应激障碍能恢复吗 电针对慢性情绪应激焦虑模型的代谢组学研究.docx

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1、应激障碍能恢复吗 电针对慢性情绪应激焦虑模型的代谢组学研究 摘要 目的：视察电针作用后，慢性心情应激焦虑模型大鼠血浆核磁共振氢谱(Hydro-Nuclear Magnetic resonance,1H NMR)的改变，并结合模式识别方法进行分析，从代谢组学的角度探讨电针防治慢性心情应激的机制。方法：采纳不行预知的心情应激刺激方法，建立慢性心情应激焦虑模型。电针百会、三阴交，治疗21d，采纳1H NMR检测血浆代谢谱并用正交信号校正-主成分分析（Orthogonal Signal Correction- Principal Components Analysis，OSC-PCA）判别代谢产物的改

2、变。结果：与比照组相比，模型组样本中3-羟基丁酯、血糖、乳酸、O-乙酰基糖蛋白等物质含量上升；氧化三甲胺、丙氨酸、血脂、牛磺酸、N-乙酰基糖蛋白等物质含量降低。与模型组相比，模针组中血糖、极低密度脂蛋白含量明显降低；不饱和脂肪酸、磷脂酰胆碱等代谢物含量上升。结论：各组大鼠血浆1H NMR代谢谱之间存在差异，电针能明显影响慢性心情应激焦虑模型大鼠的代谢产物。 关键词 慢性心情应激焦虑 电针 代谢组学 核磁共振 大鼠 基金项目：四川省教化厅资助项目电针抗慢性应激性海马损伤的代谢组学探讨，编号：200ZD014；成都中医药高校校基金资助项目安神针法对CES焦虑大鼠的作用探讨，编号：ZRZD20050

3、2代谢组学是继基因组学、蛋白质组学等之后发展起来的以探讨机体整体代谢状态为目标的新方法，其主要特点是利用核磁共振等获得生物体内小分子代谢物的丰富信息，通过模式识别等化学计量学和多元统计分析方法对生物体代谢信息进行动态、系统的测量和分析，并联系生物体内的病理生理改变，确定导致这些代谢变更的靶器官和作用位点，找寻相关的生物标记物，达到相识机体反应过程的目的1-2。 临床探讨表明，电针治疗焦虑障碍有其独特优势，疗效确定3-4，但电针拮抗焦虑的作用机理尚待探讨。最近，国内外学者采纳代谢组学方法比较探讨了急慢性应激对动物血浆代谢物的影响，从整体代谢的全新角度为探讨抑郁症、焦虑障碍等难治性疾病供应了又一新

4、的思路5-7。本探讨将采纳代谢组学技术初步探讨电针对慢性心情应激焦虑模型的治疗机理，以期从体内代谢的角度为针灸防治慢性心情应激供应部分试验依据。 1 材料与方法 11 试验动物及分组：SD雄性大鼠30只，体重20020g（四川省医学科学院试验动物探讨所，合格证号：No.0005328）。动物于室温232、湿度70%80%、正常明暗周期的宁静环境中适应性驯养7d，然后按体重随机分为空白组，模型组，模型+针灸治疗组（简称模针组），每组10只。 12 建模方法：采纳不行预知的慢性心情应激方法(Chronic Emotional Stress，CES)构建大鼠模型，依据文献3方法改进：用SPSS115

5、统计软件包对9种刺激方式（包括电击足底、禁水、禁食、24h光照、24h黑暗、两笼混为一笼、单笼、倾斜、从两笼各抓两只混笼等）随机安排，每天支配1种方式刺激大鼠，连续刺激21d。 13 电针治疗：模针组大鼠每天15:00进行固定，暴露头部及四肢，针刺百会、三阴交穴(参照试验针灸学的动物穴位图谱，以比较解剖的骨度分寸法为依据模拟定位。百会：顶骨正中点，向后平刺510mm；三阴交：后肢内踝尖直上5mm处，直刺510mm，左右两侧交替取穴)。针柄接电针仪G6805型，选用疏密波，频率2Hz/100Hz。每天1次，每次15min，连续治疗21d。空白组和模型组除每天15:00进行与模针组相同的固定外，不

6、做其它任何处理。 14 样品采集及预处理：针刺治疗21d后，各组大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后股动脉取血，肝素抗凝获得血浆，每组随机选取6个样本进行检测。在200L血浆中加入400L09%NaCl重水溶剂(北京巨化工科贸有限责任公司)，4，11000转/分转速离心15min，取550L上清液，加入含有50L浓度为01%的2,2,3,3,三甲基甲硅烷基丙酸3-(trimethylsiyl)2,2,3,3-2H4propionate,TSP(加拿大默克公司)重水溶液的核磁样品管（=5mm）中，Varian UNITY INOVA 600M超导脉冲傅立叶变换核磁共振仪检测。 15 1H NMR数据采集：

7、调用驰豫时间编辑（Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG）视察小分子代谢产物信号，扩散编辑试验（Longitudinal Eeddy-Delay, LED）观测大分子信号。CPMG试验取如下参数：谱宽8000Hz，采样点数32k，累加次数128次，饱和时间2s，谱仪偏置设置在水峰位置，饱和模式设为ynn。LED试验的主要参数为：扩散时间01s，脉冲梯度复原时间00003s，累加次数64次，饱和延迟时间为2s，饱和模式为ynynn。上述试验经1H NMR采样后得到自由感应衰减（Free Induction Decay,FID）信号，将该信号进行权重傅立叶变换，以TSP为化学

8、位移参考峰，并设此为0ppm。用VNMR软件将所得谱图进行基线校正和相位调整，从0595ppm（每段004）分段积分，所得的数据归一化处理后，输出至Office Excel文件中储存。 16 NMR数据的统计分析：上述积分值进行预处理后，用SIMCA-P100软件包（Umetrics AB,Ume，Sweden）进行主成分分析（principal component analysis,PCA），并进行正交信号校正（Orthogonal Signal Correction,OSC）处理，以解除干扰因素。 2 结果 21 1H NMR谱图结果：CPMG_NMR特征谱及主要谱峰指认见图1，LED_N

9、MR特征谱及主要谱峰指认见图2。 图1 各组大鼠尿样的600 MHz1HNMR的CPMG结果 2 各组大鼠尿样的600 MHz NMR氢谱的LED结果22 CPMG试验的OSC-PCA分析结果：CPMG的OSC-PCA分析结果表明，比照组、模型组和模针组在第一主成分（PC1）和其次主成分（PC2）上就能够明显区分开来（图3a），积分值集中分布于散点图的3个区域，并且三个组没有交叉和重叠，表明各组动物的代谢产物有较大差别。对应的因子载荷图（图3b）显示，大多数物质没有明显变更（主要集中在原点旁边），只有少数物质发生了明显的改变（远离原点分布）。详细结果为：与比照组相比，模型组样本中3-羟基丁酯（

10、118ppm）、血糖（34ppm）、乳酸（41ppm）以及部分氨基酸等小分子明显上升；三甲基氧胺（TMAO，326ppm），丙氨酸（144ppm），血脂（092ppm，136ppm）等含量降低（图3b及表1）。与模型组相比，模针组中血糖（34ppm）降低（图3b）。 图3 各组大鼠代谢产物CPMG试验的OSC-PCA得分图（a）和对应的因子载荷图（b） 23 LED试验的OSC-PCA分析结果：LED结果显示，与CPMG试验结果类似，各组在PC1和PC2上就能得到明显区分，积分值互不重叠。与比照组相比，模型组样本中O-乙酰基糖蛋白（OAC，223ppm）、-CH2（159ppm）、(CH2)n

11、（139、127ppm）、CH3-(CH2)n（131、135ppm）等代谢物质的含量明显上升，而牛磺酸（363、367ppm）、N-乙酰基糖蛋白（NAC，215ppm）、-CH2-CH2-C=O（207ppm）等代谢物质降低（表2）。与模型组相比，模针组(CH2)n（127ppm）和不饱和脂肪酸的脂肪链部分（203ppm），甘油三酯和不饱和脂肪酸的双键氢部分（531ppm），磷脂酰胆碱（323ppm）等代谢物上升；而极低密度脂蛋白的长链部分（135ppm、131ppm、139ppm、219ppm）等代谢物含量降低（表2）。表明模型组存在严峻的脂代谢紊乱，而电针疗法具有较显著的调整作用，使极低

12、密度脂蛋白降低，不饱和脂肪酸等上升。 3 探讨 代谢组学的主要探讨工具之一是1H NMR。 1H NMR分析物质中的每一个氢原子都有其对应的谱峰，其信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量，形成具有特征性的代谢指纹图谱。为充分提取NMR技术所获得数据中的潜在信息，须要采纳化学计量学和多元统计方法对数据进行分析，目前主要集中在模式识别（pattern recognition，PR）的分析（principal components analysis,PCA）上。PCA可以实现对数据的可视化和样本的分类聚集，揭示原始数据的特征8-9。与PCA得分图对应的因子载荷图能够反映导致类别间差异的主要元素。此

13、外，采纳正交信号校正技术能滤掉与类别推断不相关（即正交）的变量信息，只保留与类别推断有关的变量和信息，以降低样本的不均一性10。本探讨采纳OSC进行滤噪后，各组在第一主成分和其次主成分上的积分值散点图呈聚类分布，未见重叠和交叉，为进一步分析不同试验处理措施对大鼠代谢物的影响供应了便利。 本探讨结果表明正常组、模型组和模针组之间存在代谢产物谱的显著差异，造成模型组和比照组区分的主要因素是前者样本中含有较高的3-羟基丁酯、血糖、乳酸、O-乙酰基糖蛋白等物质，而氧化三甲胺、丙氨酸、血脂、牛磺酸、N-乙酰基糖蛋白等含量则降低，说明模型组大鼠糖类、脂类以及神经递质代谢出现了紊乱。电针通过提高不饱和脂肪酸

14、、磷脂酰胆碱等物质的含量，降低血糖和极低密度脂蛋白的含量调整代谢平衡，这与Paige等5对抑郁症患者不同缓解期以及Claire等6对急、慢性应激模型动物的探讨结果类似。 传统中医理论认为，慢性心情应激所导致的焦虑障碍是中医肝肾阴虚范畴的疾病，气机郁滞，运行不畅是其基本病机，该病的发生与肝功能亲密相关，本试验选择百会、三阴交这两个临床上治疗焦虑障碍的主要腧穴进行针刺，主要目的是疏通经络，调神冷静，滋阴养血、调补肝肾，前期探讨显示疗效明显11。本探讨初步揭示电针有可能从改善能量代谢和神经递质代谢的角度，防治慢性心情应激。结合罗和古等7的探讨结果，笔者推想针灸可能通过影响能量以及神经递质代谢通路起到

15、综合调整作用。 4 参考文献 1Rochfort S. Metabolomics review: a new “omics” platform technology for systems biology and implications for natural products researchJ. J Nat Prod.2005，68(12):1813-1820. 2Serkova NJ, Niemann CU. Pattern recognition and biomarker validation using quantitative 1H-NMR-based metabolomics

16、J. Expert Rev Mol Diagn,2006,6(5): 717- 731. 3海日罕,陈惜贞,静进.电针治疗对广泛性焦虑障碍患者特性特征与行为模式的影响J.中国针灸，2004,24(3):165-166. 4王志凌,李育红,林虹.针刺治疗广泛性焦虑临床视察J.天津中医药,2005,22(1):44-45. 5Paige LA, Mitchell MW, Krishnan KR,et al.A preliminary metabolomic analysis of older adults with and without depressionJ.Int J Geriatr Psy

17、chiatry,2007,22(5):418-423. 6Claire RT,Firdaus SD,Richard HB,et al.Metabonomic Studies on the Physiological Effects of Acute and Chronic Psychological Stress in Sprague-Dawley RatsJ.Journal of Proteome Research,2007,6(6):2080-2093. 7罗和古,丁杰,岳广欣,等.大鼠肝郁脾虚证的代谢组学探讨J.中西医结合学报,2007，5（3）：307-316. 8Lindon J C

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19、10Beckwith-Hall BM,Brindle JT,Barton RH,et al.Application of orthogonal signal correction to minimise the effects of physical and biological variation in high resolution 1H NMR spectra of biofluidsJ.Analyst,2002,127(10):1283-1288. 11徐海洋,周奇志,王薇,等.电针对慢性心情应激焦虑模型大鼠行为学影响的探讨J.四川中医,2007,25(5):97-99. 收稿日期 2008-06-10