第六章化学检测优秀课件.ppt

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1、第六章化学检测第1页，本讲稿共27页一 糖类的化学检测n糖类包括多糖、双糖、单糖n单糖和某些双糖具有游离羰基还原糖n多糖和蔗糖等无还原性非还原糖n糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。n非还原糖必须转化为还原糖再进行测定第2页，本讲稿共27页n最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂n基本组成：A：CuSO4溶液 B:NaOH和酒石酸钾钠溶液 使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜）n酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。第3页，本讲稿共27页定糖常用方法n1 兰爱农（Lane-Eynon）法n次甲基蓝（

2、亚甲基蓝、四甲基蓝）法、置换法、直接滴定法n反应终点用次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1D还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）n多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定 如淀粉，可用酸解或酶解第4页，本讲稿共27页操作要点n（1）斐林试剂的标定n（a）标定预备试验 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。n（b）标定nA、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀

3、后加热加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0第5页，本讲稿共27页n(2)定糖n（a）定糖预备试验nA、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。n（b）定糖nA、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准

4、葡萄糖液的总毫升数V第6页，本讲稿共27页n(3)计算n还原糖含量（以葡萄糖计）（V0-V)c (1/10)nn注意：n（a）AB分开储存，防止Cu+变化，临用混合n（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净n（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响n（d）煮沸时间要一致n（e）注意指示剂加入时间和加入量一致n（f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成）n（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热 第7页，本讲稿共27页n斐林试剂快速法：斐林试剂快速法：n在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色

5、出现。反应终点比兰爱农法更为明显。第8页，本讲稿共27页2 碘量法nI2 NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应n操作要点：n（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。n（2）标准碘液配制，0.1mol/Ln（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘第9页，本讲稿共27页n碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液，摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5淀粉液作指示剂，

6、滴定至蓝色消失，记录V0n(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液，V1n(5)计算：n醛糖含量（V0 V1）C M nn注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）n配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）第10页，本讲稿共27页3 铜试剂法n将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。n（1）铜试剂的配制 主要提供二价铜离子及碘n（2）标准曲线的制作第11页，本讲稿共27页n（a)标准葡萄糖液的配制 0.1%或0.05（根据所用铜离子试剂定）n（b)三角瓶编号 1

7、 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液（mL)0 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL)5 4 3 2 1 0 铜试剂（mL)5 5 5 5 5 5 沸水浴10min，冷却至室温n（c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量Vn(d)绘标准曲线n葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（V0-V)为横坐标第12页，本讲稿共27页二 蛋白质和氨基酸的化学检测n蛋白质含氮量几乎恒定，平均16n测出N含量6.25，即为蛋白质量n 含氮量 每gN相当P肉、蛋、豆 16 6.25n面粉 17.6 5.70n奶品 15.7 6.38n花生 18.2 5.50n鲑精

8、蛋白 31.5 3.17第13页，本讲稿共27页蛋白质常用检测方法1 定氮法（经典的，仲裁的）常用凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（1）原理消化、蒸馏、吸收、滴定计算（2）操作要点 (a)消化：凯氏定氮瓶，样品K2SO4-CuSO4、浓H2SO4,通风厨内进行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。第14页，本讲稿共27页第15页，本讲稿共27页n(b)蒸馏：防止漏气n(c)吸收：5mL2H3BO3甲基红溴甲酚绿几滴或一定量标准酸溶液（如25mL 0.05mol/L H2SO4)n(d)滴定计算：H3BO3吸收：0.01mol/LHCl滴定至绿色 淡紫红色 样品中的总氮量（mg)=（A-B)C14n

9、标准硫酸接收：0.1mol/L标准NaOH滴定，甲基红黄色终点 样品中总氮量=（C1V1-C2V2)14nn粗蛋白含量样品的总氮量粗蛋白含量样品的总氮量6.25第16页，本讲稿共27页2 双缩脲试剂法测定蛋白质n缩脲CuSO4、NaOH 紫红色化合物nA C缩脲n蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应n蛋白质（多肽）CuSO4（NaOH）铜钠双缩脲络合物nA Cp，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关nTris缓冲液干扰P的测定，测定范围110 mg/mL第17页，本讲稿共27页n操作：n（1）双缩脲试剂的配制 CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KIn (2)标准曲线的制作1标准酪蛋白(mL

10、)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水(mL)1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0双缩脲试剂(mL)4 4 4 4 4 4室温反应30min测A540n (3)样品测定 1mL4mL双缩脲试剂，30min，测A540第18页，本讲稿共27页3 福林酚试剂法测定蛋白质含量n双缩脲法的发展，灵敏100倍，需时较长，对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。n碱性铜试剂双缩脲反应n稀释的苯酚试剂与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色n两种呈色反应可叠加第19页，本讲稿共27页n操作：n（1）福林酚试剂的配制n甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3,B、CuS

11、O4和酒石酸钾钠)n乙液：稀释的苯酚试剂n（2）标准蛋白溶液配制n结晶牛血清蛋白溶于0.9NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）n（3）标准曲线制作n（4）样品测定n1mL样品（含P15500 g）5mL甲液，室温10min，乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500750第20页，本讲稿共27页蛋白质的免疫化学检测n概念：免疫化学检测、抗体、抗原、凝集反应、沉淀反应n检测方法：n（1）凝集反应n效价测定，细菌、病毒分类n（2）沉淀反应n沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等第21页，本讲稿共27页氨基酸含量测定方法n1 茚三酮显色法n微酸性条件下

12、，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物n取1mL样品溶液（含氨基酸0.150ug)加1mL缓冲液（pH5.06.7），再加1mL茚三酮显色液，100 水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD440第22页，本讲稿共27页2 甲醛滴定法测定氨基酸n氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定。n加进甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。n注意：需用过量中性甲醛。第23页，本讲稿共27页三 核酸的化学检测n根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。n1

13、定磷法测定核酸含量n（1）核酸的消化n（2）磷的测定 定磷试剂，45 水浴25min，冷却至室温测OD650 无机磷标准液作标准曲线n（3）核酸含量的计算一般DNA含磷9.5,RNA含磷9.2，RNA量（总磷量无机磷量）10.9DNA量（总磷量无机磷量）10.5第24页，本讲稿共27页2 二苯胺法测定DNA含量nDNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。在40400 g范围内，OD595与DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏度。n（1）二苯胺试剂的配制n（2）标准曲线制作n（3）样品DNA含量测定第25页，本讲稿共27页3 地衣酚法测定

14、RNA含量n核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。n操作：地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品RNA测定第26页，本讲稿共27页思考题n1 如何区别还原糖与非还原糖？举出常见的还原糖与非还原糖。n2 有哪些定糖方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。n3 如何测定薯类淀粉含量？n4 蛋白质含量测定有哪些方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。n5 如何用滴定法测定氨基酸含量？n7如何用定磷法测定DNA或RNA含量？n8 二苯胺测定DNA和地衣酚测定RNA原理？n9 三瓶未知液分别为蛋白质、糖和RNA，如何鉴定？第27页，本讲稿共27页