荧光定量原理与应用第二版.ppt
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1、关于关于荧光定量原理与光定量原理与应用第二版用第二版现在学习的是第1页,共50页提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介定量方法定量方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介:技术简介:现在学习的是第2页,共50页PCRPCR概念概念什么是什么是PCRPCR?Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction(PCR)PCR)聚合酶链反应是在体外选择性聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定的扩增特定DNADNA片段的方法。片段的方法。现在学习的是第3页,共50页Cla
2、ssic PCR现在学习的是第4页,共50页Classic PCR现在学习的是第5页,共50页PCR PCR 循环循环第一步第一步 加热变性、双链打开加热变性、双链打开第二步第二步退火、引物与单链结合退火、引物与单链结合第三步第三步 -引物延伸引物延伸变为两个双链变为两个双链DNADNA现在学习的是第6页,共50页现在学习的是第7页,共50页常规常规PCRPCR常规常规PCRPCR技术:技术:PCR后借助电泳对扩增反应的后借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行定量及进行定量及定定性性分析分析S1 S2 MDNA Engine现在学习的是第8页,共50页提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧
3、光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介 定量方法定量方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介:技术简介:现在学习的是第9页,共50页定量定量PCRPCR定量定量PCRPCR技术:技术:利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个每一个循环扩增产物量的变化循环扩增产物量的变化,通过,通过CtCt值值和标准曲线实现对和标准曲线实现对起起始模板始模板的的定量分析定量分析IQ5 Real-time PCR仪现在学习的是第10页,共50页PCRPCR反应混合物反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTa
4、q DNA多聚酶多聚酶引物引物模板模板DNA或或缓冲液缓冲液荧光物质荧光物质现在学习的是第11页,共50页提纲提纲 PCR PCR简介简介 荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理技术原理 荧光化学物质简介荧光化学物质简介定量方法定量方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介:技术简介:现在学习的是第12页,共50页 SYBR Green 1 TaqMan荧光化学荧光化学现在学习的是第13页,共50页SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green 1SYBR Green 1现在学习的是第14页,共50页SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理
5、 SYBR Green 1SYBR Green 1 结合到双链结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位 SYBR Green 1SYBR Green 1染料结合状态时荧光强度是非结染料结合状态时荧光强度是非结合状态的合状态的800-1000800-1000倍倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA现在学习的是第15页,共50页SYBR Green I现在学习的是第16页,共50页SYBR Green I现在学习的是第17页,共50页SYBR Green I现在学习的是第18页,共50页与传统与传统PCRPCR的比较的比较实现了初始模板的绝对定量实现了初始模板
6、的绝对定量检测灵敏度高检测灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因可以检测到低拷贝的目的基因可以区分微小的拷贝数差异可以区分微小的拷贝数差异可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量省时省力省时省力检测设计灵活检测设计灵活现在学习的是第19页,共50页Melt Curve Analysis现在学习的是第20页,共50页Melt Curve Analysis现在学习的是第21页,共50页SYBR Green I SYBR Green I 优点优点 使用方便使用方便 -不必设计复杂的不必设计复杂的荧光探针荧光探针 没有序列特异性没有序列特异性 -可以用于不同的模板可
7、以用于不同的模板 便宜便宜 灵敏灵敏现在学习的是第22页,共50页SYBR Green I SYBR Green I 缺点缺点 与非特异性产物结合与非特异性产物结合现在学习的是第23页,共50页TaqManTaqMan探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂TaqMan水解型杂交探针水解型杂交探针现在学习的是第24页,共50页TaqManTaqMan 目标特异性探针目标特异性探针 55为荧光素,为荧光素,3 3为淬灭剂为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补与目标序列互补现在学习的是第25页,共50页TAQMAN ProbesTAQMAN Probes现在学习的是第26页,共50页TAQMAN Pro
8、besTAQMAN Probes现在学习的是第27页,共50页TaqManTaqMan优点优点对目标序列有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 -特别适合于特别适合于SNPSNP检测检测现在学习的是第30页,共50页TaqManTaqMan缺点缺点 价格较高价格较高 只适合于一个特定的目标只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析不能进行融解曲线分析 背景高背景高现在学习的是第31页,共50页兼容化学试剂总结兼容化学试剂总结结合于双链结合于双链DNA的小沟的小沟中中发夹型杂交探发夹型杂交探针针水解型杂交探水解型杂交探针(针(5-3外切)外切)延伸延伸复性复性任何任何步骤步骤定量和检测目标基因
9、定量和检测目标基因融解曲线分析融解曲线分析SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因SNP分析分析定量和检测目标基因定量和检测目标基因信号检测信号检测工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂化学试剂化学试剂否否有有有有主要应用范围主要应用范围现在学习的是第32页,共50页荧光曲线荧光曲线 随着随着PCRPCR反应的进行,扩增产物不断累积,荧光信号强反应的进行,扩增产物不断累积,荧光信号强度不断增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,度不断增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,得到一条荧光扩增曲线图得到一条荧光扩增曲线图现在学习的是第33页,共50页定量原理定量原理 如何对起始模板
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