中药、天然药物急性毒性研究技术指导教程文件.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。中药、天然药物急性毒性研究技术指导-【Z】GPT2-1指导原则编号中药、天然药物急性毒性研究的技术指导原则（第二稿）二OO四年一月十五日-目录一、概述1二、急性毒性试验的原则要求2（一）试验管理2（二）试验设计2（三）受试物2（四）实验动物2（五）试验分组3（六）给药途径3（七）给药容量3（八）观察期限3（九）观察指标3（十）结果处理和分析3三、不同情况的中药、天然药物急毒试验的一般要求4四、参考文献6五、附录7（一）急毒试验的一般研究方法7（二）急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的器官、组织、系统8

2、六、起草说明11七、著者13一、概述急性毒性是指动物一次或24小时内多次接受一定剂量的受试物后，一定时间内出现的毒性反应。急性毒性试验可为新药的研发提供参考信息。中华人民共和国卫生部于1993年颁发的中药新药研究指南和国家药品监督管理局于1999年颁发的中药新药药理毒理研究的技术要求，对于统一、规范中药急性毒性试验，推动我国中药的研究和开发起到了积极的作用。但随着新药研究手段的不断改进，对中药、天然药物认识的进一步深入，这些要求越来越表现出它的局限性。多数中药、天然药物作用温和，中药复方制剂通过合理的配伍，也可能使毒性减轻。多数中药、天然药物新药，其处方来源有些是古方，有些是医院制剂或临床经验

3、方，有一定的临床应用基础。但由于现代中药、天然药物制剂运用了大量的新技术甚至新的理论，与传统中药相比，物质基础和给药方式可能有明显改变，而有些改变带来的结果又是未知的，特别是当某些成分的含量明显提高后，其毒性作用可能明显增大。因此，中药、天然药物进行急性毒性试验研究十分必要。本指导原则是根据中药、天然药物的特点，结合国际上药物安全性评价的要求和我国药物安全性研究现状而制订的。本指导原则适用于中药、天然药物的急性毒性试验研究。中药、天然药物的情况复杂，本文所提及的内容不可能涵盖中药、天然药物急性毒性试验研究的全部实际情况，在进行中药、天然药物急性毒性试验研究时，应遵循“具体问题具体分析”的原则。

4、二、急性毒性试验的原则要求（一）试验管理急性毒性试验必须执行药物非临床研究质量管理规范（GLP）。（二）试验设计急性毒性试验应遵循“具体问题具体分析”的原则，试验设计应符合随机、对照、重复的原则。（三）受试物急性毒性研究的受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品，因此建议受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药（提取物）进行试验。溶媒或赋形剂：选择合适的溶媒或赋形剂。（四）实验动物一般应采用哺乳动物，雌雄各半。如临床为单性别用

5、药，则可采用相对应的单一性别的动物。大、小鼠为常用的实验动物，其他动物也可使用，当采用非啮齿类动物更适合进行研究时，尽可能采用非啮齿类动物。啮齿类动物应符合国家实验动物标准II级及其以上等级要求，非啮齿类动物应符合国家实验动物标准I级及其以上等级要求。通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童，建议考虑采用幼年动物。动物初始剂量不应超过或低于平均体重的20。（五）试验分组除设受试物合适的剂量组外，还应设空白（和或阴性）对照组。（六）给药途径给药途径不同，受试物的吸收率、吸收速度和暴露量会有所不同，因此需采用多种给药途径进行急性毒性试验研究。通常，给药途径应采用两种，其中一种为拟临床给药

6、途径，另一种为能使药物较完全进行循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。如不采用拟临床途径给药，必须充分说明理由。灌胃给药时应空腹。（七）给药容量灌胃给药，大鼠给药容量每次一般不超过20ml/kg，小鼠每次一般不超过40ml/kg；其他动物及给药途径的给药容量可参考相关文献及根据实际情况决定。（八）观察期限一般为714天，如果毒性反应出现较慢应适当延长观察时间，如观察时间不足7天，应充分说明理由。应详细观察给药后4小时内动物的反应情况，然后每天上、下午各观察一次。（九）观察指标包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物等。详细记录所有动物的死亡情况、中

7、毒症状及中毒反应的起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆等。对濒死及死亡动物应及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后也均应进行大体解剖，任何器官出现体积、颜色、质地等改变时，应记录并进行组织病理学检查。（十）结果处理和分析1、根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的量效关系及随时间的变化情况。2、参考附录I5，判断出现的各种反应可能涉及的器官、组织或系统等。3、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签字的报告及有病变组织的

8、病理照片。4、根据不同剂量组各种反应的发生率、动物死亡情况等，判断动物对受试物的耐受性、最大无反应剂量、最小毒性反应剂量、最大耐受剂量、最小致死剂量等，初步判断药物的安全范围。5、说明所使用的计算方法和统计学方法，提供所选用方法合理性的依据。6、应根据急性毒性试验结果，提示在其它安全性试验、临床试验、质量控制方面应注意的问题，同时，结合其它安全性试验、有效性试验及质量可控性试验结果，权衡利弊，分析受试物的开发前景。三、不同情况的中药、天然药物急性毒性试验的一般要求由于中药、天然药物的特殊性，在具体进行试验时可参照以下要求进行，如不按以下要求进行，应充分说明理由。1、未在国内上市销售的从中药、天

9、然药物中提取的有效成分及其制剂，未在国内上市销售的来源于植物、动物、矿物等药用物质制成的制剂，未在国内上市销售的中药材新的药用部位制成的制剂，未在国内上市销售的从中药、天然药物中提取的有效部位制成的制剂，未在国内上市销售的由中药、天然药物制成的注射剂。以上情况，由于其物质基础较传统中药发生了明显改变，或应用经验较少，应采用两种给药途径、啮齿类和非啮齿类两种动物，全面考察受试物的急性毒性反应情况。如临床为非血管内给药，则建议另一给药途径采用静脉给药方式，以便全面暴露受试物的毒性反应情况。如果因为制剂等原因不能采用静脉给药，应充分说明理由，这种情况下，可采用另一种给药途径或仅采用一种拟临床给药途径

10、进行毒性反应的观察。血管内给药可仅采用拟临床给药途径进行毒性反应的观察。2、未在国内上市销售的由中药、天然药物组成的非注射给药的复方制剂如该复方制剂处方组成符合中医药理论，有一定的临床应用经验，一般情况下，可仅采用一种动物，按拟临床给药途径进行急性毒性反应的观察。如该复方制剂为天然药物复方制剂，应采用啮齿类和非啮类两种实验动物，按拟临床给药途径进行急性毒性反应的观察。如以上制剂处方中含有天然药物、有效成份或化学药品，则应当对上述药用物质进行急性毒性的相互作用研究。3、改变国内已上市销售药品给药途径（不包括由非注射剂改为注射剂）的制剂可仅采用一种动物，比较改变前后两种不同给药途径的毒性反应。4、

11、改变国内已上市销售药品剂型或改变工艺但不改变给药途径的中药、天然药物复方制剂如制备工艺有质的改变，建议采用一种动物，按拟临床给药途径进行急性毒性的观察。5、增加新的适应症或者功能主治的品种如需延长用药周期或增加剂量者，应结合原申报资料及处方组成的情况确定是否需进行急性毒性研究、急性毒性研究的内容。中药、天然药物情况复杂，应根据受试物的特性，选择合适的试验方法，并对试验结果进行适当的分析。附录（一）为“急毒试验的一般研究方法”，附录（二）为“急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的器官、组织、系统”，仅供研究者选择试验方法及分析判断试验结果时参考。四、参考文献1袁伯俊，王治乔.新药临床前安全性评价

12、与实践.北京：军事医学科学出版社，1997.23-362Guidanceforindustry：singledoseacutetoxicitytesingforpharmaceuticals.FDA,1996.3徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.第三版.北京：人民卫生出版社，2002，227-2314陈奇.中药药理研究方法学，北京：人民卫生出版社，1993.112-1185PrinciplesandMethodsofToxicology,FourthEdition,editedbyA.WallaceHayes,Taylor&Francis,Philadelphia,2001.853-916

13、五、附录（一）急毒试验的一般研究方法1、致死量法药物毒性的大小，可用动物的致死量（Lethaldose）来表示，因为动物生与死的生理指标较其他指标明显、客观、容易掌握。在测定致死量的同时，还应仔细观察动物死亡前的中毒反应情况。致死量的测定主要包括最小致死量（LD5）、半数致死量（LD50）和最大致死量（LD95）。由于LD50的测定较简便，故致死量的测定一般采用LD50。2、最大耐受量试验最大耐受量（Maximaltolerancedose,MTD）是指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。从获取安全性信息的角度考虑，有时对实验动物的异常反应和病理过程的观察、分析，较以死亡为观察指标更有毒

14、理学意义。3、最大给药量试验最大给药量指单次或24小时内多次（2-3次）给药所采用的最大给药剂量。最大给药量试验是在合理的给药浓度及合理的给药容量的条件下，以允许的最大剂量给予实验动物，观察动物出现的反应。有许多中药、天然药物毒性较低，如单次给药量远远大于药效学试验等效剂量时，可不必进行更大剂量的观察。4、其他方法固定剂量法（Fixed-doseprocedure）、近似致死剂量法(ApproximateLethalDoseALD)、剂量探测试验法、扩展试验法、剂量累积试验法等。（二）急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的器官、组织、系统临床观察指征可能涉及的器官、组织、系统I.鼻孔呼吸阻塞，

15、呼吸频率和深度改变，体表颜色改变。A.呼吸困难：呼吸困难或费力，喘息，通常呼吸频率较低：1.腹式呼吸：隔膜呼吸，吸气时腹部明显偏斜。CNS的呼吸中枢，肋肌麻痹，胆碱能神经麻痹。2.喘息：用力深吸气，有明显的吸气声。CNS的呼吸中枢，肺水肿，呼吸道分泌物蓄积，胆碱功能增强。B.呼吸暂停：用力呼吸后出现短暂的呼吸停止。CNS的呼吸中枢，肺心功能不足。C.紫绀：尾部、口和足垫呈现蓝色。肺心功能不足，肺水肿。D.呼吸急促：呼吸快而浅。呼吸中枢刺激，肺心功能不足。E.鼻分泌物：红色或无色。肺水肿，出血。II.运动功能：运动频率和特点的改变。A.自发活动、刺探、梳理毛发、运动增加或减少。躯体运动，CNS。

16、B.困倦：动物出现昏睡，但易被警醒而恢复正常活动。CNS的睡眠中枢。C.正常反射消失，翻正反射消失。CNS，感官，神经肌肉D.麻痹：正常反射和疼痛反射消失。CNS，感官。E.强直性昏厥：无论如何放置，姿势不变。CNS，感官，神经肌肉，自主神经F.运动失调：动物走动时不能控制和协调运动，但无痉挛、局部麻痹或僵硬。CNS，感官，自主神经G.异常运动:痉挛，足尖步态，踏脚、忙碌、低伏。CNS，感官，神经肌肉H.俯卧：不移动，腹部贴地。CNS，感官，神经肌肉I.震颤：包括四肢和全身的颤抖和颤振。神经肌肉，CNSJ.肌束震颤：背部、肩部、后肢和足部肌肉的运动。神经肌肉，CNS，自主神经III.抽搐(惊厥

17、)：随意肌明显的无意识收缩或惊厥性收缩A.阵挛性抽搐：肌肉收缩和放松交替性痉挛。CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经B.强直性抽搐：肌肉持续性收缩，后肢僵硬性扩张。CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经C.强直性阵挛性抽搐：两种类型抽搐交替出现。CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经D.昏厥性抽搐：通常是阵挛性抽搐并伴有喘息和紫绀。CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经E.角弓反张:僵直性发作，背部弓起，头抬起向后。CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经IV.反射A.角膜眼睑闭合：接触角膜导致眼睑闭合。感官，神经肌肉B.基本反射:轻轻敲打外耳内侧，导致外耳扭动。感官，神经肌肉C.正位反射：翻正反射CN

18、S，感官，神经肌肉D.牵张反射：后肢从某一表面边缘掉下时收回的能力。感官，神经肌肉E.光反射(瞳孔反射)；见光瞳孔收缩。感官，神经肌肉，自主神经F.惊跳反射：对外部刺激(如触摸、噪声)的反应。感官，神经肌肉V.眼检指征A.流泪：眼泪过多，澄清或有色自主神经B.缩瞳：无论有无光线，瞳孔缩小。自主神经C.散瞳：无论有无光线，瞳孔扩大。自主神经D.眼球突出自主神经E.上睑下垂：上睑下垂，刺激后动物不能恢复正常。自主神经F.血泪：眼泪呈红色。自主神经，出血，感染G.上眼睑松弛自主神经H.结膜浑浊，虹膜炎，结膜炎眼睛刺激性VI.心血管指征A.心动过缓自主神经，肺心功能低下B.心动过速自主神经，肺心功能低

19、下C.血管扩张：皮肤、尾巴、舌头、耳朵、足垫、结膜、阴囊发红，体温高。自主神经、CNS、心输出量增加，环境温度高D.血管收缩：皮肤苍白，体温低。自主神经、CNS、心输出量降低，环境温度低E.心律不齐：心律异常CNS、自主神经、肺心功能低下，心肌缺血VII.唾液分泌A.唾液分泌过多：口周围毛发潮湿自主神经VIII.竖毛A.毛囊立毛肌收缩自主神经IX.痛觉丧失A.对痛觉刺激反应性降低(如热板)感官，CNSX.肌张力A.张力降低：肌张力普遍降低自主神经B.张力增加：肌张力普遍增加自主神经XI.胃肠指征排便(大便)A.固体，干燥，量少自主神经，便秘，胃肠动力B.流动性降低，水样便自主神经，痢疾，胃肠动

20、力呕吐A.呕吐或恶心感官，CNS,自主神经(大鼠无呕吐)多尿A.红色尿肾脏损伤B.尿失禁自主感官VII.皮肤A.水肿：组织液体充盈肿胀刺激性，肾脏功能衰竭，组织损伤，长期不动B.红斑：皮肤发红刺激性，炎症，致敏六、起草说明（一）起草背景中华人民共和国卫生部于1993年颁发的中药新药研究指南和国家药品监督管理局1999年颁发的中药新药药理毒理研究的技术要求，对于统一、规范中药急性毒性试验，推动我国中药的研究和开发起到了积极的作用。随着科技的进步，对急性毒性的认识发生着变化，中药、天然药物新药的研究也得到了迅速发展，原有指南和技术要求已明显不能适应当今中药、天然药物发展的实际，相应的修订已十分必要

21、。随着我国加入WTO，世界中医中药热的兴起，中药要走向世界，也需要中药与国际的要求接轨。本次指导原则的起草是在原指导原则的基础上，根据中药、天然药物的特点，结合国际上药物安全性评价的要求和我国药物安全性研究现状而修订的。（二）对急毒试验关注重点的说明此次指导原则与以往的指南或技术要求不同的是，不再强调LD50的具体数值，也不再强调与临床拟用量的倍数，指出急毒试验关注的重点是给药后的毒性反应，强调对结果的综合分析。而且本指导原则强调研究性，故在正文部分并未列入具体的试验方法，希望研制者应根据受试物的特点选择合适的方法进行研究。（三）对受试样品的说明为尽可能使进行的急性毒性试验能代表临床试验受试物

22、和上市药品，真实地反映临床应用与上市后的毒性情况，经专家讨论后达成共识，建议受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品。这里所指所中试样品要求的是最后作为正式申报时所进行的规范的急性毒性试验所用的样品，并不是指在研发过程中所进行的一系列急毒预试用样品。（四）对受试动物要求的说明原1992年颁布的中药新药研究指南中未对急毒试验的动物等级有要求，因此这次指导原则起草过程中就对动物数是否应有所规定进行了讨论。经讨论后认为，随着科技的发展，中药新药的安全性评价水平也应相应提高，建议啮齿类动物应符合国家实验动物标准II级及其以上等级要求，非啮齿类动物应符合国家实验动物标准I级及其以上等级

23、要求。（五）对口服给药禁食时间的说明在第一次课题研究组讨论会时，专家提出原指南中写的小鼠、大鼠禁食时间12-16小时过长，但对具体禁食时间多长未作最后定论，应根据所选择的动物不同而决定。故本稿中对此未作具体要求，只说明应“空腹”。（六）对最大给药量试验的说明原指南和技术要求要求急性毒性试验应测定动物的LD50，在无法测定时可进行最大给药量试验，但中药、天然药物的急性毒性往往难以表现出来，即使采用大剂量时能观察到动物的死亡情况，但该剂量可能与有效剂量或拟临床用量相差很大，其毒性反应对其他安全性试验及临床的提示意义已不大，故建议可不将动物的致死量及最大耐受量作为必需检测的内容,最大给药量试验可作为中药、天然药物急毒试验的测定内容。（七）关于天然药物复方制剂建议采用两种动物进行急毒试验的说明在新的注册管理办法（试行）中对此并无明确要求，但它与中药复方制剂不同，天然药物复方制剂可以不按中医药理论进行组方。因此，考虑到该类药物已缺乏相应的临床应用基础，建议急毒试验采用两种动物进行。中药、天然药物的成分及制剂情况复杂，本指导原则是在课题研究组广州会后经专家意见综合整理而成，因时间仓促，此稿一定存在许多不足，因此真诚希望各位专家及社会同仁对本指导原则再次提出宝贵建议。七、著者朱家谷、黄芳华、韩玲、钱蓓丽、李培忠、方泰惠、廖明阳、朱晓新、金若敏、苗明三、吴春福、姚全胜、高宁