中药化学试验技术1说课讲解.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。中药化学试验技术1-第一章绪论第一节中药化学研究成果及应用第二节中药化学成分的预试验系统预试法应用一些简单的定性试验，对中药中所含各类化学成分作全面检查。单项预试法根据需要，有重点的检查某类成分或某药效成分。方法：试管反应+薄层层析检查一、 预试溶液的制备1、 水提取液糖、多糖、有机酸、皂苷、酚类、鞣质、氨基酸、多肽、蛋白质2、 乙醇提取液酚类、鞣质、有机酸、香豆素、强心苷、黄酮、蒽醌、甾体3、 5%HCl-乙醇提取液生物碱4、 石油醚提取液甾体、萜类、脂肪油二、 各类成分的检查1、 生物碱（1）沉淀反

2、应碘化汞钾试剂白色或浅黄色沉淀碘化铋钾试剂橘红色沉淀碘碘化钾试剂浅棕或暗棕色沉淀硅钨酸试剂浅黄或黄棕色沉淀磷钨酸试剂浅黄色沉淀磷钼酸试剂白色或淡黄色沉淀苦味酸试剂黄色结晶或非结晶形沉淀鞣酸试剂棕黄色沉淀氯化金试剂黄色结晶氯化铂试剂白色结晶雷氏铵盐红色无定形沉淀（2）薄层层析检查：吸附剂碱性氧化铝（级，干法铺板）硅胶G（稀碱湿法铺板）展开剂氯仿：甲醇2、 显色UV；碘化铋钾氨基酸、多肽、蛋白质（1）加热沉淀试验：加热煮沸混浊或沉淀（蛋白质）+5%H2SO4（不加热）混浊或沉淀（2）双缩脲反应：+40%NaOH，1%CuSO4紫色、红色或紫红色（多肽、蛋白质）（3）茚三酮反应：+0.2%茚三酮试液

3、蓝或蓝紫色（氨基酸、多肽、蛋白质）（4）吲哚醌反应：+吲哚醌试液各种颜色（氨基酸）（5）Millon反应：+Hg，H2NO2红色（蛋白质分子中有酪氨酸组成）（6）Hopkins-Cole反应：+乙醛酸，浓硫酸各色（蛋白质分子中有色氨酸组成）（7）氨基酸的薄层层析检查：吸附剂硅胶G展开剂n-BuOH，n-BuOH：HAc：H2O显色剂0.25%茚三酮试液紫红色斑点3、 有机酸（1）PH试纸检查（2）溴酚兰试液：喷洒蓝色背景黄色斑点（3）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或酸性氧化铝展开剂C6H6：EtOH显色剂0.1%溴酚兰试液黄色4、 酚类和鞣质（1）FeCl3试剂：+1%FeCl3试液蓝、暗绿或蓝紫

4、色（2）三氯化铁-铁氰化钾试剂：喷洒蓝色斑点（3）香草醛-盐酸试剂：喷洒红色（间苯二酚、间苯三酚）（4）重氮盐试剂：+对硝基苯胺、亚硝酸钠红色（5）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或纤维素展开剂n-BuOH：HAc：H2O；15%HAc显色剂1%FeCl3试液1%三氯化铁-1%铁氰化钾试液蓝、绿或黑色鞣质与酚类的区别：+明胶沉淀上清液+1%FeCl3试液蓝、暗绿或蓝紫色5、 糖和苷（1）斐林试剂：+硫酸铜、酒石酸钾钠砖红色沉淀（还原糖）（）+1%HCl+NaOH沉淀（苷元）30min上清液（+）（多糖、苷）（2）Molish反应：+-萘酚-浓硫酸紫红色环（3）银镜反应：+0.1N硝酸银、5N氨水银褐

5、色（还原糖）（4）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或纤维素展开剂n-BuOH：Pd：H2O；15%HAc显色剂苯胺-邻苯二甲酸6、 皂苷（1）泡末试验：振摇大量持续性泡末+0.1MHCl二管泡末高度相同（三萜皂苷）+0.1MNaOH碱管高于酸管（甾体皂苷）（2）溶血试验：+2%红血球悬浮液溶血（3）LiebermanBurchard反应：+醋酐-浓硫酸紫红色（三萜皂苷）黄-红-紫-污绿（甾体皂苷）7、甾体（1）LiebermanBurchard反应：+醋酐-浓硫酸黄-红-紫-污绿（2）氯仿-浓硫酸反应：+氯仿-浓硫酸氯仿层红或青色硫酸层绿色荧光（3）五氯化锑或三氯化锑反应：+SbCl3或SbCl5红

6、色（4）薄层层析检查：吸附剂中性氧化铝或硅胶G展开剂C6H6-MeOH；CHCl3-MeOH显色剂10%磷钼酸蓝-蓝紫色5%三氯化锑试液红、棕红或绿色8、黄酮（1）盐酸-镁粉反应：+HCl-Mg红色（2）三氯化铝反应：+AlCl3黄色（3）浓氨水反应：+NH3亮黄或橙色（4）薄层层析检查：吸附剂聚酰胺或硅胶G展开剂MeOH-H2O；EtOH-H2O显色剂UV亮黄或黄绿色荧光1%三氯化铝试液亮黄色9、香豆素、内酯（1）开闭环反应：+1%NaOH澄清+2%HCl混浊（2）异羟污酸铁反应：+7%盐酸羟胺、10%KOH+稀HCl、1%FeCl3红色（3）重氮盐试剂：+对硝基苯胺、亚硝酸钠红色（4）薄层

7、层析检查：吸附剂酸性硅胶G或硅胶G或酸性氧化铝展开剂甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5：4：1）显色剂UV蓝色荧光异羟污酸铁试液红色10、强心苷（1）Kedde试剂：+3，5-二硝基苯甲酸试液紫红色（2）Baljet试剂：+碱性苦味酸试液橙或橙红色（3）Legal试剂：+亚硝酰铁氰化钠试液紫红色（4）K-K反应：+FeCl3/冰HAc、浓H2SO4上层绿蓝色（2-去氧糖）界面红棕色（5）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或中性氧化铝展开剂n-BuOH：HAc：H2O（4：1：5）显色剂碱性3，5-二硝基苯甲酸试液紫红色碱性苦味酸试液橙红色11、蒽醌（1）碱液反应：+10%NaOH红色+H2O2红色不褪+H+红色

8、褪去（2）醋酸镁反应：+1%MgAc2红色（3）薄层层析检查：吸附剂硅胶G展开剂Pet：EtOAc显色剂UV黄色荧光5%NaOH红色12、挥发油、油脂（1）油斑检查：油斑挥发挥发油；油斑不消失油脂或类脂（2）磷钼酸反应：喷洒5%磷钼酸试液蓝色（油脂、三萜、甾醇）第二章化合物结构与溶解性中药中的化学成分十分复杂，一味中药中有少则几十种，多则几百种成分。要对这些成分进行结构及活性等方面的研究，就必须首先进行提取及分离。提取就是用适当的溶剂将中药中的化学成分从组织细胞中溶解出来。提取是分离的前提，正确的提取方法及正确的提取溶剂，对分得单体化合物非常关键。尤其在近代，随着中药研究的增多，中药中含量较多

9、成分的越来越少，越来越多的是含量越来越微成分的中药。如若提取方法不当，则根本提不出中药中的微量成分。需提取化合物的结构特性，是选择提取方法及提取溶剂的依据。一般需通过预试验或查阅有关资料来了解，而化合物的极性大小与溶解性密切相关。注意：a、原植物品种鉴定b、热不稳定化合物，避免高温下操作。如蛋白质、环烯醚萜类酸、碱不稳定化合物，避免强酸、强碱下操作。如香豆素易氧化化合物，避免提取时间过长，避光。如Vc、延胡索乙素c、对未知成分，应综合考虑以上因素。一、 化合物结构与极性化合物极性大小分类是相对概念，没有固定的概念。极性大小在提取分离工作中常成为向导。判断依据：a、极性基团与非极性基团的性质与数

10、量，多则大。b、分子体积大小。基团一样，分子大，极性小。极性基团：-COOH、OH、NH2中等极性基团：OR、COOR非极性基团：烷基eg：glc环己烷苯甲酸苯酚环黄芪皂醇4个-OH，分子大，为非极性物质黄芪皂苷甲中等极性物质：难溶于H20可溶于EtOH、MeOH、BuOH注意：酸性基团（-COOH、ph-OH）+OH-极性物质（成盐）碱性基团（N-）+H+极性物质（成盐）极性大小还与氢键极性变小二、 立体效应有关各种溶剂的性质化学成分在各种溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。极性溶剂H2O溶剂中等极性溶剂（亲水性有机溶剂）EtOH、MeOH、甲丁醇、Me2CO非极性溶剂（亲脂性有机溶剂）Et2

11、O、CHCl3、C6H6、Pet、己烷1、水优点：价廉，易得，极性大（分子小、含O），无毒，易进植物细胞缺点：专属性差，特别是复方蒸馏水或重蒸水中性自来水pH562、亲水性有机溶剂：甲、乙、丙、异丙、丁醇，丙酮极性基团：OH、C=0（偶极矩大），分子小甲丙醇与水互溶丁、戊醇与水混溶互饱和后分层，有OH，但分子大（非极性部分增大）丙酮即亲水，又亲脂优点：较价廉，毒性较小，易进入植物细胞缺点：专属性差3、亲脂性有机溶剂只含C、H：Pet、C6H6、正己烷、环己烷极性小氯代烃：CCl4、CHCl3、CH2Cl2含C、H、O：EtOAc（酯基）、Et2O（醚基）大不溶于水或难溶于水优点：专属性强，挥发

12、性大，易挥收缺点：易燃（除CHCl3外），毒性较大，价贵，设备要求高，较难进入细胞多用于分离纯化。极性排列：PetC6H6CHCl3Et2OEtOAcn-BuOHMe2COEtOHMeOHH2O4、各种溶剂性能（P56）三、化合物极性与溶解性如何了解极性预试验层析正相：Rf大，极性小；Rf小，极性大葡萄糖、蔗糖水、醇淀粉、多糖（OH多，但分子大）热水蛋白质酸碱二性溶于水难溶于亲脂性溶剂氨基酸溶于水、醇苷类水（含糖）苷元非水、亲脂游离生物碱非水（大多）、亲脂+H+季铵、NO物水极性分子，溶于水大多遵循“相似相溶”的原则，但也是相对而言。四、提取原理及影响因素1、 原理过程：溶剂组织细胞溶解可溶物

13、溶液（提取液）原理：浸湿溶解扩散（1）浸湿：溶剂附于中药粉末表面使之湿润，再通过毛细管和细胞间隙渗入细胞内。能否附着于粉末，取决于溶剂和植物二方面性质非极性溶剂难进入含水植物粉末水难进入油脂性植物粉末，需先脱脂，如种子。（2）溶解：不同溶剂，溶解对象不一。（3）扩散：溶液渗透压增高，高浓度溶液向四周扩散，至细胞内外达平衡，达饱和。保持良好的浓度差是提高提取浸出效果关键用渗透、连续回流，或定时换溶剂2、 影响因素（1）粉碎度细接触面大，效果好，但过细药粉吸附力增强同时大量细胞破坏，溶出成分（2）温度高溶剂分子运动加快，增加溶解扩散过程，效果好但防止受热易破坏成分被破坏。（3）时间长提出多，过长无

14、必要，搅拌可缩短时间（4）提取溶剂（关键）选择不当，可一无所获。如若对所替成分不了解，首选乙醇或水。（5）pH值水pH小提碱性成分pH大提酸性成分非极性溶剂pH小提酸性成分：酚、酸pH大提碱性成分：生物碱五、常用提取溶剂1、 水优点：价廉、易得，无药理作用，渗透性强缺点：鞣质、多糖、蛋白质大量溶出，后处理过滤、浓缩困难，易发霉有热水、冷水、酸水、碱水2、 乙醇优点：可溶出大多数成分，不发霉（20%），易回收mp78.8缺点：易燃，禁直火95%EtOH生物碱、挥发油6070%EtOH皂苷、黄酮苷、蒽醌苷4050%EtOH强心苷、鞣质50%EtOH生物碱盐3、丙酮优点：即亲水，又亲脂对极性小的成分

15、也可溶解mp56.2分子小，易进入植物细胞对含水或含油中药均可易回收缺点：易燃、价贵4、 酸、碱性有机溶剂碱性成分NH4OH、Na2CO3湿润或直接H+/EtOH提取酸性成分HCl、H2SO4湿润有机溶剂提取OH-/EtOH提取六、各种提取方法及选择（一） 溶剂法1、浸渍法：水或有机溶剂用于受热易破坏成分2、渗漉法：水或有机溶剂用于受热易破坏成分3、 煎煮法：一般以水为溶剂，酸水、碱水则需考虑煎煮时浓度的改变适于受热不易分解破坏的极性化合物，不太用4、 回流提取法：有机溶剂提取，不适于受热易破坏成分5、 连续回流提取法：低沸点有机溶剂提取，不适于受热易破坏成分优点：提取效率高，溶剂用量少缺点：

16、难于用于大量药材的提取（二） 蒸馏法用于挥发性成分，且与水不相混溶或难溶共水蒸馏法需防药粉烧焦水蒸气蒸馏法可避免药粉烧焦收集馏出液，盐析或有机溶剂萃取少量可以用挥发油测定器提取。注意d1（三）升华法固体气体冷固体如樟木中樟脑、茶叶中咖啡因的提取（四）超临界提取法（SFE）优点：a、提取效率高b、成分不被破坏（不需加热）c、无残留溶剂d、可选择性分离1、 超临界流体（SF）：处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上介于气体和液体之间的流体SF密度与液体相近，粘度与气体相近，扩散系数比液体大100倍，对许多物质有很强的溶解能力。SF：CO2、SF6、C2H6、NH3、CCl2F22、 CO2（S

17、F）常用CO2，Tc=31.3。C、无色、无毒、无味，不易燃，化学惰性，价廉。a、 选择性溶解：超临界状态下，CO2对不同的物质溶解能力差别很大。亲脂性低沸点成分（挥发油、烃、酯、醚）低压提取（4104KPa）分子量越高，越难提，分子量200400较易提。b、 提取压力、温度与溶解度：在临界点附近，温度、压力的微小变化，都会使SF的性质产生明显改变。CO2一般在3540。C左右。c、 夹带剂：加入少量夹带剂，可改善溶解度。良好的夹带剂：提高溶解度，改善选择性，增加得率。eg：MeOH、EtOH、Me2CO3、提取过程4、应用发现SFE近百年，上世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青；70

18、年代，国外已有从植物中提取化学成分得应用，如从咖啡豆中提取咖啡因，烟草中提取尼古丁70年代末，SFE在食品中的应用增多，如从啤酒花中提取酒精已形成生产规模；80年代，SFE越来越多的用于香料的提取，如从菊花、米兰、栀子花、玫瑰中提取香料；肉桂、胡椒、薄荷中提取香辛成分90年代，开始从植物药中提取成分，如蛇床子、茵陈蒿、桑白皮、紫草、月见草中提取成分。第三章各种分离材料的性能中药化学研究的诸多成果，与分离材料的不断创新发展，关系十分密切。分离材料选择的正确与否，直接影响分离效果。尤其是近年来，随着科学技术的飞速发展，新型分离材料不断出现，使以前一直认为不易分离的化合物（eg.鞣质、多糖、蛋白质）

19、可以得到分离。如大孔吸附树脂的应用，使得水溶性化合物的去杂大大简化；反相硅胶及其它键合硅胶的出现，使得在分离异构体及水溶性化合物方面有独到之处。这一章主要讲各种分离材料的性能、特点及适用范围。一、层析纸1、组成：纤维素（14苷键吡喃葡萄糖）2、性质：干燥纸67%的水，氢键与纤维素上-OH结合水饱和的纸2035%的水3、规格性能国产层析纸的性能与规格型号标重厚度吸水性灰分展速备注（g/m2）（mm）（30min水上升mm）（%）1900.171501200.08快速2900.16120910.08中速相当于Whaldmann1号3900.1590600.08慢速41800.341511210.0

20、8快速51800.32120910.08中速相当于Whaldmann3号61800.3090600.08慢速4、适用范围a、分离亲水性化合物：糖类、苷类、氨基酸、有机酸b、常用于亲水性成分的定性（因载量小），与标准物对照c、摸索萃取条件d、判断化合物极性大小二、氧化铝1、组成碱性氧化铝（pH9）中性氧化铝（pH7.5）酸性氧化铝（pH23）100160目柱层200目柱层需加压160200目软板TLC200目硬板TLC2、活度：含水量越少，吸附力越强，活度越小含水量（%）0361015活度（级）IIIIIIIVV3、应用碱性氧化铝分离生物碱和甾族化合物，不适于醛、酮、酯、有机酸中性氧化铝分离中性

21、、碱性亲脂性化合物，不适于酸性成分酸性氧化铝分离有机酸类，不适于碱性成分缺点：吸附力强，成分损失大三、 常与成分发生反应，如络合、氧化、消除及异构化活性炭属非极性吸附剂（与Al203、SiO2相反），来源充足、价格便宜1、 类型粉状活性炭：比表面积大，吸附力强，流速慢，层析需加压颗粒状活性炭：比表面积小，吸附力弱，流速快，易于控制。常用锦纶活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉状活性炭制成颗粒状比表面积介于前二者之间，但吸附力最弱（加入锦纶，一方面减少比表面积，一方面锦纶与活性炭之间吸附）2、 分离范围粉状活性炭对活性炭吸附较弱物质（极性较大成分），常拌入3040%硅藻土，增加流速。颗粒状活性炭中等极性

22、成分锦纶活性炭极性较小成分四、 主要用于柱层分离及色素和非极性杂质的吸附。大孔吸附树脂应用时间较短，其性能及分离条件还在不断摸索之中。1、 特性白色球形颗粒，粒度2060目，不溶于酸、碱、有机溶剂非极性苯乙烯型中极性2-甲基丙烯酸酯型孔径小球间平均距离（A。）比表面积小球表面积总和（m2/g）2、 分类根据孔径、比表面积分类部分大孔吸附树脂性能型号厂名极性树脂结构比表面积（m2/g）孔径（A。）D2南开大学非极性乙基苯乙烯382133D646673D871266DS2苯乙烯64259DM22-甲基苯乙烯26624D101天津制胶厂400100AmbertitXAD-1Rohmbaa（美）苯乙烯

23、100200XAD-233090XAD-352644XAD-475050XAD-541568XAD-7中极性2-甲基丙烯酸酯45080XAD-8140250DiaionHP-10Organos（日）非极性苯乙烯400小HP-20600大HP-30500600大HP-40600700小3、原理吸附范德华力或氢键筛选本身多孔性结构决定，即分子量大小4、应用水溶性化合物分离纯化近年：皂苷、生物碱五、 聚酰胺1、 种类：锦纶6聚己内酰胺锦纶66己二酸和己二胺聚合而成2、 适用范围：黄酮、酚类、醌类、有机酸等不可用于鞣质，吸附力特强，成为不可逆物质，但可吸附除去六、 层析硅胶OSiOSi1、普通硅胶：骨

24、架表面存在SiOH。多，则吸附力强，SiOH吸水，则吸附力下降。105-120。C可除水，重现活性。200。C，Si-OH硅氧烷基（去OH作用）柱层：100160目，200300目薄层：1040，加压可用于柱层2、闪式硅胶八十年代初兴起。粒度：4060，微球形，粒度均匀，展开速度快，效果理想。3、 键合硅胶不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面。非极性键合硅胶极性键合硅胶离子型键合硅胶a.非极性键合硅胶（反相硅胶）：硅胶表面键合极性很小的烷基。e.f十八烷基、辛烷基、苯基烷等极性大的成分：吸附能力弱，先下极性小的成分：吸附能力强，后下b.极性键合硅胶：键合CN、NH3、双OH等一般作正相层析

25、c、离子型键合硅胶：键合各种离子交换基团酸性基团：-SO3H、-COOH、-CH2COOH碱性基团：-CH2NH2、-CH2N（CH3）3Cl二性基团：CH（COOH）-CH2-CH2-NH2（CH2）3O-CH2-CH（OH）-CH2-NH2七、 离子交换树脂阳离子交换树脂强酸型（SO3H）弱酸型（COOH）阴离子交换树脂强碱型N（CH3）3XN（CH3）2（C2H4OH）X弱碱型NR2NHRNH21、 性能a、 交换容量：取决于可交换基团的多少毫克当量/g每g树脂所能交换的离子的毫克当量数b、 交联度：交联剂在总重量中所占重量百分数交联度越大，网孔越小c、 溶胀性：在水中体积增大在有机溶剂

26、中收缩。e.gEtOH、Et2Od、型变膨胀性：e.gN+变成H+，树脂体积也变化2、类型及性质P943、离子交换纤维素阳离子交换纤维素：酸性基团接在纤维素或葡聚糖凝胶上。阴离子交换纤维素：碱性基团接在纤维素或葡聚糖凝胶上。适用：提纯蛋白质、核酸、酸性或碱性多糖八、 类型：P96凝胶分子筛葡聚糖凝胶分子筛琼脂糖凝胶分子筛聚丙烯酰胺凝胶分子筛各种离子交换凝胶葡聚糖凝胶分子筛1、 组成：葡聚糖和甘油通过醚键相交链的多孔网状结构。不溶于水、有机溶剂、盐在碱或弱酸液中稳定，强酸水解交链度大、网孔小，吸水时膨胀越大商品G后面数字吸水量10用于多糖、肽、蛋白质分离商品LH-20、LH-60（羟丙基化）可用

27、于小分子（M500）的分离，如黄酮、皂苷等。2、 分类及性能葡聚糖凝胶的性质型号吸水量床体积分离范围（分子量）最少溶胀时间（h）（ml/g）（ml/g）肽、蛋白质多糖室温沸水浴G-101.00.12370070031G-151.50.22.53.51500150031G-252.50.24610005000100500062G-505.00.39111500300005001000062G-757.50.51215300070000100050000243G-10010.01.0152040001500001000100000485G-15015.01.52030500040000010001

28、50000725G-20020.02.0304050008000001000200000725第四章各种分离技术一、 经典分离技术1、溶剂分离法系统溶剂分离法中药粉末EtOH提取残渣提取液回收至干或至无醇味提取物或提取液+Pet连续回流提取或萃取Pet提取物残渣或残留水液+CHCL3连续回流提取或萃取CHCl3提取物残渣或残留水液+EtOAc连续回流提取或萃取CHCl3提取物残渣+EtOH连续回流提取EtOH提取物残渣+H2O回流提取H2O提取物残渣可用连续回流提取法或萃取法注意：极性必须由小到大，不可颠倒连续回流提取法必须在前种溶剂挥干后，方可使用下一种溶剂否则造成成分交叉。水提醇沉法多用于

29、多糖的提取或去杂（大分子成分）分步沉淀法中药粉末H2O提取残渣提取液+EtOH至20%，放置、沉淀、抽滤沉淀物滤液+EtOH至50%，放置、沉淀、抽滤沉淀物滤液+EtOH至80%，放置、沉淀、抽滤沉淀物滤液用于去杂则可水提后加乙醇至6080%，放置，沉淀，抽滤。取上清液浓缩后，做进一步分离；沉淀则去除了多糖、果胶、粘液汁等杂质。我们国家大多数的中药厂过去往往用这种方法来制备中药制剂。碱提酸沉法：酸性成分的分离蒽醌、黄酮、有机酸、香豆素如大黄大黄粉酸水解残渣滤液+Et2O提取残渣提取液+2.5%NaHCO3萃取碱液醚液+H+2.5%Na2CO3萃取沉淀物（大黄酸）碱液醚液+H+5%Na2CO3萃

30、取（大黄素）沉淀物碱液醚液+H+0.5%NaOH萃取沉淀物（芦荟大黄素）碱液醚液+H+沉淀物硅胶或纤维素柱层析Pet：EtOAc（99：1）洗脱相同斑点液合并大黄素甲醚大黄酚酸提碱沉法：生物碱的分离总生物碱总生物碱+H+溶解+CHCl3溶解酸水液氯仿液+OH-，pH低高+H+，pH高低CHCl3萃取弱碱中强碱强碱强碱盐中强碱盐弱碱盐例从某中药中分离到A、B、C三种生物碱类化合物，用不同pH缓冲纸层析，色谱图如下图所示。展开剂为氯仿，上行展开。试问：（1） 三个化合物的碱性强弱顺序如何？（2） 三个化合物中是否有两性生物碱？（3） 请设计一个合理的工艺流程图将A、B、C三种生物碱的混合物分离。p

31、H5.06.57.08.09.010.512.0CBA氯仿上行展开（1）CBA（2）有，C水层（C）（3）+CHCl3，pH6.5H2O氯仿层（A、B）+H+pH5.0水层（B）氯仿层（A）分段沉淀法：皂苷EtOH溶解+Et2O、MeCO或Et2O-MeCO（1:1）。2、两相溶剂萃取法（液-液萃取法）定义：利用各种化合物在互不相溶的二相溶剂中“分配系数”的不同而分离的方法。各化合物在二相中分配系数差异越大，则分离效果愈好。应用：一般从中药水提液中以有机溶剂萃取。C6H6、Et2O、CHCl3苷元、低极性苷EtOAc、n-BuOH皂苷、黄酮苷、多元酚酸性成分调酸后CHCl3、EtOAc、n-B

32、uOH等萃取再加OH水相、有机相反复处理。碱性成分调碱后CHCl3、EtOAc、n-BuOH等萃取再加H+水相、有机相反复处理。注意：a、萃取次数：35次，有时510次b、萃取是否完全：以TLC、PC或试管反应检验c、调酸碱萃取：注意始终保持PH不变，也可用缓冲溶液代替水液d、反复调酸碱：常用盐酸，无氧化性（与硫酸、硝酸比）氨水，碱性温和，可与盐酸生成NH4Cle、乳化的消除：放置（时时转动或搅动）离心（20004000转/min）加热或冷置3、 盐析法定义：根据有效成分的性质（在水中溶解度不是很大），向水提液中加入无机盐，使达到一定的浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低而沉淀析出，与水溶

33、性较大的杂质分离的方法。常用无机盐：NaCl、Na2SO4、（NH4）2SO4.e.g黄藤1%HAc1%HAc提取液NaCl、.OH巴马丁三七H2O水提液MgSO4沉淀（三七皂苷乙）4、 沉淀法某些化学成分可与重金属盐或其它试剂在水中生成沉淀，而与其它水溶性杂质分离的方法。铅盐沉淀法Pb（Ac）2沉淀COOH、邻二酚、羰基酚。如：有机酸、蛋白质、黏液质、鞣质、酸性皂苷、邻羟黄酮.Pb（OH）Ac所有酚OH，甚至一些大分子的多糖等。试剂沉淀法：加入某些试剂，使之与化学成分结合而沉淀a、水溶性生物碱+雷氏铵盐水液（酸水液）生物碱雷氏盐沉淀+Me2CO滤渣Me2CO液+Ag2SO4雷氏银盐沉淀生物碱

34、盐酸盐水液（生物碱H2SO4盐）BaClBaSO4沉淀或：Me2CO液通过阴离子交换树脂柱（氯型）树脂流出液（BCl）b、中药水提液+明胶或蛋白质鞣质沉淀H2O（糖类）c、粗皂苷+胆甾醇甾体皂苷沉淀EtOH（色素）Et2O（油脂、多余胆甾醇）沉淀+Et2O加热索氏提取Et2O（胆甾醇）残留物（皂苷）5、透析法利用小分子在溶液中可通过半透膜，大分子不能通过半透膜的性质而得以分离的方法。常用于除去无机盐、单糖、双糖等小分子，纯化蛋白质、多肽、多糖等大分子。方法：取半透膜加入样品液，悬于清水溶液中，导入适当流速自来水，使膜内外保持一定的浓度差，最后浸入蒸馏水中数小时即可。自制：硫酸纸膜：滤纸浸入50

35、%硫酸中1560分钟，取出，水冲洗即可火棉胶膜：火棉胶+Et2O+EtOH得溶解液，涂于板上，干后置水中即可蛋白质胶膜：20%明胶涂于细布上，阴干，加甲醛使膜凝固，冲洗干净即可猪、牛的膀胱膜：水洗净，乙醚脱脂即可商品：各种规格，供不同大小分子量的化合物透析选用。6、结晶法目前，得到单体的有效方法，结晶的形成标志化合物的纯度达到了相当程度。亲脂性成分易析晶各种苷元亲水性成分难析晶各种苷溶剂的选择对所需成分冷时溶解度小，热时溶解度大，对杂质冷热都不溶或冷热都溶。沸点不宜高，与成分不发生化学反应。常用MeOH、EtOH、Me2CO、CHCl3、Et2O、EtOAc、环己烷方法：原则过饱和a、 加热溶

36、解、乘热抽滤、放置析晶、再抽滤b、 柱层析洗脱液：浓缩、放置、析晶析不出，蒸干换溶剂c、 混合溶剂结晶法：I粗品+高沸点溶剂（溶解度差些）加热溶液+沸点低溶剂（溶解度好些）澄清放置待后者挥去结晶II粗品+溶解性好的溶剂溶液+滴加难溶溶剂浑浊加热澄清放置结晶分步结晶形成结晶后，母液浓缩或滴加难溶溶剂，达过饱和析晶，如此二、三次处理，可得不同产物。重结晶：结晶浓度不够再一次结晶，方法同前。纯度判断形状、色泽、熔点、熔距（0.53。C），注意所用溶剂。TLC、PC：23种展开系统均为单一集中斑点（不为长形），若显色则颜色一致三维HPLC或不同波长HPLC氧化苦参碱，无水Me2CO中得到结晶，熔点20

37、8。C含水Me2CO中得到结晶，熔点7780。C注意：双熔点，某一温度熔融，温度上升又固化，再升温又熔化或分解。二、 例如：汉防己乙素，176。C熔，200。C固化，242。C分解。平面层析法指吸附剂或其它分离材料以平面形式而进行层析分离的方法。主要作用：a、柱层析分离条件的选择（吸附剂、展开剂）b、少量制备纯化合物c、有效成分对照鉴别d、初步判断化合物极性大小（正相层析中，Rf大极性小，Rf小极性大）e、定量分析（一）纸层析（PC）以滤纸为支撑材料，所含水（2035%）为固定相，各组分在固定相与流动相之间进行连续分配。1、 化合物结构与Rf值关系Rf值：原点到斑点（重心）的距离/原点到前沿的

38、距离原理：分配层析一般以水为固定相，化合物极性越大，水中分配越多，Rf值越小；化合物极性越小，水中分配越少，Rf值越大。e.g.芦丁、斛皮素n-BuOH：HAc：H2O（4：1：5）Rf苷元苷15%HAc苷苷元2、 操作方法点样：过浓拖尾，过稀无点，可少量多次（吹风挥干）未知浓度，可平行点不同量点。展开：上行，从滤纸（原点在下）下端垂直向上展开，毛细作用。下行，从滤纸（原点在上）上端垂直向下展开，毛细+重力作用。溶剂槽在展开缸上方。径向：圆形滤纸法显色：成分本身有色；喷显色剂；注意H2SO4、I2不可用，与纸产生作用。UV（365nm）；生物检识：如抗菌，可将展开后的纸贴在含微生物的平面琼脂培

39、养基上，恒温培养后，根据抑菌圈确定有效成分。各类成分常用展开剂、显色剂（见中药化学成分预试验）（二）经典薄层层析（TLC）上世纪三十年代末开始应用，1956年，德国人使薄层板制备仪器化，并使之商品化。从此，TLC广泛用于有机化学相关领域。并开展了旋转TLC、高效TLC、巨型板TLC、离心液相色谱、反相TLC。液固吸附层析：氧化铝、硅胶、聚酰胺液液分配层析：纤维粉、硅藻土、硅胶1、原理（分配原理前以讲过）吸附原理：吸附剂表面存在有效活性基，如硅胶（SiOH）、聚酰胺为氢键吸附，离子交换为诱导力。展开时，溶剂与成分争夺吸附剂表面活性，产生吸附、解吸，解吸下的成分又与溶剂争夺吸附剂表面活性，故又产生

40、吸附、解吸。这样吸附解吸再吸附再解吸的循环，不同的成分由于结构上的区别，表现出所受吸附力不同，被展开剂解吸的难易程度不同，而得以分离。成分的性质差异越大，分离效果越好。2、吸附剂的选择硅胶G（石膏）、硅胶H、硅胶HF254、硅胶GF254、硅胶60HR（不含黏合剂的纯品，用于定量或光谱测定）。氧化铝G（石膏）、碱性氧化铝H、碱性氧化铝HF2543、板的制备硅胶软板：玻棒推行，厚度0.51mm，制备TLC13mm。硬板：硅胶G或GF254+0.30.6%CMC-Na（1：3）厚度0.20.3mm，110105。C活化0.51h。避免气泡：a、顺一个方向研磨b、加少量EtOHAl2O3软板同上硬板

41、：氧化铝G+水（1：2）200。C活化34h活度II；150。C活化4h活度IIIIV。聚酰胺板10g聚酰胺粉+85%甲酸60ml全溶+95%EtOH30ml铺板次日水洗甲酸，室温晾干。纤维素板2.5g（80目）+17mlH2O铺板放置1224h80100。C30min3、 展开剂的选择分离成败的关键：掌握大致规律，可避免不必要的大量摸索。洗脱（展开）规律：展开剂极性越大，推进能力越强正相展开剂极性越小，推进能力越弱化合物极性越大，难推进化合物极性越小，易推进反相与正相相反酸性成分酸性展开剂碱性成分碱性展开剂Rf：0.20.8较合适4、 操作方法（点样展开显色）点样：a、样品溶剂b.p低，控制

42、斑点扩散。e.gCH2Cl2、EtOAc、MeOH、EtOH、Me2COb、软板注意不要带起吸附剂c、原点直径2mm左右，少量多次，毛细管角度45。，一般0.20.5mm，定量-微量进样器。展开注意：溶剂挥干两相溶剂需要充分分层克服边缘效应：a、饱和；b、二侧刮去2mm分上行、下行，软板平斜式。显色喷雾法（软板-湿；硬板-干）荧光观察法蒸汽显色法（I2、NH3）压板法（软板）5、 常用展开剂、显色剂6、 应用有效成分鉴定：与对照品Rf值、颜色一致、即可初步识别；可用23种展开剂。药材真伪鉴定：与对照药材斑点Rf值、颜色一致；可用23种展开剂。柱层析分离条件的摸索：吸附柱层吸附；分配柱层分配制备

43、分离：荧光或显色确定位置，硬板谱带刮下、软板吸入法。定量分析（含量测定）：TLC扫描或洗脱比色。（三）高效薄层色谱法（HPTLC）1、特点a、一般采用预制板，涂层均匀一致，重现性好。b、颗粒细小，粒度范围窄，57。平衡时质量传递阻滞项可忽略，斑点大小主要由分子扩散项决定，所以斑点集中，分离好。c、展距短d、分离能力较TLC提高3倍，检出灵敏度提高12个数量级。2、操作流程同TLC、同样可以全部仪器化点样展开检出扫描计算3、样品的处理萃取、过滤、沉淀、短柱预分离（四）巨型板层析以硅胶为吸附剂，聚丙烯酰胺为黏合剂，铺制在不锈钢板上，主要用于制备分离。1、 巨型板的制作基板：60600.12cm的不锈钢板涂层：60550.10.5cm吸附剂：硅胶（薄层或柱层），氧化铝黏合剂：12%聚丙烯酰胺（PAM）1：1.