课题多聚酶链式反应扩增片段.ppt

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1、关于课题多聚酶链式反应扩增片段现在学习的是第1页，共28页脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸AG C T1 1、DNADNA的基本单位的基本单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸一、一、DNADNA分子的结构分子的结构12345O现在学习的是第2页，共28页鸟嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸2、脱氧核苷酸的种类A腺嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸GCT现在学习的是第3页，共28页ATGCAGCT3 3、DNADNA分子的平面结构分子的平面结构氢键氢键氢键氢键5端端3端端5端端3端端现在学习的是第5页，共28页4、DNA的立体结构的立体结

2、构 双螺旋结构双螺旋结构现在学习的是第6页，共28页2 2、时间：、时间：细胞分裂细胞分裂间期间期（有丝（有丝分裂间期分裂间期，减，减数第一次分裂的间期）数第一次分裂的间期）1 1、概念：、概念：以亲代以亲代DNA为模板，根据碱基互补为模板，根据碱基互补配对合成子代在配对合成子代在DNA的过程。的过程。3 3、场所：、场所：主要是细胞核主要是细胞核 （其次是线粒体、叶绿体）（其次是线粒体、叶绿体）二细胞内二细胞内DNADNA复制的过程复制的过程现在学习的是第7页，共28页4 4、条件：条件：模板：模板：亲代亲代DNADNA的两条母链的两条母链 原料：原料：游离的四种脱氧核苷酸游离的四种脱氧核苷

3、酸 能量：能量：ATPATP 酶：酶：解旋酶解旋酶 、DNADNA聚合酶聚合酶 引物：一小段引物：一小段RNARNA，能与，能与DNADNA母链的一段碱基序列母链的一段碱基序列互补配对互补配对5 5、过程、过程（1）解旋：解旋酶）解旋：解旋酶、ATP（2）以）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。补配对规则，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代）子链、母链螺旋构成子代DNA现在学习的是第8页，共28页6、复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向

4、总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸现在学习的是第10页，共28页条件条件组分组分作用作用模板模板DNADNA的两条单链的两条单链提供复制的模板提供复制的模板原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸合成合成DNADNA子链的原料子链的原料酶酶解旋酶解旋酶TaqDNA聚合酶聚合酶不需要不需要催化合成催化合成DNADNA子链子链能量能量ATPATP不需要不需要引物引物一般是一小段一般是一小段DNADNA使使DNADNA聚合酶聚合酶能够从引物能够从引物的的3 3端端开始连接脱氧核苷酸开始连接脱氧核苷酸 1 1、PCRPCR的技术的技术（DNADNA体外复制）的条件体外复制）的条件DNADNA双链双链单链

5、单链变性（加热变性（加热80-10080-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）一、一、PCRPCR的原理的原理（PCRPCR的技术原理）的技术原理）现在学习的是第11页，共28页一、一、PCRPCR的原理的原理（PCRPCR的技术原理）的技术原理）1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸2 2、步骤、步骤：变性变性 复性复性延伸延伸现在学习的是第12页，共28页PCRPCR技术的原理总结技术的原理总结利用利用DNA分子的分子的热变性热变性

6、原理，通过控制原理，通过控制温度温度来来控制双链的控制双链的解旋解旋与与结合，结合，从而完成从而完成体外体外DAN分分子的扩增。子的扩增。体外体外DNADNA复制的条件：复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐四种脱氧核苷酸、耐高温的高温的DNADNA聚合酶、引物、聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。严格控制温度的温控设备。复制的方向：复制的方向：子链的子链的5端向端向 3端延伸。端延伸。现在学习的是第13页，共28页二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/现在学

7、习的是第14页，共28页5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 252530 30 次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNADNA的含量可的含量可的含量可的含量可以扩大以扩大以扩大以扩大100100万（万（万（万（2 22020）倍以上。）倍以上。）倍以上。）倍以上。现在学习的是第15页，共28页每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应

8、，并且作为模板参与反应，并且由引物由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸，的延伸，这这样，样，DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引物处于两个引物之间的之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈指数呈指数扩增。扩增。PCRPCR的反应过程总结的反应过程总结现在学习的是第16页，共28页三、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作1 1 1 1、PCRPCRPCRPCR仪仪仪仪设备及用具设备及用具2 2 2 2、微量离心管、微量离心管、微量离心管、微量离心管一种一种一种一种薄壁塑

9、料管薄壁塑料管薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml3 3 3 3、微量移液器、微量移液器、微量移液器、微量移液器用于用于用于用于定量转移定量转移定量转移定量转移PCRPCRPCRPCR配方中的配方中的配方中的配方中的液体，液体，液体，液体，其上的一次性吸其上的一次性吸其上的一次性吸其上的一次性吸液枪头用一次更换一次液枪头用一次更换一次液枪头用一次更换一次液枪头用一次更换一次实质上一台能够实质上一台能够实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器的仪器的仪器现在学习的是第17页，共28页三

10、、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次

11、第一次94949494C,10minC,10minC,10minC,10min30303030次次次次4444，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次4444，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min现在学习的是第18页，共28页四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定：稀释含量的测定：稀释对照调零对照调零测定测定计算（公式见计算（公式见P63）波长波长260nm处处读数读数蒸馏水蒸馏水做

12、对照做对照50倍倍现在学习的是第19页，共28页（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算四、四、课题成果评价课题成果评价1 1、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2 n n2 2、a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a x2 a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1、原理原理可以通过测量可以通过测量DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与D

13、NADNA的含量有关的含量有关现在学习的是第20页，共28页2 2、过程过程稀释稀释稀释稀释2 2 2 2LL PCRPCRPCRPCR反应液，加入反应液，加入反应液，加入反应液，加入98989898LL蒸馏水，即将样品进行蒸馏水，即将样品进行蒸馏水，即将样品进行蒸馏水，即将样品进行50505050倍稀释倍稀释倍稀释倍稀释对照调零对照调零对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm260nm260nm处，将紫外分光光处，将紫外分光光处，将紫外分光光处，将紫外分光光度计的读数调节至零度计的读数

14、调节至零度计的读数调节至零度计的读数调节至零取取取取DNADNADNADNA稀释液稀释液稀释液稀释液100100100100LL至比色杯中，测定至比色杯中，测定至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm260nm260nm处的光吸收处的光吸收处的光吸收处的光吸收值值值值测定测定并并计算计算计算计算DNADNADNADNA含量（含量（含量（含量（g g g g/mL/mL/mL/mL）50505050(260nm(260nm(260nm(260nm的读数的读数的读数的读数)稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数现在学习的是第21页，共28页5050：在厚度为在厚度为1cm比色杯中的吸光值为比

15、色杯中的吸光值为1,DNA 的含量为的含量为5050 g g/ml/ml的的现在学习的是第22页，共28页体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细胞在解旋酶作用下，细胞提供提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全部双链全部解开，不需解旋酶解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋边半保

16、留复制，边解旋边复制，多起点复制。复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的5 5端向端向 3 3端端延伸延伸子链的子链的5 5端向端向 3 3端延伸端延伸现在学习的是第23页，共28页课堂小结课堂小结多多聚聚酶酶链链式式反反应应扩扩增增DNA片片段段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管

17、放入放入PCR仪仪仪仪设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算现在学习的是第24页，共28页练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测序列测定定现在学习的是第25页，共28页2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端的合成方向总是从子链

18、的哪一端向哪一端延伸？向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸现在学习的是第26页，共28页4、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A 反复洗涤反复洗涤 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高压灭菌高压灭菌 D 在在20 储存储存现在学习的是第27页，共28页感谢大家观看现在学习的是第28页，共28页