目的基因导入受体细胞及重组子的筛选课件.ppt

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1、关于目的基因导入受体细胞及重组子的筛选现在学习的是第1页，共39页第一节第一节 受体细胞受体细胞受受体体细细胞胞（receptor receptor cellcell）：又又称称宿宿主主细细胞胞或或寄寄主主细细胞胞（host host cellcell），从从实实验验技技术术上上讲讲是是能能摄摄取取外外源源DNADNA并并使使其其稳稳定定维维持持的的细细胞胞；从从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。随随着着基基因因工工程程的的发发展展，从从低低等等的的原原核核细细胞胞，到到简简单单的的真真核核细细胞胞，进进一一步到结构复杂的高等动、植物细

2、胞都可以作为基因工程的受体细胞。步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。1.1.受体细胞的概念受体细胞的概念现在学习的是第2页，共39页2.2.受体细胞选择所应遵循的原则受体细胞选择所应遵循的原则v便于重组便于重组DNADNA分子导入。分子导入。v能能使使重重组组DNADNA分分子子稳稳定定存存在在于于细细胞胞中中。（如如：限限制制性性内内切切酶酶缺缺陷陷型型，避免其对重组避免其对重组DNADNA分子的降解破坏作用。）分子的降解破坏作用。）v便便于于重重组组体体的的筛筛选选。（选选择择与与载载体体所所含含的的选选择择标标记记相相匹匹配配的的受受体细胞基因型）体细胞基因型）v

3、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。v安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。v选选用用内内源源蛋蛋白白水水解解酶酶基基因因缺缺失失或或蛋蛋白白酶酶含含量量低低的的细细胞胞，利利于于外外源源基基因因蛋蛋白白表表达达产产物物在在胞胞内内的的积积累累，或或促促进进外外源源基基因因的的高高效效分分泌泌表达。表达。现在学习的是第3页，共39页v受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。v具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。具有较好的转译后加工机制，

4、便于真核目的基因的高效表达。v在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。现在学习的是第4页，共39页3.3.各种类型受体细胞的优缺点各种类型受体细胞的优缺点（1 1）原核细胞）原核细胞优点优点v大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNADNA的进入。的进入。v没没有有核核膜膜，染染色色体体DNADNA没没有有固固定定结结合合的的蛋蛋白白质质，这这为为外外源源DNADNA与与裸裸露的染色体露的染色体DNADNA重组减少了麻烦。重组减少了麻烦。v基基因因组组简简单单，不不含含线线粒粒体体和和叶叶绿

5、绿体体基基因因组组，便便于于对对引引入入的的外外源源基因进行遗传分析。基因进行遗传分析。v原原核核生生物物多多数数为为单单细细胞胞生生物物，容容易易获获得得一一致致性性的的的的实实验验材材料料，并并且且培培养养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。现在学习的是第5页，共39页缺点缺点 由由于于原原核核细细胞胞缺缺乏乏真真核核生生物物具具有有的的RNARNA转转录录后后加加工工、修修饰饰系系统统、蛋蛋白白质质翻翻译译后后加加工工、修修饰饰、折折叠叠复复性性系系统统，使使某某些些真真核核细细胞胞中中编编码码蛋蛋白白的的基基因因不不能能够在原核细胞中表达，甚

6、至即使获得了表达，也不具有正常的生物学活性。够在原核细胞中表达，甚至即使获得了表达，也不具有正常的生物学活性。常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。大肠杆菌：大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。细细胞胞膜膜间间隙隙中中含含有有大大量量的的内内毒毒素素，可可导导致致人人体体热热原原 反反映映。目目前前已已实实现现商商品品化化的的基基因因工工程程产产品品中中，大大部部分分是是由由大大肠肠杆杆菌菌工工程程菌菌生产的。生产的。枯草杆菌：枯草杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因基因

7、背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因现在学习的是第6页，共39页表表达达产产物物分分泌泌到到培培养养基基中中，不不产产生生内内毒毒素素，具具有有芽芽孢孢行行成成能能力力，易于保存和培养。易于保存和培养。蓝藻：蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达的宿主。是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达的宿主。（2 2）真菌细胞）真菌细胞 真真菌菌是是低低等等的的真真核核生生物物，基基因因结结构构简简单单，基基因因表表达达调调控控机机制制以以及及蛋蛋白白质质的的加加工工与与分分泌泌都都有有真真核核生生物物的的特特征征，因因此此可可用用于于表表达达真真核生物的基因。常用的真菌细胞

8、有酵母等。核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。（3 3）植物细胞）植物细胞优优点点：植植物物细细胞胞具具有有全全能能性性，一一个个细细胞胞就就能能分分化化成成一一株株完完整整的的植植株株，这这就就意意味味着着一一个个获获得得外外源源基基因因的的植植物物细细胞胞就就能能培培养养成成稳稳定定遗遗传的转基因植物。传的转基因植物。现在学习的是第7页，共39页缺点：缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。方法方法：（a a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。（b b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。

9、）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。（4 4）动物细胞）动物细胞优点：优点：v动动物物细细胞胞具具有有RNARNA的的转转录录后后的的剪剪接接、加加工工机机制制，蛋蛋白白质质翻翻译译后后的的加加工工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。v易被重组质粒易被重组质粒DNADNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。转染，具有遗传稳定性和可重复性。v可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。缺点：缺点：不不能能通通过过一一个个细细胞胞的的培培养养获获得得转转基基因因动动物物。在在获获得得转转基基因因细

10、细胞胞后后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。现在学习的是第8页，共39页第二节第二节 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞1.1.重组重组DNADNA分子导入原核细胞分子导入原核细胞（1 1）重组质粒）重组质粒DNADNA分子转化大肠杆菌分子转化大肠杆菌转转化化（transformation)transformation)：重重组组质质粒粒DNADNA分分子子通通过过与与膜膜蛋蛋白白结结合合进进入入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转化的方法转化的方法v制备

11、感受态细胞法制备感受态细胞法感受态细胞：处于能吸收周围环境中感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNADNA分子的生理状态的细胞。分子的生理状态的细胞。制备感受态大肠杆菌一般利用制备感受态大肠杆菌一般利用CaClCaCl2 2处理。处理。现在学习的是第9页，共39页v电穿孔转化法电穿孔转化法 其其基基本本原原理理是是利利用用电电穿穿孔孔仪仪的的高高压压电电脉脉冲冲作作用用，在在大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞膜膜上上进进行行电电穿穿孔孔，形形成成可可逆逆的的瞬瞬间间的的通通道道，从从而而促促进进外外源源DNADNA的的有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源

12、DNADNA浓度的影响。浓度的影响。v三亲本杂交接合转化大肠杆菌三亲本杂交接合转化大肠杆菌原原理理：是是基基于于可可迁迁移移质质粒粒的的迁迁移移作作用用（mobilizationmobilization）而而建建立立的的一一种种DNADNA转转化化方方式式。首首先先将将具具有有接接合合转转化化功功能能的的辅辅助助质质粒粒转转移移至至含含有有重重组组质质粒粒的的供供体体细细胞胞中中，然然后后将将这这种种供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞进进行行混混合合，促促使使两两者者发发生生接接合合转转化化作作用用，将将重重组组质质粒粒导导入入受受体体细细胞胞。整整个个接接合合转转化化过过程程涉涉及及到到3

13、 3种种有有关关的的细细菌菌菌菌株株，即即待待转转化化的的受受体体菌菌、含含有有要要转转化化的的重重组组质质粒粒DNADNA的的供供体体菌菌和和含含有有广广泛泛宿宿主主的的辅辅助助质质粒粒的的辅辅助助菌菌，故故称称三三亲亲本本杂杂交交接合转化法。接合转化法。现在学习的是第10页，共39页转化率的计算及其影响因素转化率的计算及其影响因素转化率：转化率：DNADNA分子转化受体菌获得转化子的效率。分子转化受体菌获得转化子的效率。转转化化率率 =转转化化子子数数 /DNADNA分分子子数数 （1010-5-5表表示示10105 5个个DNADNA分分子子获获 得得一一个个转转化子）化子）或或 转化子

14、数转化子数 /DNA/DNA质量（质量（10106 6/g g表示表示1 1 g DNAg DNA分子得分子得10106 6个转化子）个转化子）辅助菌（含有结合型辅助质粒）供体菌（含有目的质粒）受体菌含有目的基因的非结合型重组质粒迁移辅助质粒转移现在学习的是第11页，共39页影响转化率的因素影响转化率的因素a a：重重组组DNADNA分分子子的的大大小小、构构型型、浓浓度度、纯纯度度及及载载体体与与受受体体细细胞胞的的亲和性。亲和性。b b：菌株类型：菌株类型c c：转转化化方方法法：电电穿穿孔孔法法最最高高，CaClCaCl2 2诱诱导导法法居居中中，三三亲亲本本杂杂交交接接合合法法最最低。

15、低。（2 2）重组）重组嗜菌体嗜菌体DNADNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌转染（转染（transfectiontransfection）及转导（）及转导（transductiontransduction）转染：转染：将重组将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子直接导入受体细胞中的过程称为转染。分子直接导入受体细胞中的过程称为转染。转转导导：通通过过噬噬菌菌体体颗颗粒粒感感染染宿宿主主细细胞胞的的途途径径把把外外源源DNADNA分分子子转转移移到到受体细胞内的过程。受体细胞内的过程。现在学习的是第12页，共39页 采采用用噬噬菌菌体体DNADNA直直接接转转染染大大肠肠杆杆菌菌的的效效率率很很

16、低低，所所以以需需对对重重组组的的噬菌体噬菌体DNADNA进行体外包装后，再通过转导的方法感染大肠杆菌。进行体外包装后，再通过转导的方法感染大肠杆菌。体外包装体外包装体体外外包包装装：在在体体外外模模拟拟噬噬菌菌体体DNADNA分分子子在在受受体体细细胞胞内内发发生生的的一一系系列列特特殊殊的的包包装装反反应应过过程程，将将重重组组噬噬菌菌体体DNADNA分分子子包包装装成成成成熟熟的的具具有有感感染染能能力的力的噬菌体颗粒的技术。噬菌体颗粒的技术。原原理理：根根据据噬噬菌菌体体DNADNA分分子子体体内内包包装装的的途途径径，分分别别获获得得缺缺失失D D包包装装蛋蛋白白的的噬噬菌菌体体突突

17、变变株株和和缺缺失失E E包包装装蛋蛋白白的的噬噬菌菌体体突突变变株株。由由于于两两种种突突变变株株均均不不具具有有完完整整的的包包装装蛋蛋白白，都都不不能能单单独独的的包包装装噬噬菌菌体体DNADNA。但但将将两两种种突突变变株株分分别别感感染染大大肠肠杆杆菌菌后后，从从中中提提取取缺缺失失D D蛋蛋白白的的包包装装物物（含含E E蛋蛋白白）和缺失和缺失E E蛋白的包装物（含蛋白的包装物（含D D蛋白），两者混合后就能包装蛋白），两者混合后就能包装噬菌体噬菌体DNADNA。现在学习的是第13页，共39页2.2.重组重组DNADNA分子转入真核细胞分子转入真核细胞 由由于于真真核核生生物物的的

18、细细胞胞结结构构、基基因因组组成成和和基基因因表表达达较较为为复复杂杂，适适用用于于原原核核生生物物的的转转基基因因方方法法大大多多难难以以有有效效的的用用于于真真核核生生物物。但但近近年年来来经经过过摸摸索索，建建立立了了一一系系列列适适用用于于真真核核生生物物的的转转基基因因方方法法，并并用用这这些些方方法法有有效效的的获获得得了了转转基因真核生物。基因真核生物。（1 1）重组）重组DNADNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞农杆菌介导的农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法 农农杆杆菌菌能能侵侵入入植植物物伤伤口口处处细细胞胞中中，其其所所具具有有的的内内源源质质粒粒-Ti-T

19、i质质粒粒的的T-DNAT-DNA能能转转移移至至细细胞胞内内部部。因因此此，将将外外源源基基因因与与TiTi质质粒粒重重组组构构建建载载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。现在学习的是第14页，共39页Fig.4-16 T-DNA can integrated into the genome of plant cell现在学习的是第15页，共39页多聚物介导法多聚物介导法 一一些些多多聚聚物物（聚聚乙乙二二醇醇、多多聚聚赖赖氨氨酸酸、多多聚聚鸟鸟氨氨酸酸等等）和和二二价价阳阳离离子子（CaCa2+2+、MgMg2+2+、MnMn2+2+

20、等等）于于DNADNA混混合合，能能在在原原生生质质体体表表面面形形成成沉沉淀淀颗颗粒粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。电穿孔法电穿孔法 同原核细胞的电穿孔法。同原核细胞的电穿孔法。激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法 利利用用直直径径很很小小，能能量量很很高高的的激激光光微微束束在在细细胞胞膜膜上上造造成成可可逆逆性性微微孔孔，处处于细胞周围的于细胞周围的DNADNA分子随之进入细胞。分子随之进入细胞。超声波介导转化超声波介导转化 超超声声波波处处理理原原生生质质体体，使使其其细细胞胞膜膜上上形形成成可可逆逆性性微微孔孔，使使外外源源

21、DNADNA进入细胞。进入细胞。现在学习的是第16页，共39页基因枪法基因枪法 利利用用高高速速运运行行的的金金属属颗颗粒粒轰轰击击细细胞胞时时能能进进入入细细胞胞，将将包包裹裹在在金金属属颗颗粒粒表面的外源表面的外源DNADNA分子随之带入细胞。分子随之带入细胞。现在学习的是第17页，共39页脂质体介导法脂质体介导法 脂脂质质体体（liposomeliposome）是是由由人人工工构构建建的的磷磷脂脂双双分分子子层层组组成成的的膜膜状状结结构构，可可以以将将DNADNA包包在在其其中中，并并通通过过脂脂质质体体与与原原生生质质体体的的融融合合或或由由于于原原生生质体的吞噬过程，把外源质体的吞

22、噬过程，把外源DNADNA转运到细胞内。转运到细胞内。显微注射法显微注射法 显显微微注注射射法法是是一一种种利利用用显显微微操操作作仪仪，通通过过机机械械的的方方法法把把外外源源DNADNA直直接接注注入入细细胞胞质质或或细细胞胞核核的的基基因因转转移移方方法法。早早期期该该技技术术主主要要用用于于动动物物细细胞胞的的基基因因转转化化等等方方面面，现现在在逐逐步步应应用用到到植植物物细细胞胞的的转转化化操操作作中中，成成为为一一种重要的植物转基因手段。种重要的植物转基因手段。花粉管通道法花粉管通道法 此此法法是是将将外外源源DNADNA涂涂于于授授粉粉的的枝枝头头上上，使使DNADNA沿沿花花

23、粉粉管管通通道道或或传传递递组组织织通通过过珠珠心心进进入入胚胚囊囊，转转化化还还不不具具正正常常细细胞胞壁壁的的卵卵、合合子子及及早早期期的的胚胎细胞。胚胎细胞。现在学习的是第18页，共39页3.3.重组重组DNADNA分子导入哺乳动物细胞分子导入哺乳动物细胞 哺哺乳乳动动物物的的细细胞胞很很难难捕捕获获外外源源DNADNA，这这明明显显影影响响了了哺哺乳乳动动物物基基因因工工程程的的发发展展。近近年年来来通通过过探探索索已已建建立立了了几几种种能能有有效效地地将将外外源源DNADNA导导入入哺哺乳乳动动物物细胞的方法。细胞的方法。病毒颗粒转导法病毒颗粒转导法磷酸钙转染法磷酸钙转染法 哺哺乳

24、乳动动物物的的细细胞胞能能捕捕获获黏黏附附在在细细胞胞表表面面的的DNA-DNA-磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀物物，使使DNADNA转转入细胞。入细胞。DEAE-DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法 二二乙乙胺胺乙乙基基葡葡聚聚糖糖是是一一种种高高分分子子质质量量的的多多聚聚阳阳离离子子试试剂剂，能能促促进哺乳动物细胞捕获外源进哺乳动物细胞捕获外源DNADNA，实现短时间的有效表达。，实现短时间的有效表达。现在学习的是第19页，共39页聚阳离子聚阳离子-DMSO-DMSO转染法转染法 此此方方法法采采用用聚聚阳阳离离子子poly-brenepoly-brene处处理理哺哺乳乳动动物物细细胞胞，增增加加细

25、细胞胞表表面面对对DNADNA的的吸吸附附能能力力，然然后后再再用用25%-30%DMSO25%-30%DMSO短短暂暂处处理理细细胞胞，增增加加膜膜的的通通透透性，提高对性，提高对DNADNA的捕获量。的捕获量。显微注射转基因技术显微注射转基因技术电穿孔电穿孔DNADNA转移技术转移技术脂质体介导法脂质体介导法现在学习的是第20页，共39页活活化化菌菌种种，扩扩大大培培养养，使使其其处处 于于 对对 数数 生生 长长 后后 期期（OD600=0.4）3-4 ml菌液冰水浴中菌液冰水浴中10分钟，分钟，4 离心集菌离心集菌菌菌 体体 悬悬 浮浮 于于 含含CaCl2的的预预冷冷缓缓冲冲液液中中

26、，冰冰水水浴浴15min，4 离离心心集集菌菌，弃弃上上清清，沉沉淀淀物物重重悬悬于于CaCl2的的预预冷冷缓缓冲冲液液中中，4 下下放放置置12-14 h0.2 ml新新制制备备好好的的感感受受细细胞胞中中加加入入缓缓冲冲液液溶溶解解的的重重组组DNA，置置于于冰冰水水浴浴中中1 h以以上上，期间轻摇几次期间轻摇几次转转入入42 水水浴浴上上2 min，使使感感受受态态细细 胞胞 吸吸 收收 重重 组组DNA。转转入入37 水水浴浴上上5 min，加加入入1 ml不不含含选选择择性性药药物物的的LB培养基培养基筛选转化子筛选转化子37 震荡培养震荡培养30-60 min铺板培养铺板培养图图6

27、.1 6.1 感受态细胞的制备及转化感受态细胞的制备及转化现在学习的是第21页，共39页图图6.2 6.2 电穿孔仪及电击杯电穿孔仪及电击杯现在学习的是第22页，共39页图图6.2 6.2 噬菌体的体外包装噬菌体的体外包装现在学习的是第23页，共39页图图6.3 6.3 脂质体转染法脂质体转染法现在学习的是第24页，共39页1 1、传传代代细细胞胞准准备备：细细胞胞在在转转染染前前2424传传代代,待待细细胞胞密密度度达达50%50%60%60%满满底底时时即即可可进进行行转转染染。加加入入沉沉淀淀前前3 34h4h，用，用9ml9ml完全培养液培养细胞。完全培养液培养细胞。2 2、DNADN

28、A沉沉淀淀液液的的准准备备：首首先先将将质质粒粒DNADNA用用乙乙醇醇沉沉淀淀（101050g/10cm50g/10cm平平板板），空空气气中中晾晾干干沉沉淀淀，将将DNADNA沉淀重悬于沉淀重悬于5L5L无菌水中，加无菌水中，加50L 2.5mol/L CaCl50L 2.5mol/L CaCl2 2。3 3、用用巴巴斯斯德德吸吸管管在在500L500L2HeBS2HeBS中中逐逐滴滴加加入入DNA-CaClDNA-CaCl2 2溶溶液液，同同时时用用另另一一吸吸管管吹吹打打溶溶液液，直至直至DNA-CaClDNA-CaCl2 2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续溶液滴完，整个过程需

29、缓慢进行，至少需持续1 12min2min。4 4、室温静置、室温静置30min,30min,出现细小颗粒沉淀。出现细小颗粒沉淀。5 5、将沉淀逐滴均匀加入、将沉淀逐滴均匀加入10cm10cm平板中，轻轻晃动。平板中，轻轻晃动。6 6、在在标标准准生生长长条条件件下下培培养养细细胞胞4 416h16h。除除去去培培养养液液，用用5ml5ml1HeBS1HeBS洗洗细细胞胞2 2次次，加加入入10ml10ml完完全培养液培养细胞。全培养液培养细胞。7 7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。收集细胞或分入培养皿中选择培养。现在学习的是第25页，共39页现在学习的是第26页，共39页第三节第三节 重组

30、子的筛选重组子的筛选 在在重重组组DNADNA分分子子的的转转化化、转转染染或或转转导导过过程程中中，并并非非所所有有的的受受体体细细胞胞都都能能被被导导入入重重组组DNADNA分分子子，一一般般仅仅有有少少数数重重组组DNADNA分分子子能能进进入入受受体体细细胞胞。再再者者，在在这这些些被被转转化化的的受受体体细细胞胞中中，除除部部分分含含有有我我们们期期待待的的DNADNA分分子子外外，另另外外一一些些还还可可能能是是由由于于载载体体自自身身或或一一个个载载体体与与多多个个外外源源DNADNA片片段段形形成成的的非非期期待待重重组组DNADNA分分子子导导入入所所致致。因因此此，需需要要

31、采采取取必必要要的的方方法法将将重重组子从大量的受体细胞中筛选出来。组子从大量的受体细胞中筛选出来。转化子：转化子：导入外源导入外源DNADNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。重组子：重组子：含有重组含有重组DNADNA分子的转化子称为重组子。分子的转化子称为重组子。现在学习的是第27页，共39页阳阳性性克克隆隆子子（期期望望重重组组子子）：含含有有外外源源目目的的基基因因的的重重组组子子称称为为阳性克隆子或期望重组子。阳性克隆子或期望重组子。筛筛选选（选选择择）：经经过过各各种种方方法法将将外外源源DNADNA分分子子导导入入受受体体细细胞胞后后，

32、获获得得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。1.1.遗传表型直接筛选法遗传表型直接筛选法 在在构构建建基基因因工工程程载载体体时时，载载体体DNADNA分分子子上上通通常常携携带带了了一一定定的的选选择择性性遗遗传传标标记记基基因因，转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞后后可可以以使使后后者者呈呈现现出出特特殊殊的的表表型型或遗传学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。或遗传学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。一一般般的的做做法法是是将将转转化化处处理理后后的的菌菌液液（包包括括对对照照处处理理）适适量量涂涂布布在在选选择择培培养

33、养基基上上，在在最最适适生生长长温温度度条条件件下下培培养养一一段段时时间间，观观察察菌菌落落生生长长情情况况，即可挑选出转化子。即可挑选出转化子。现在学习的是第28页，共39页抗药性筛选抗药性筛选 氨氨苄苄青青霉霉素素（AmpAmp）、氯氯霉霉素素（CmpCmp）、卡卡那那霉霉素素（KanKan）、四四环环素素（TetTet）、链霉素（）、链霉素（StrStr）主主要要用用于于重重组组质质粒粒DNADNA分分子子的的转转化化子子的的筛筛选选。在在含含相相应应抗抗生生素素的的培培养基上，含重组质粒的受体菌能存活，不含重组质粒的受体菌不能存活。养基上，含重组质粒的受体菌能存活，不含重组质粒的受体

34、菌不能存活。插入失活筛选法插入失活筛选法 外外源源DNADNA的的插插入入特特定定载载体体后后导导致致遗遗传传标标记记基基因因失失活活，借借此此筛筛选选重重组子。组子。插入表达筛选法插入表达筛选法 与与插插入入失失活活策策略略向向相相反反，插插入入表表达达法法是是利利用用外外源源DNADNA插插入入特特定定载体后导致遗传标记基因表达，借此筛选重组子。载体后导致遗传标记基因表达，借此筛选重组子。现在学习的是第29页，共39页显色互补筛选法显色互补筛选法 LacZLacZ基因的蓝白斑筛选基因的蓝白斑筛选形成嗜菌斑筛选法形成嗜菌斑筛选法 对对于于DNADNA载载体体系系统统，只只有有在在外外源源DN

35、ADNA插插入入载载体体后后，重重组组的的DNADNA分分子子大大小小在在野野生生型型DNADNA分分子子的的7878%-105%-105%范范围围内内时时，才才能能在在体体外外包包装装成成具具有有感感染染能能力力的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。后后者者在在转转导导受受体体菌菌后后，转转化化子子在在培培养养基上被裂解形成嗜菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分。基上被裂解形成嗜菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分。2.DNA2.DNA电泳检测法电泳检测法直接电泳检测法直接电泳检测法 重重组组的的质质粒粒DNADNA分分子子由由于于有有外外源源DNADNA的的插插入入，比比未未插插入入外外源

36、源DNADNA的的质质粒载体大，通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来。粒载体大，通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来。现在学习的是第30页，共39页酶切电泳筛选法酶切电泳筛选法 通通过过直直接接电电泳泳检检测测法法筛筛选选出出来来的的重重组组子子，插插入入的的外外源源DNADNA不不一一定定是是目目的的DNADNA片片段段。通通过过将将重重组组子子中中的的质质粒粒进进行行酶酶切切，然然后后再再进进行行电电泳泳，就可将阳性克隆子筛选出来。就可将阳性克隆子筛选出来。PCRPCR检测法检测法 外外源源DNADNA的的两两侧侧序序列列多多为为已已知知序序列列，通通过过PCRPCR扩扩增增外外源源DNADNA，

37、然然后后对对扩扩增增产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。3.3.核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法4.4.免疫化学检测法免疫化学检测法 基基本本过过程程与与核核酸酸分分子子杂杂交交检检测测法法相相似似，不不同同的的是是该该法法使使用用抗抗体体探探针针，而非而非DNADNA探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提现在学习的是第31页，共39页条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。放射性抗体检测法放射性抗体检测法免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法酶联免疫检测

38、法（酶联免疫检测法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）采采用用非非放放射射性性标标记记物物（辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶、碱碱性性磷磷酸酸酶酶等等）偶偶合合第第二二抗抗体体，然然后后与与目目的的蛋蛋白白抗抗原原-抗抗体体复复合合物物结结合合，通通过过检检测测非非放放射射性性标标记记物物从从而检测到相应的蛋白抗原。而检测到相应的蛋白抗原。5.5.转译筛选法转译筛选法 转转译译筛筛选选法法是是通通过过体体外外转转译译的的手手段段鉴鉴定定阳阳性性克克隆隆的的方方法法，可可分分为为杂杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方法。交抑制转译和杂交选择转译两种检测方

39、法。现在学习的是第32页，共39页杂交抑制转译杂交抑制转译要求：要求：被研究的目的基因编码有丰富的被研究的目的基因编码有丰富的mRNA mRNA。原理：原理：DNADNA蛋白质蛋白质mRNAmRNA蛋白质蛋白质杂交转化菌落转化菌落提取重组提取重组DNA与总与总mRNA杂交杂交形成形成DNA-RNA杂种分子杂种分子将总将总mRNA（包括（包括DNA-RNA分子）提取出来分子）提取出来体外转译体外转译蛋白电泳放射自显影蛋白电泳放射自显影总总mRNA体外转译体外转译蛋白电泳放射自显影蛋白电泳放射自显影经对比，（经对比，（1）比（）比（2）中少）中少了一种蛋白质了一种蛋白质找到一种转译作用被抑制找到一

40、种转译作用被抑制了的了的mRNA 筛选出重组菌落（或噬菌筛选出重组菌落（或噬菌斑）斑）步骤：步骤：（1 1）（2 2）（3 3）现在学习的是第33页，共39页杂交选择转译杂交选择转译重组体库重组体库提取提取DNA固定在固定在NC膜上膜上与与mRNA或总或总RNA杂交杂交目的基因与对应的目的基因与对应的mRNA杂交，杂交，mRNA固定在固定在NC膜上膜上将分离的将分离的mRNA进行体进行体外转译外转译凝胶电泳或生物活性检测凝胶电泳或生物活性检测找出单菌落重组体找出单菌落重组体6.DNA-6.DNA-蛋白质相互作用筛选法蛋白质相互作用筛选法原理：原理：外源外源DNADNA蛋白质蛋白质能与某一能与某

41、一特定特定DNADNA序列结合序列结合作为探针与克隆群体杂交作为探针与克隆群体杂交翻译翻译现在学习的是第34页，共39页克隆载体克隆载体+外源外源DNA受体细胞受体细胞导入导入转化子转化子非转化子非转化子含有克隆载体或外源DNA不含有克隆载体或外源DNA重组子重组子非重组子非重组子仅含有克隆载体含有克隆载体+外源DNA阳性克隆子阳性克隆子含有外源目的DNA非阳性克隆子非阳性克隆子含有外源其他DNA图图6.4 6.4 转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞现在学习的是第35页，共39页滤膜（固定抗体）+图图6.5 6.5 放射性抗体检测法放射性抗体检测法现在学习的是第36页，共39页图图6.6 6.6 放射性抗体检测法放射性抗体检测法现在学习的是第37页，共39页加入目的基因产物的标记抗体转化菌落不含有目的基因含有目的基因涂板培养抗原-抗体反应，菌落周围出现沉淀素图图6.7 6.7 免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法现在学习的是第38页，共39页感谢大家观看现在学习的是第39页，共39页