲和层析操作示意图目标产物杂蛋白现在学习的是第27页，共63页三、亲和层析介质v A、亲和配基：v酶抑制剂：酶抑制剂：生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制生物体内蛋白酶的抑

28、制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性。酶的活性。v抗体：抗体：利用抗体为配基的亲和层析又称免疫亲和层析利用抗体为配基的亲和层析又称免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography），抗原与抗体之间具有高度），抗原与抗体之间具有高度特异性结合能力。特异性结合能力。现在学习的是第28页，共63页v A蛋白（蛋白（protein A）：）：相对分子量相对分子量42KD，与免疫球蛋白，与免疫球蛋白G具有很强的具有很强的亲和作用，亲和作用，1个个A蛋白质分子能与蛋白质分子能与5个个IgG的的Fc片段结合部位结合。不能片段结合部位结合。不能与抗体的抗原结合部位结合。与抗体的抗

29、原结合部位结合。v 凝集素：凝集素：是与糖特异结合的蛋白质（酶和抗体除外），含有两个以上的是与糖特异结合的蛋白质（酶和抗体除外），含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。v辅酶和磷酸腺苷：辅酶和磷酸腺苷：v 三嗪类色素：三嗪类色素：v 过渡金属离子：过渡金属离子：v 肝素：肝素：现在学习的是第29页，共63页B、亲和吸附介质v 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面（孔内），该固体粒子通将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面（孔内），该固体粒子通常称配基的载体（常称配基的载体（carrier support），亲和层析介质又称亲和载体）

30、，亲和层析介质又称亲和载体（affinity carrier,affinity support）。）。v 作为载体的固体粒子应该满足的条件：作为载体的固体粒子应该满足的条件：具有亲水多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；理化稳定性高，具有亲水多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；理化稳定性高，机械强度高，使用寿命长；含可活化的反应基团，用于亲和配体的固机械强度高，使用寿命长；含可活化的反应基团，用于亲和配体的固定化；粒径均一的球形粒子。定化；粒径均一的球形粒子。v合成氢和介质的方法：溴化腈活化法、环氧剂活化法、硅胶活化合成氢和介质的方法：溴化腈活化法、环氧剂活化法、硅胶活化法法现在学习的是第3

31、0页，共63页四、亲和层析分离过程vA、特异性吸附：A、样品开始加到亲和层析柱时，欲分离的样品开始加到亲和层析柱时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；开始大分子物质在柱中的浓度等于零；开始进入柱中时，配体和与分离的大分子物进入柱中时，配体和与分离的大分子物质间相互接触，并形成复合物，也有部质间相互接触，并形成复合物，也有部分复合物分解。分复合物分解。B、样品不断通过柱时，欲分离的大分子物样品不断通过柱时，欲分离的大分子物质与配体形成的复合物浓度越来越大。质与配体形成的复合物浓度越来越大。C、由于配体的存在使欲分离的大分子物质由于配体的存在使欲分离的大分子物质受阻，导致产生紧密的复合带。样品

32、中受阻，导致产生紧密的复合带。样品中有效成分在层析过程是持久逐步递增累有效成分在层析过程是持久逐步递增累积得以分离纯化积得以分离纯化。现在学习的是第31页，共63页 样品中有效成分在层析过程样品中有效成分在层析过程的吸附量，除了与其亲合力的吸附量，除了与其亲合力有密切关系外，还与样品的有密切关系外，还与样品的PH值和离子强度有关。值和离子强度有关。现在学习的是第32页，共63页B、分离大分子物质 样品通过亲和层析柱后，用大量的平衡液即起始缓冲液洗去杂蛋白，样品通过亲和层析柱后，用大量的平衡液即起始缓冲液洗去杂蛋白，也可用不同的缓冲液洗涤，柱上只有专一吸附的大分子物质。也可用不同的缓冲液洗涤，柱

33、上只有专一吸附的大分子物质。洗脱专一吸附大分子物质的条件，要能使复合物完全分离，根据亲洗脱专一吸附大分子物质的条件，要能使复合物完全分离，根据亲合力来决定：合力来决定：亲合力较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟亲合力较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。缓的大分子物质峰。亲和力一般时，主要改变缓冲液的性质（改变亲和力一般时，主要改变缓冲液的性质（改变PH值、离子值、离子强度等），使复合物之间的亲合力下降到足以分离的程度。强度等），使复合物之间的亲合力下降到足以分离的程度。亲合力较强时，用与配体竞争的溶液或用蛋白质变性剂洗脱。亲合力较强时，用与配体竞争的溶液或

34、用蛋白质变性剂洗脱。a、竞争性洗脱剂；竞争性洗脱剂；b、剧烈的洗脱条件（即蛋白质变性）条件。、剧烈的洗脱条件（即蛋白质变性）条件。现在学习的是第33页，共63页五、亲和层析柱的再生v洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，再用平衡缓冲液将层析柱重新平衡。一般亲和层析柱涤柱子，再用平衡缓冲液将层析柱重新平衡。一般亲和层析柱都可反复使用多次。木瓜蛋白酶的亲和吸附剂（甘氨酰甘氨酰都可反复使用多次。木瓜蛋白酶的亲和吸附剂（甘氨酰甘氨酰酪氨酰精氨酸琼脂糖）在酪氨酰精氨酸琼脂糖）在4个月内可使用个月内可使用20次。次。现在学习的是

35、第34页，共63页六、纯化大分子物质实例 v抗体、抗原及其结合物抗体、抗原及其结合物v用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体主要由抗原（纯化抗体）用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体主要由抗原（纯化抗体）、抗体（纯化抗原）和金色葡萄球菌蛋白、抗体（纯化抗原）和金色葡萄球菌蛋白A现在学习的是第35页，共63页第四节 离子交换层析一、离子交换层析的基本原理一、离子交换层析的基本原理二、离子交换剂的分类、性质二、离子交换剂的分类、性质三、离子交换剂与缓冲液的选择三、离子交换剂与缓冲液的选择四、离子交换剂的处理、再生、转型四、离子交换剂的处理、再生、转型五、分离物质的交换五、分离物质的交换六、物质的洗脱与收

36、集六、物质的洗脱与收集七、离子交换层析的应用七、离子交换层析的应用现在学习的是第36页，共63页2、离子交换剂对溶液中离子的结合力：、离子交换剂对溶液中离子的结合力：离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或电荷基团对溶液中离子或离要以离子交换方式进行，或电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行，并都是可逆的。子化合物的吸附作用进行，并都是可逆的。v RA B RB A 现在学习的是第37页，共63页（1）离子交换剂的选择性决定：）离子交换剂的选择性决定：v结合力由平衡常数表示：结合力由平衡常数表示：若溶液中若溶液中A

37、 的摩尔浓度与的摩尔浓度与B相等时，则：相等时，则：v若若K1，即，即RBRA，表示离子交换剂的结合力：，表示离子交换剂的结合力：BA；v若若K1，即，即RBRA，表示离子交换剂的结合力：，表示离子交换剂的结合力：BA；v若若K1，即，即RBRA，表示离子交换剂的结合力：，表示离子交换剂的结合力：BA；现在学习的是第38页，共63页（2）反离子电荷平衡：）反离子电荷平衡：强酸性（阳性）离子交换剂对强酸性（阳性）离子交换剂对H的结合力比对的结合力比对Na的小；弱酸的小；弱酸性离子交换剂相反；性离子交换剂相反；强碱性（阴性）离子交换剂对强碱性（阴性）离子交换剂对OH的结合力比对的结合力比对Cl 的

38、小；的小；弱碱性离子交换剂相反；弱碱性离子交换剂相反；现在学习的是第39页，共63页(3)与水合离子有关：A、与水合离子的电量成正比，而与离子半径的平方成反比。、与水合离子的电量成正比，而与离子半径的平方成反比。B、离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力、离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力也越大。也越大。C、稀溶液中离子发生水化时，各种阴、阳离子结合力大小的排列：、稀溶液中离子发生水化时，各种阴、阳离子结合力大小的排列：一价离子：一价离子：Li+Na+K+Rb+Cs+(对阳离子交换剂对阳离子交换剂)二价离子：二价离子：Mg2+Ca2+Sr

39、2+Ba2+(对阳离子交换剂对阳离子交换剂)一价阴离子：一价阴离子：F Cl Br I (对阴离子交换剂对阴离子交换剂)不同价阳离子：不同价阳离子：Na+Ca2+Al3+Ti4+(对阳离子交换剂对阳离子交换剂)现在学习的是第40页，共63页（4）两性离子的蛋白质、酶类、多肽、核苷酸等物质v 与离子交换剂的结合力主要取决于该物质的理化性质和在与离子交换剂的结合力主要取决于该物质的理化性质和在特定特定PHPH条件下呈的离子状态条件下呈的离子状态:v当当pH低于低于pI时，物质被阳离子交换剂吸附；时，物质被阳离子交换剂吸附；v当当pH高于高于pI时，物质被阴离子交换剂吸附时，物质被阴离子交换剂吸附;

40、v若在相同的若在相同的pH条件下，且条件下，且PI大于大于PH时，时，PI越高，碱性越强就越容易被越高，碱性越强就越容易被阳离子交换剂吸附阳离子交换剂吸附;v对呈胶体状态的大分子物质一般采用选择性好的弱酸性离子交换剂。对呈胶体状态的大分子物质一般采用选择性好的弱酸性离子交换剂。现在学习的是第41页，共63页3、基本原理 离子交换层析（离子交换层析（Ion exchange chromatography,IEC）是）是根据离子交换剂对各种无机离子、有机离子和生命大分子的结合力根据离子交换剂对各种无机离子、有机离子和生命大分子的结合力不同，弱结合力物质先洗脱出，强结合力后洗脱出。不同，弱结合力物质

41、先洗脱出，强结合力后洗脱出。离子交换层析示意图平衡阶段：离子交换剂与反离子结合吸附阶段：样品与反离子交换再生阶段：起始平衡液洗涤解吸附阶段现在学习的是第42页，共63页二、离子交换剂的分类、性质1、分类：根据离子交换剂中基质的组成和性质，可分为两大、分类：根据离子交换剂中基质的组成和性质，可分为两大类：疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂类：疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂（1）疏水性离子交换剂：基质是人工能够合成、与水结合力小的树脂）疏水性离子交换剂：基质是人工能够合成、与水结合力小的树脂物质（苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物），交换树脂引入的电荷基物质（苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物），交换树脂

42、引入的电荷基团不同：团不同：A、阳离子交换剂：电荷基团带负电，反离子带正电。可以与溶液中的、阳离子交换剂：电荷基团带负电，反离子带正电。可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。又可分为强酸型、中强酸型、正电荷化合物或阳离子进行交换反应。又可分为强酸型、中强酸型、弱酸型。弱酸型。现在学习的是第43页，共63页 疏水性离子交换剂因含有大量活性基团、交换容量高、机械疏水性离子交换剂因含有大量活性基团、交换容量高、机械强度大、流动速度快，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、强度大、流动速度快，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质；核苷酸和氨基酸等小分子物质；其次可用于

43、从蛋白质溶液中除去表面活性剂、尿素和两性电其次可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂、尿素和两性电解质或分离不易变性的蛋白质。解质或分离不易变性的蛋白质。B、阴离子交换剂：树脂中分别引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺基团构、阴离子交换剂：树脂中分别引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺基团构成。成。引入季胺、叔胺基团，分别为强、中强阴性离子交换剂；引入季胺、叔胺基团，分别为强、中强阴性离子交换剂；引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。现在学习的是第44页，共63页（2）亲水性离子交换剂：）亲水性离子交换剂：v常用基质有纤维素、交联纤维素、交联葡聚糖和交联琼脂糖。常用基质有

44、纤维素、交联纤维素、交联葡聚糖和交联琼脂糖。vA、纤维素离子交换剂：按引入基团的性质可分为强酸性、弱酸、纤维素离子交换剂：按引入基团的性质可分为强酸性、弱酸性、强碱性、弱碱性离子交换剂。如弱阴离子交换剂性、强碱性、弱碱性离子交换剂。如弱阴离子交换剂DEAEC或或DEADSephacel；vB、交联葡聚糖离子交换剂：以交联葡聚糖、交联葡聚糖离子交换剂：以交联葡聚糖G25和和G50为基质，引入为基质，引入电荷基团制成，有交联葡聚糖阳性和阴性交换剂。对蛋白质和核酸等大分子电荷基团制成，有交联葡聚糖阳性和阴性交换剂。对蛋白质和核酸等大分子有较高的结合量，流速比纤维素离子交换剂快。有较高的结合量，流速比

45、纤维素离子交换剂快。vC、琼脂糖离子交换剂：以交联琼脂糖、琼脂糖离子交换剂：以交联琼脂糖CL-6B（Sepharose CL-6B）等为基质，如）等为基质，如DEAESepharose CL-6B为阴离子交换剂，为阴离子交换剂，CMSepharose CL-6B为阳离子交换剂。为阳离子交换剂。现在学习的是第45页，共63页2、性质：v（1）颜色和形状）颜色和形状v（2）交联度）交联度v（3）吸水量或膨胀度：）吸水量或膨胀度：基质、电荷基团、溶液离子强度和基质、电荷基团、溶液离子强度和PHv（4）交换容量：）交换容量：v（5）稳定剂：）稳定剂：v（6）比重）比重v（7）流速）流速 现在学习的是第

46、46页，共63页三、离子交换剂与缓冲液的选择v1、离子交换剂的选择vA、分离物质带正电荷，选择阳离子交换剂；、分离物质带正电荷，选择阳离子交换剂；vB、分离物质带负电荷，选择阴离子交换剂；、分离物质带负电荷，选择阴离子交换剂；vC、分离物质为两性离子，应根据其在稳定的、分离物质为两性离子，应根据其在稳定的PH范围内范围内所带电荷来选择。所带电荷来选择。如一蛋白质的等电点为如一蛋白质的等电点为5，若该物质在，若该物质在PH58稳定，应选阴离子交换剂，否则稳定，应选阴离子交换剂，否则PH在在5以下稳定以下稳定时，应选择阳离子交换剂。时，应选择阳离子交换剂。v（1）阴、阳离子交换剂的选择）阴、阳离子

47、交换剂的选择（2）强、弱离子交换剂的选择）强、弱离子交换剂的选择v生物样品通常采用弱性离子交换剂。生物样品通常采用弱性离子交换剂。（3）不同离子型交换剂的选择）不同离子型交换剂的选择 取决于离子交换剂对反离子的结合力，一般选择结合取决于离子交换剂对反离子的结合力，一般选择结合力较小的反离子，以便提高交换容量。如强阳性和强阴性力较小的反离子，以便提高交换容量。如强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择离子交换剂应分别选择H型和型和OH型，弱酸性和弱碱性离子型，弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择交换剂应分别选择Na型和型和Cl型。型。（4）不同基质离子型交换剂的选择）不同基质离子型交换剂的选择 在分离生

48、命大分子物质时，一般认为亲水性离子交换剂比在分离生命大分子物质时，一般认为亲水性离子交换剂比疏水性离子交换剂更优越，对大分子物质的吸附和洗脱更温和。疏水性离子交换剂更优越，对大分子物质的吸附和洗脱更温和。现在学习的是第47页，共63页2、缓冲液的选择 选用的起始缓冲液，其选用的起始缓冲液，其PHPH值和离子强度等能使样品中值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合时，交换剂结合时，PHPH值一般比有效成分的值一般比有效成分的PIPI值高一个单位（宜值高一个单位（宜选用阴离子交换剂）或低一个单位（宜选阳离

49、子交换剂），选用阴离子交换剂）或低一个单位（宜选阳离子交换剂），离子强度为离子强度为0.10.1时，很快把有效成分和杂质分开。时，很快把有效成分和杂质分开。选用的洗脱液，离子强度和选用的洗脱液，离子强度和PHPH值应使有效成分从离子交换剂值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般离子强度比起始缓冲液高，上解离下来，一般离子强度比起始缓冲液高，PHPH值是随离子交换值是随离子交换剂性质变化而变化。剂性质变化而变化。现在学习的是第48页，共63页选择缓冲液PH值的简便方法v取取10支支5ml试管，各加入试管，各加入0.1g Sephadex或或1.5ml Sepharose离子交换剂；离子交换剂；

50、v用不同用不同PH值（阴离子交换剂选值（阴离子交换剂选PH59，阳离子交换剂选，阳离子交换剂选PH48）0.5mol/L缓冲液分别洗涤缓冲液分别洗涤10次；次；v用不同对应的用不同对应的PH值值0.05mlo/L(对对Sephadex)或或0.01mol/L(对对Sepharose)缓冲液平衡缓冲液平衡5次（洗涤、平衡离心除去上清体）；次（洗涤、平衡离心除去上清体）；v加等量的待分离样品于各管，缓慢混合加等量的待分离样品于各管，缓慢混合510min，静止沉淀；，静止沉淀；v测定各管有效成分含量，绘制相应图谱，有效成分全部吸附的缓冲液的测定各管有效成分含量，绘制相应图谱，有效成分全部吸附的缓冲液