生物制品制造新技术课件.ppt

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1、关于生物制品制造新技术第1页，此课件共71页哦教学目的与要求n掌握基因工程疫苗的原理，了解基因工程疫苗的概念与进展。n了解生物技术诊断制剂，掌握这些生物技术诊断制剂的原理n了解抗体工程的种类。第2页，此课件共71页哦nIntroductionIntroduction疫苗技术的疫苗技术的3 3个阶段：个阶段：n第一次革命：经典的微生物疫苗时代：第一次革命：经典的微生物疫苗时代：1919世纪到世纪到2020世纪世纪n第二次革命：第二次革命：2020世纪世纪7070年代生物技术的出现：重组年代生物技术的出现：重组DNADNA技术为代表的基因工程疫苗时代技术为代表的基因工程疫苗时代n第三次革命：第三次

2、革命：2020世纪世纪9090年代的年代的DNADNA疫苗时代疫苗时代第3页，此课件共71页哦n重组重组DNADNA技术产生基因工程疫苗：技术产生基因工程疫苗：n重重组组亚亚单单位位疫疫苗苗、活活载载体体疫疫苗苗、基基因因缺缺失失疫疫苗苗和和DNADNA疫苗等疫苗；疫苗等疫苗；n生物技术诊断抗原制剂，如基因工程抗原、核酸探生物技术诊断抗原制剂，如基因工程抗原、核酸探针、针、PCRPCR和基因芯片等的制造新技术，和基因芯片等的制造新技术，n抗体工程技术。抗体工程技术。n治疗性疫苗、肿瘤疫苗和生理调控疫苗等。反向治疗性疫苗、肿瘤疫苗和生理调控疫苗等。反向遗传学疫苗研制途径。遗传学疫苗研制途径。第4

3、页，此课件共71页哦第一节、基因工程疫苗第一节、基因工程疫苗 n基因工程疫苗：指用重组DNA技术研制的疫苗。n重组亚单位疫苗、活载体苗、基因缺失疫苗，裸露DNA疫苗等。n新途径，新希望，受到重视。第5页，此课件共71页哦一、重组亚单位疫苗一、重组亚单位疫苗（recombinant subunit vaccines)recombinant subunit vaccines)n用用DNADNA重重组组技技术术，将将编编码码病病原原微微生生物物保保护护性性抗抗原原的的基基因因导导入入原原核核或或真真核核细细胞胞，使使其其在在受受体体细细胞胞中中高高效效表表达达，分分泌泌保保护护性性抗抗原原肽肽链链。

4、提提取取保保护护性性抗抗原原肽肽链链，加加入入佐佐剂剂即即制制成成生生物物制制品品，叫叫基基因因工工程程重组亚单位疫苗。重组亚单位疫苗。第6页，此课件共71页哦原 理选择合适的表达系统PCR扩增保护性抗原的基因重组DNA：把抗原的基因亚克隆到表达载体重组表达质粒导入系统的宿主细胞鉴定和选择表达所需细胞培养繁殖制备疫苗制备疫苗第7页，此课件共71页哦生产重组亚单位疫苗的生产重组亚单位疫苗的表达系统表达系统：n原核表达系统：大肠埃希氏菌（E.coli）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）表达系统。（最常用），其他如：链霉菌基因表达系统等n真核表达系统：如酵母表达系统；昆虫基因表达系统；

5、丝状真菌基因表达系统；哺乳动物细胞表达系统n植物表达系统n参考：基因工程原理。第8页，此课件共71页哦重组亚单位疫苗的重组亚单位疫苗的优点：优点：n安全性好，无感染，可用于不宜使用活疫苗动物，如妊娠动物。安全性好，无感染，可用于不宜使用活疫苗动物，如妊娠动物。n减减少少或或消消除除了了常常规规活活疫疫苗苗或或死死疫疫苗苗难难以以避避免免的的热热原原、变变应应原原、免疫抑制原和其它有害的反应原。免疫抑制原和其它有害的反应原。n稳定性好，便于保存和运输，稳定性好，便于保存和运输，n可可与与感感染染产产生生的的免免疫疫应应答答相相区区别别，适适合合疫疫病病的的控控制制和和消消灭计划。灭计划。成功例案

6、：首次：口蹄疫基因工程亚单位疫苗；人乙型肝炎基因工程亚单位疫苗，广泛应用。预防仔猪和犊牛下痢的大肠杆菌菌毛基因工程重组亚单位疫苗。第9页，此课件共71页哦二、重组活载体疫苗二、重组活载体疫苗（live,vectored vaccines)live,vectored vaccines)定义：用基因工程技术将保护性抗原基因（目的基因）转移到载体中使之表达的活疫苗。分类：重组载体病毒活疫苗、重组载体细菌活疫苗细细菌菌载载体体，沙沙门门氏氏菌菌、大大肠肠杆杆菌菌等等；病病毒毒载载体体：痘痘病病毒毒，腺病毒和疱疹病毒等。腺病毒和疱疹病毒等。n例例子子：国国外外：腺腺病病毒毒为为载载体体的的乙乙肝肝疫疫苗

7、苗、以以疱疱疹疹病病毒为载体的新城疫疫苗等。毒为载体的新城疫疫苗等。n优优点点：活活载载体体疫疫苗苗具具有有传传统统疫疫苗苗的的许许多多优优点点，而而且且又又为为多多价价苗苗和和联联苗苗的的生生产产开开辟辟了了新新路路，是是当当今今与与未未来来疫疫苗苗研研制与开发的主要方向之一。制与开发的主要方向之一。第10页，此课件共71页哦n(非非复复制制性性疫疫苗苗，又称活-死疫苗：与重组活载体疫苗类似，但载体病毒接种后只产生顿挫感染，不能完成复制过程，无排毒的隐患，同时又可表达目的抗原，产生有效的免疫保护。n如用金丝雀痘病毒为载体，表达新城疫病毒HF基因，用于预防鸡的新城疫。)第11页，此课件共71页

8、哦n重组活载体主要包括病毒、细菌，详见表5.1。第12页，此课件共71页哦（一）重组载体病毒活疫苗（一）重组载体病毒活疫苗 病毒载体两种：nA：复制缺陷性载体病毒，只有通过特定转化细胞的互补作用或通过辅助病毒叠加感染才能产生传染性后代；nB：具有复制能力的病毒，如疱疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作为外源基因的载体而保持其传染性。第13页，此课件共71页哦n例子：利用鸡痘病毒为载体，国内外已成功表达了流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、狂犬病病毒、传染性支气管炎病毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美尔球虫等的保护性抗原基因，其中部分产品已正式注册。n图

9、5.1概括了重组病毒活载体构建策略与原理。第14页，此课件共71页哦第15页，此课件共71页哦（二）重组载体细菌活疫苗（二）重组载体细菌活疫苗 优点：细菌载体本身起佐剂作用，刺激产生强的B细胞和T细胞免疫应答。口服沙门氏菌疫苗还能刺激黏膜免疫，如把志贺氏菌、霍乱弧菌和大肠埃希氏菌的抗原基因导入沙门氏菌表达。研究少，涉及细菌多基因，较困难，如 细菌外膜其他结构：黏附分子侵袭蛋白和鞭毛脂多糖等复杂，如 LPS表达涉及30多个基因的级联反应。代表：疫苗株沙门氏菌、李斯特氏菌和卡介苗、痢疾菌等。第16页，此课件共71页哦三、基因缺失疫苗（三、基因缺失疫苗（gene deleted vaccines)g

10、ene deleted vaccines)定义：用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除构建的活疫苗。该 技术策略如下图第17页，此课件共71页哦基因缺失疫苗基因缺失疫苗优点：n安全性好、不易返祖；n免疫力坚实，免疫期长，适于局部接种，诱导产生黏膜免疫力。例子：n如霍乱弧菌苗；n大肠杆菌苗；n伪狂犬病毒基因缺失疫苗第18页，此课件共71页哦四、基因疫苗（四、基因疫苗（genetic vaccines)genetic vaccines)包括DNA疫苗和RNA疫苗，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。基因疫苗研制的基本步骤是：目的基因的分析；选择合适的表达载体；测序确认编

11、码序列；体外转录翻译验证试验；动物试验；结果评价等。顾虑:是否与细胞染色体组整合，抗DNA免疫反应的可能影响；免疫耐受；免疫效力如何进一步提高等。第19页，此课件共71页哦五、多肽疫苗（五、多肽疫苗（peptide vaccines)peptide vaccines)n定义：用用化化学学合合成成法法或或基基因因工工程程手手段段合合成成病病原原微微生生物物的的保保护护性性多多肽肽或或表表位位并并将将其其连连接接到到大大分分子子载载体体上上，再再加入佐剂制成的疫苗。加入佐剂制成的疫苗。n优优点点：可可在在同同一一载载体体上上连连接接多多种种保保护护性性肽肽链链或或多多个个血血清清型型的的保保护护性

12、性抗抗原原肽肽链链，一一次次免免疫疫就就可可防防几几种种传传染病。染病。n例例子子：最最早早报报道道（1982)1982)成成功功的的是是口口蹄蹄疫疫多多肽肽疫疫苗苗，还还有有乙型肝炎和疟疾合成肽疫苗。乙型肝炎和疟疾合成肽疫苗。第20页，此课件共71页哦六、转基因植物疫苗（六、转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine)transgenic plant vaccine)又称为食用疫苗（又称为食用疫苗（edible vaccineedible vaccine）两种表达系统：n整整合合表表达达系系统统，把把编编码码病病原原体体保保护护性性抗抗原原基基因因导导入入植植物物细细胞

13、胞内内，并并整整合合到到植植物物细细胞胞染染色色体体上上，整整合合了了外外源源基基因因的的植植物物细细胞胞在在一一定定条条件件下下生生长长成成新新的的植植株株。这这些些植植株株在在生生长长过过程程中中可可表表达达出出疫疫苗苗抗抗原原，并并把把这这种种性性状状遗遗传传给给子子代代，形形成成表表达达疫疫苗的植物品系。苗的植物品系。n瞬瞬时时表表达达系系统统，利利用用重重组组植植物物病病毒毒为为载载体体，将将编编码码疫疫苗苗抗抗原原的的基基因因插插入入植植物物病病毒毒基基因因组组中中，再再用用此此重重组组病病毒毒感感染染植植物物，抗抗原基因随病毒在植物体内复制、装配并高效表达。原基因随病毒在植物体内

14、复制、装配并高效表达。第21页，此课件共71页哦第二节、生物技术诊断制剂第二节、生物技术诊断制剂包括：1、重组表达抗原(recombinant antigen)2、核酸探针（nucleic acid probe,gene probe）、3、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）4、基因芯片（DNA chip）等。特点：特异性强，可获得常规方法无法制备的一些诊断制剂，易于标准化、产业化。第22页，此课件共71页哦一、重组表达抗原一、重组表达抗原n重重组组表表达达抗抗原原：是是用用DNADNA重重组组技技术术，将将编编码码特特定定抗抗原原的的基基因因插插入入原原

15、核核或或真真核核表表达达质质粒粒，转转入入宿宿主主细细胞胞中中使使其其高高效效表表达达，分分离离纯纯化化产产物物制制造造成成重重组组表达抗原。表达抗原。n优优点点：高高特特异异性性、高高纯纯度度、均均质质性性好好、重重复复性性强强、成成本本较较低低，可可大大批批量量生生产产等等；可可获获得得常常规规方方法法无无法法制制备备的的诊诊断断抗抗原原；也也可可以以获获得得对对人人兽兽共共患患病病特特别别是是高高危危险险病病原原体体（如如免免疫疫缺缺陷陷病病毒毒、结结核核分分枝杆菌、炭疽杆菌等）的诊断抗原枝杆菌、炭疽杆菌等）的诊断抗原。n例例子子：已已制制备备出出标标准准的的乙乙型型肝肝炎炎各各组组分分

16、诊诊断断抗抗原原。发展前景看好。发展前景看好。第23页，此课件共71页哦二、核酸图谱分析二、核酸图谱分析l核核酸酸酶酶切切图图谱谱寡寡核核苷苷酸酸指指纹纹图图谱谱等等。核核酸酸电电泳泳图图谱谱第24页，此课件共71页哦（一）核酸电泳图谱分析（一）核酸电泳图谱分析n指指分分离离纯纯化化的的核核酸酸，因因其其相相对对分分子子质质量量的的差差异异而而在在电电泳泳中中具具有有不不同同的的迁迁移移速速率率并并形形成成不不同同的的带带型型。通通过过带带型型异异同同度度的的分分析可确定生物体间的遗传关系（两种）析可确定生物体间的遗传关系（两种）1 1质质粒粒图图谱谱分分析析：质质粒粒是是耐耐药药性性、毒毒力

17、力因因子子等等特特殊殊遗遗传传特特性性的的载载体体。多多数数细细菌菌往往往往含含有有大大小小和和数数量量不不等等的的质质粒粒，具具有有相相对对稳稳定定性性，质质粒粒图图谱谱分分析析是是细细菌菌分分型型和和流流行行病病学学调调查的重要工具，具有诊断价值。查的重要工具，具有诊断价值。优点：优点：该法简便、特异、快速、可靠，该法简便、特异、快速、可靠，缺缺点点：对对一一些些无无质质粒粒或或质质粒粒不不稳稳定定的的菌菌株株，以以及及质质粒粒相相对对分分子子质质量相同而核苷酸序列不同的菌株无分辨能力。量相同而核苷酸序列不同的菌株无分辨能力。第25页，此课件共71页哦2.RNA2.RNA电泳图谱分析：电泳

18、图谱分析：分节段分节段RNARNA病毒的电泳图谱分析常用。病毒的电泳图谱分析常用。根根据据不不同同RNARNA片片段段相相对对分分子子质质量量具具有有一一定定差差异异，在在PAGEPAGE电电泳泳中中的的迁迁移移速速率率有有所所不不同同，染染色色后后显显示示出出不不同同的的电电泳泳图图谱谱，因因而而可可对对不不同同的的病病毒毒或相同病毒不同毒株的基因组加以分析比较。或相同病毒不同毒株的基因组加以分析比较。第26页，此课件共71页哦（二）核酸酶切图谱分析（二）核酸酶切图谱分析n生生物物的的cDNAcDNA，经经限限制制性性内内切切酶酶切切割割产产生生的的不不同同片片段段，琼琼脂脂糖糖电电泳泳后后

19、可可形形成成不不同同的的带带型型，即即核核酸酸酶酶切切图图谱谱，又又称称DNADNA指指纹纹图谱。图谱。n用用相相同同的的限限制制性性内内切切酶酶消消化化的的DNADNA所所产产生生片片段段的的异异同同程程度度，直直接接反反映映生生物物体体间间的的遗遗传传关关系系。用用不不同同的的限限制制性性内内切切酶酶消消化化DNADNA可分析基因间的连锁关系。可分析基因间的连锁关系。n用用于于比比较较不不同同病病原原体体基基因因组组的的差差异异，了了解解它它们们之之间间遗遗传关系。传关系。n限制性酶切片段长度多态分析（限制性酶切片段长度多态分析（RFLPRFLP）是其中一种。）是其中一种。第27页，此课件

20、共71页哦（三）寡核苷酸指纹图谱分析（三）寡核苷酸指纹图谱分析 将纯化的将纯化的RNARNA经一种特殊的经一种特殊的RNARNA酶（通常为酶（通常为T1T1酶）消酶）消化后，产生许多理化特性和大小不同的寡核苷酸片化后，产生许多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，经聚丙烯酰胺凝胶双相电泳分离后进行放射自段，经聚丙烯酰胺凝胶双相电泳分离后进行放射自显影，形成一类似指纹的图谱，显影，形成一类似指纹的图谱，即寡核苷酸指纹图即寡核苷酸指纹图谱。谱。用于用于 RNARNA病毒的研究，如基因组遗传多样性研究，同病毒的研究，如基因组遗传多样性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、历史演变和宿主类群关一病毒不同毒株的

21、地理分布、历史演变和宿主类群关系的研究，野毒株与疫苗株的比较等。系的研究，野毒株与疫苗株的比较等。第28页，此课件共71页哦三、核酸探针：三、核酸探针：放放射射性性同同位位素素、地地高高辛辛或或生生物物素素等等标标记记核核酸酸分分子子或或其其片片段段的的一一条条链链作作为为核核酸酸探探针针，与与处处理理样样本本中中存存在在的的互互补补链链结结合合为为双双链链，这这个个反反应应就就称称为为核核酸酸杂杂交交或或分子杂交。分子杂交。分为分为DNA-DNADNA-DNA杂交、杂交、DNA-RNADNA-RNA杂交、杂交、RNA-RNARNA-RNA杂交。杂交。n根根据据方方法法不不同同，又又分分为为原

22、原位位杂杂交交和和转转印印杂杂交交。在在转转印印杂杂交交中中，检检测测DNADNA的的称称为为SouthernSouthern杂杂交交，检检测测RNARNA称称为为NorthernNorthern杂交。杂交。n广泛用于特定基因的检测和基因转录活性的研究。广泛用于特定基因的检测和基因转录活性的研究。第29页，此课件共71页哦四、聚合酶链反应（四、聚合酶链反应（PCR)PCR)PCRPCR技技术术是是简简便便、一一快快速速、特特异异、敏敏感感的的检检测测手手段段，适适于于检检测测不不宜宜分分离离培培养养或或含含量量极极微微的的样样品品中病原体，或分析不同样品中基因片段的异同。中病原体，或分析不同样

23、品中基因片段的异同。nPCRPCR与与酶酶切切图图谱谱分分析析和和分分子子杂杂交交技技术术联联合合应应用用可可获得更好的效果。获得更好的效果。n种种类类：如如（RT-PCR)RT-PCR)、荧荧光光PCRPCR、巢巢式式PCRPCR、多多重重PCRPCR、定量、定量PCRPCR等。等。第30页，此课件共71页哦 五、基因芯片nDNADNA芯芯片片（DNA DNA chip),chip),DNADNA微微阵阵列列（DNA DNA microarray)microarray)、寡寡核核苷酸微芯片（苷酸微芯片（oligonucleotide microchip)oligonucleotide mic

24、rochip)n指指将将许许多多特特定定的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段或或基基因因片片段段作作为为探探针针，有有规规律律地地排排列列固固定定于于支支持持物物上上，然然后后与与待待测测的的标标记记样样品品中中的的基基因因按按碱碱基基配配对对原原理理进进行行杂杂交交，再再通通过过激激光光共共聚聚焦焦荧荧光光检检测测系系统统等等对对芯芯片片进进行行扫扫描描，并并配配以以计计算算机机系系统统对对每每一探针上的荧光信号作出比较和检测。一探针上的荧光信号作出比较和检测。第31页，此课件共71页哦n20世纪90年代初，美国Fodor博士提出并研究。n用于基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变与多态性分析、基因

25、组文库作图、疾病的诊断与预测、药物筛选，以及司法与刑侦、环境与食品卫生监督等。六、其它技术核苷酸序列分析、多位点酶电泳等。第32页，此课件共71页哦第三节、第三节、抗体工程技术抗体工程技术多克隆抗体多克隆抗体(Polyclonal antibody)(Polyclonal antibody)一一.概念概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺它是由多种抗原决定簇刺激多株激多株B B细胞增殖分化所产生的细胞增殖分化所产生的,称为多克隆抗称为多克隆抗体。体。第33页，此课件共71页哦二二.多克隆抗体

26、的应用多克隆抗体的应用 免疫学检测免疫学检测 被动免疫治疗和紧急预防被动免疫治疗和紧急预防三三.存在问题存在问题 特异性差特异性差,用于免疫学检测容易出用于免疫学检测容易出现交叉反应现交叉反应 第34页，此课件共71页哦单克隆抗体单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb)(Monoclonal antibody,McAb)一、单抗概念一、单抗概念:通过通过B B细胞杂交瘤技术细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。的细胞克隆，产生均一性的抗体。二、二、B B细胞杂交瘤的类型细胞杂交瘤的类型 小鼠小鼠-小鼠小鼠

27、 大鼠大鼠-大鼠大鼠 小鼠小鼠-人人 人人-人人 n19751975年年KohlerKohler和和MilsteinMilstein建建立立体体外外淋淋巴巴细细胞胞杂杂交交瘤瘤技技术术，19841984年获得诺贝尔生理学和医学奖年获得诺贝尔生理学和医学奖 。第35页，此课件共71页哦三、单抗与多抗区别三、单抗与多抗区别 如图：5.2。第36页，此课件共71页哦四、单抗的制备四、单抗的制备（一）淋巴细胞杂交瘤技术：一）淋巴细胞杂交瘤技术：（lymphocyte hybridoma technology)lymphocyte hybridoma technology)。n将将经经预预定定抗抗原原免

28、免疫疫的的淋淋巴巴细细胞胞与与失失去去次次黄黄嘌嘌呤呤-鸟鸟嘌嘌呤呤磷磷酸酸核核糖糖转转移移酶酶(HGPRT(HGPRT）或或胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷激激酶酶(TK(TK）合合成成能能力力的的骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞系系细细胞胞融融合合，产产生生杂杂交交瘤瘤细细胞胞，经经过过培培养养、筛筛选选或或克克隆隆化化，获获得得既既能能分分泌泌针针对对预预定定抗抗原原的的单单抗抗又又有有无无限限制制增增殖殖能力的杂交瘤细胞系。能力的杂交瘤细胞系。第37页，此课件共71页哦（二）杂交瘤技术的原理杂交瘤技术的原理 1.1.亲本细胞的选择亲本细胞的选择 小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷次黄嘌呤

29、鸟嘌呤磷酸核苷转移酶转移酶 (HGPRT)(HGPRT)缺陷型缺陷型 免疫脾细胞免疫脾细胞:来自来自经抗原免疫的经抗原免疫的BALB/cBALB/c小小鼠的脾脏（鼠的脾脏（B B细胞）细胞）第38页，此课件共71页哦2.2.细胞融合细胞融合骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 脾细胞脾细胞融合后细胞的类型融合后细胞的类型:未融合的脾细胞未融合的脾细胞 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 未融合的瘤细胞未融合的瘤细胞细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞 PEGPEG 第39页，此课件共71页哦3 3 杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞的选择性培养 DNADNA合成的途

30、径：合成的途径：合成的途径：合成的途径：糖糖糖糖+氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸 氨基喋呤氨基喋呤氨基喋呤氨基喋呤 (Aminopterin,A)(Aminopterin,A)TK TK 核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸 DNADNA 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 TMPTMP (Thymidine,T)(Thymidine,T)核苷酸前体核苷酸前体核苷酸前体核苷酸前体 HGPRTHGPRT 次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤 IMPIMP (Hypoxanthine,H)(Hypoxanthine,H)第40页，此课件共71页哦融合后细胞在融合后细胞在HAT培养基中存活情况培养基中存活情

31、况脾细胞（脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）不能长期生长）骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长，不能生长）杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长），能够生长）第41页，此课件共71页哦4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化杂交瘤细胞的筛选和克隆化 筛选：筛选：免疫荧光免疫荧光 ELISA等等 克隆化：克隆化：有限稀释法有限稀释法 单个细胞显微操作法单个细胞显微操作法 软琼脂培养法软琼脂培养法第42页，此课件共71页哦5.5.单克隆抗体的生产单克隆抗体的生产 体内：体内：体内：体内：BALB/cBALB/cBALB/cBALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水小鼠体

32、内诱发含有单抗的腹水小鼠体内诱发含有单抗的腹水小鼠体内诱发含有单抗的腹水 体外：无血清培养基悬浮培养等体外：无血清培养基悬浮培养等6.6.单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法 离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析 A A蛋白蛋白蛋白蛋白-Sepharose-Sepharose亲和层析亲和层析第43页，此课件共71页哦（三）操作步骤见下图：第44页，此课件共71页哦 1.1.B B细细胞胞的的制制备备：纯纯AgAg免免疫疫小小鼠鼠2-32-3次次，间间隔隔2-42-4周周，最最后后一一次次免免疫疫结结束束后后3-43-4天天取取其其脾脾脏

33、脏，制制成成10108 8/mL/mL的脾细胞悬液。的脾细胞悬液。2 2骨髓瘤细胞的制备骨髓瘤细胞的制备：小鼠骨髓瘤细胞，如小鼠骨髓瘤细胞，如SP2/0SP2/0或或NS-1NS-1 具有营养缺陷具有营养缺陷（缺少次黄嘌呤缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），不能在糖转移酶），不能在HATHAT培养基上生长。培养基上生长。在在1010新生犊牛血清的新生犊牛血清的DMEMDMEM中培养至对数生中培养至对数生长期，细胞数达长期，细胞数达10105 5-10-106 6/mL/mL，即可。，即可。第45页，此课件共71页哦3 3饲养细胞准备饲养细胞准备n小鼠胸腺细胞、小鼠腹腔巨噬细胞小鼠

34、胸腺细胞、小鼠腹腔巨噬细胞n作用：减少培养板对杂交瘤细胞的毒性，清除一作用：减少培养板对杂交瘤细胞的毒性，清除一部分死亡的细胞。部分死亡的细胞。n在融合前，将饲养细胞制成所需的浓度加入在融合前，将饲养细胞制成所需的浓度加入培养孔中。培养孔中。第46页，此课件共71页哦4.HAT选择培养基选择培养基nH：次黄嘌呤：次黄嘌呤(hypoxanthine),T：胸腺嘧啶核苷：胸腺嘧啶核苷(thymidine)，T、H是是DNA旁路合成途径的原料；旁路合成途径的原料；n A：氨基喋吟：氨基喋吟(aminopterin)，DNA合成阻断剂。合成阻断剂。n 在在HAT培养基，未融合的骨髓瘤细胞不能生长；培养

35、基，未融合的骨髓瘤细胞不能生长；n 未融合的脾细胞则在未融合的脾细胞则在2周内自然死亡，只有融合的杂交瘤周内自然死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能在培养基中生长。细胞才能在培养基中生长。n（见：（见：HAT培养基筛选杂交瘤细胞示意图）培养基筛选杂交瘤细胞示意图）第47页，此课件共71页哦第48页，此课件共71页哦HATHATHAT培养基筛选原理培养基筛选原理培养基筛选原理培养基筛选原理培养基筛选原理培养基筛选原理H,次黄嘌呤次黄嘌呤;A,氨基喋呤氨基喋呤;T,胸腺嘧啶胸腺嘧啶DNADNA内源性途径内源性途径内源性途径内源性途径(主要途径主要途径主要途径主要途径)谷氨酰胺谷氨酰胺 or单磷酸尿苷酸单

36、磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶AHHT T外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径)(HHypoxanthine ypoxanthine g guznine uznine p phosphohosphor ribosyl ibosyl t transferase)ransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRTHGPRT )胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (TK TK)(T Thymidine hymidine k

37、kinase)inase)B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞：HGPRTHGPRT+，TKTK+骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞：HGPRTHGPRT-，TKTK-杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：HGPRTHGPRT+，TKTK+存活（不可长期存活）存活（不可长期存活）存活（不可长期存活）存活（不可长期存活）死亡死亡死亡死亡外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径)存活存活存活存活第49页，此课件共71页哦5 5细胞融合细胞融合1 1）将）将B B细胞与骨髓瘤细胞以细胞与骨髓瘤细胞以10:1-1:110:1-1:1混合，混合，2 2）离离心心弃弃上上清清，

38、然然后后缓缓慢慢加加融融合合剂剂5050聚聚乙乙二二醇醇(PEG 4000),(PEG 4000),3 3）静置）静置90S90S，渐加入，渐加入HATHAT培养基，培养基，4 4）分分装装培培养养：分分别别加加入入有有饲饲养养细细胞胞的的9696孔孔培培养养板板孔中，置孔中，置5 5-10%-10%COCO2 2培养箱中培养。培养箱中培养。5d5d后后更更换换1/2 1/2 HATHAT培培养养基基，第第10d10d改改用用HTHT培培养养基基，第第15d15d用完全用完全DMEMDMEM培养基。培养基。细胞融合的常用试剂及其配制方法参见表细胞融合的常用试剂及其配制方法参见表5.35.3第5

39、0页，此课件共71页哦第51页，此课件共71页哦6 6杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞筛选 应应用用ELISAELISA、间间接接免免疫疫荧荧光光抗抗体体试试验验检检测测各各孔孔中中的抗体，筛选阳性孔。的抗体，筛选阳性孔。7 7杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化 杂杂交交瘤瘤细细胞胞阳阳性性孔孔，尽尽早早克克隆隆化化。（保保证证单单个个克克隆隆，防防止止染染色色体体丢丢失失，而而丧丧失失分分泌泌抗抗体体的的能能力力 ）,克隆克隆3-53-5次使杂交瘤细胞稳定。次使杂交瘤细胞稳定。n克隆化的方法如下：第52页，此课件共71页哦 (1)(1)有有限限稀稀释释法法:将将阳阳性性孔孔的的细细胞胞稀稀释释成成

40、5-105-10个个细细胞胞/ml/ml，加加入入9696孔孔培培养养板板，0.l 0.l ml/ml/孔孔，每每孔孔约约含含一一个个细细胞胞，每每天天用用倒倒置置显显微微镜镜观观察察确确证证是是一个细胞生长。一个细胞生长。(2)(2)显显微微操操作作法法：用用有有直直角角弯弯头头的的毛毛细细吸吸管管，在在倒倒置置显显微微镜镜下下将将分分散散在在培培养养皿皿上上的的单单个个细细胞胞吸吸入入管管内内，移移种种到到培培养养板板中中，即即可可获获得得单单个个细细胞胞形成的克隆。形成的克隆。第53页，此课件共71页哦(3)(3)软琼脂平板法：软琼脂平板法：在在4545水浴中，将饲养细胞与水浴中，将饲养

41、细胞与0.50.5琼脂糖琼脂糖（用（用DMEMDMEM配制）混合，倒入培养皿凝固后作配制）混合，倒入培养皿凝固后作为底层，后将阳性孔细胞悬于预热至为底层，后将阳性孔细胞悬于预热至4545的的培养基中与等量培养基中与等量0.50.5琼脂糖混合，再加于平琼脂糖混合，再加于平皿内，置培养箱培养，经皿内，置培养箱培养，经1-21-2周后可见小白点，周后可见小白点，即为一个克隆，自软琼脂上吸出移入培养板即为一个克隆，自软琼脂上吸出移入培养板中培养即得单个克隆的杂交瘤细胞。中培养即得单个克隆的杂交瘤细胞。第54页，此课件共71页哦8 8杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞的冻存 原原始始克克隆隆、克克隆隆化化后后的

42、的杂杂交交瘤瘤细细胞胞，加加DMSODMSO，分装于小安瓶内保存于液氮中。分装于小安瓶内保存于液氮中。9 9单抗的生产方法单抗的生产方法 (1)(1)动动物物体体内内生生产产系系统统：BALB/cBALB/c小小鼠鼠体体内内诱诱发含有单抗的腹水；发含有单抗的腹水；(2)(2)细胞培养生产系统：无血清培养基悬浮细胞培养生产系统：无血清培养基悬浮培养等。培养等。10.10.单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法 离子交换层析离子交换层析 A A蛋白蛋白-Sepharose-Sepharose亲和层析亲和层析第55页，此课件共71页哦（一）用作诊断试剂（一）用作诊断试剂 1.1.

43、检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。2.2.鉴定病原体，准确诊断传染病。鉴定病原体，准确诊断传染病。3.3.用于肿瘤的诊断和分型用于肿瘤的诊断和分型 4.4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态分泌的功能状态 五、单克隆抗体的应用五、单克隆抗体的应用（医学上的应用）（医学上的应用）第56页，此课件共71页哦（二）用作研究工具（二）用作研究工具1.1.纯化抗原纯化抗原2.2.分析和探查抗原结构分析和探查抗原结构3.3.分析抗原决定簇分子的功能分析抗原决

44、定簇分子的功能4.4.（三）用于疾病的治疗（三）用于疾病的治疗5.5.抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治的防治6.6.抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗疗7.7.抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗第57页，此课件共71页哦单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题1.1.单克隆抗体的特异性单克隆抗体的特异性2.2.2.2.由于肿瘤特异性抗原较少，缺由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应常组织有交叉反应

45、2.2.异种抗体反应异种抗体反应3.3.鼠源性单抗用于人体，导致鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应异源性超敏反应第58页，此课件共71页哦一、概念：一、概念：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。型抗体。基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody)第59页，此课件共71页哦二、制备过程：二、制备过程：a、获得抗体基因片段b、将抗体基因片段导入真核细胞（如杂

46、交瘤细胞）或原核细胞（如大肠杆菌），使之表达有免疫活性的抗体片段。n主主要要包包括括：嵌嵌合合抗抗体体、单单链链抗抗体体、重构抗体、人人源源化化抗抗体体、IgIg相相关关分分子子、噬噬菌菌体体抗抗体、（抗体文库。）体、（抗体文库。）第60页，此课件共71页哦三、几种重要的抗体三、几种重要的抗体（一）嵌合抗体（一）嵌合抗体（chimeric antibody)chimeric antibody)n指指在在同同一一抗抗体体分分子子中中含含有有不不同同种种属属来来源源抗抗体体片片段段的的抗抗体体，又又称称杂杂种种抗抗体体。多多为为“鼠鼠-人人”类类型型，既既抗抗体体的的FabFab或或F(ab)2F

47、(ab)2来来源源于于鼠鼠类类，而而FcFc片片段来源于人类。减少了抗体中的鼠源性成分。段来源于人类。减少了抗体中的鼠源性成分。第61页，此课件共71页哦（二）重构抗体（二）重构抗体（reshaping antibody)reshaping antibody)n将将鼠鼠抗抗体体的的超超变变区区基基因因嵌嵌入入人人抗抗体体FabFab骨骨架架区区的的编编码码基基因因中中，再再将将此此DNADNA片片段段与与人人IgIg恒恒定定区区基基因因相相连连，然然后后转转染染杂杂交交瘤瘤细细胞胞，使使之之表表达达嵌嵌合合的的V V区抗体。区抗体。n（即在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列）（即在

48、人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列）第62页，此课件共71页哦（三）单链抗体（三）单链抗体（single-chain antibody)single-chain antibody)即即FVFV分分子子或或单单链链抗抗体体蛋蛋白白：由由VLVL区区氨氨基基酸酸序序列列与与VHVH区区氨氨基基酸酸序序列列经经肽肽连连接接物物（linkerlinker）连连接接而而成成。（此此外外肽肽连连接接物物还还可可将将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。）药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。）相相对对分分子子质质量量小小，作作为为外外源源性性蛋蛋白白的的免免疫疫原原性性较较低低；在在血血清

49、清中中比比完完整整的的单单克克隆隆抗抗体体或或F F(ab)(ab)2 2片片段段能能更更快快地地被被清清除除；无无FcFc片片段段，体体内内应应用用时时可可避避免免非非特特异异性性杀杀伤伤；能能进进入入实实体体瘤瘤周周围的微循环等优点。围的微循环等优点。第63页，此课件共71页哦（四）（四）IgIg相关分子相关分子n将将抗抗体体分分子子的的部部分分片片段段（如如V V区区或或C C区区）连连接接到到与与抗抗体体无无关的序列上（如毒素），制成关的序列上（如毒素），制成IgIg相关分子。相关分子。n例例如如将将有有治治疗疗作作用用的的毒毒素素或或化化疗疗药药物物取取代代抗抗体体的的FcFc片片段

50、段，通通过过高高变变区区结结合合特特异异性性抗抗原原，连连接接上上的的毒毒素素可可直直接接运运送送到到靶靶细胞表面，起细胞表面，起“生物导弹生物导弹”的作用。的作用。nByrnByrn的的“CD4CD4免免疫疫黏黏附附素素”将将CD4CD4基基因因与与IgG1 IgG1 C C区区在在体体外外重重组组而而表表达达出出的的IgIg相相关关分分子子，可可封封闭闭人人HIV HIV gp120gp120蛋蛋白白与与CD4+TCD4+T细胞的结合，治疗艾滋病上具有潜在价值。细胞的结合，治疗艾滋病上具有潜在价值。第64页，此课件共71页哦（五）噬菌体抗体（五）噬菌体抗体 （phage antibody)