基因编辑技术的概念和原理PPT讲稿.ppt

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1、基因编辑技术的概念和原基因编辑技术的概念和原理理第1页，共40页，编辑于2022年，星期六什么是基因编辑技术？什么是基因编辑技术？基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。第2页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑的研究背景基因编辑的研究背景传统的动物育种方法受到种源的限制，其程需要耗费大量的人力、物力和财力，经历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难，育种成果很难取得突破性进展。第3页，共40页，编

2、辑于2022年，星期六基因编辑的研究背景基因编辑的研究背景现代动物分子育种中，分子标记技术能够定位与经济性状现代动物分子育种中，分子标记技术能够定位与经济性状相关的分子标记，锁定基因与性状的对应关系，从而快相关的分子标记，锁定基因与性状的对应关系，从而快捷可靠地对动物后代进行筛选。但是，利用分子标记技捷可靠地对动物后代进行筛选。但是，利用分子标记技术辅助筛选，改良的程度依然受限于品种自身已有的基术辅助筛选，改良的程度依然受限于品种自身已有的基因。因。所以，利用基因工程技术进行品种改良，可以突破种源所以，利用基因工程技术进行品种改良，可以突破种源的限制及种间杂交的瓶颈，获取新品种，因此分子育的限

3、制及种间杂交的瓶颈，获取新品种，因此分子育种更为本质和直接。种更为本质和直接。第4页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑的研究背景基因编辑的研究背景目前，获得突变体的常见方法是利用T-DNA 或转座子构建大规模的随机插入突变体库，但是构建覆盖全基因组的饱和突变体库需要的工作量大且耗费的时间长。而通过定点突变的方法使目的基因完全失活，是一种最直接有效的研究特定基因功能的方法。第5页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑的研究背景基因编辑的研究背景近年来，随着高特异性及更具操作性的人工核酸酶的出现和技术体系的完善，基因组编辑技术获得了飞速发展，并将靶向基因操作推向高潮，使得定点基因敲

4、除、敲入变得更为简单且高效。第6页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑的优势基因编辑的优势与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。第7页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑原理基因编辑原理现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂(DNA double-strand breaks DSBs)激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)两条途径。第8页，共40页

5、，编辑于2022年，星期六基因编辑原理基因编辑原理非同源末端连接非同源末端连接（NHEJ）是一种低保真度的修复过是一种低保真度的修复过程，断裂的程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ NHEJ 机制会将其连入双链断裂DSB DSB 位点，从而实现位点，从而实现定点的基因敲入定点的基因敲入。第9页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑原理基因编辑原理同源重组修复修复（HR）是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情

6、况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因的替换。第10页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑原理基因编辑原理第11页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑技术的种类基因编辑技术的种类目前主要有 3 种基因编辑技术，分别为：n n人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)技术；n n转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)

7、技术；n nRNA 引导的 CRISPR-Cas 核酸酶技术(CRISPR-Cas RGNs)。第12页，共40页，编辑于2022年，星期六1.ZFN 基因组编辑技术基因组编辑技术ZFN ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的于具有独特的DNADNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。序列识别的锌指蛋白发展起来的。19861986年年Diakun Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的等首先在真核生物转录因子家族的 DNA DNA 结结合区域发现了合区域发现了Cys2-His2Cys2-His2锌指模块，到锌指模块，到199

8、61996年，年，KimKim等首次人等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。20052005年，年，UrnovUrnov等发现等发现一对由一对由4 4个锌指连接而成的个锌指连接而成的ZFNZFN可识别可识别24 bp24 bp的特异性序列，的特异性序列，由此揭开了由此揭开了ZFNZFN在基因组编辑中的应用。在基因组编辑中的应用。第13页，共40页，编辑于2022年，星期六ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 Fok核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由Fok构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(

9、DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。第14页，共40页，编辑于2022年，星期六ZFN ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和以现有的策略设计高亲和性的性的 ZFN，需要投入大量的工作和时间需要

10、投入大量的工作和时间;(2);(2)在细胞中持在细胞中持续表达续表达 ZFN ZFN 对细胞有毒性;(3);(3)虽然三联体设计具有一虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。第15页，共40页，编辑于2022年，星期六2.TALEN 基因组编辑技术基因组编辑技术2009 2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)(Xanthomonas)中发现中发现一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨基酸一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒

11、定的对应关系。随后，序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。随后，TALETALE特异识别特异识别 DNA DNA 序列的特性被用来取代序列的特性被用来取代 ZFN ZFN技术中技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比具备比ZFN ZFN 更广阔的应用潜力。更广阔的应用潜力。第16页，共40页，编辑于2022年，星期六TALENs 包含两个 TALEN 蛋白,每个 TALEN 都是由 TALE array 与 Fok融合而成.其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点,另一个则靶向反义链上的靶标位点.然后 Fok形成二聚体

12、,在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA,造成双链 DNA 断裂,随后细胞启动 DNA 损伤修复机制.针对不同的TALEN 骨架,其最适宜的spacer长度不同,其长度范围一般为1220 bp.实验结果表明,TALENs在靶向DNA时,第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。第17页，共40页，编辑于2022年，星期六目前，TALEN 已经成功应用于酵母、哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶，与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势，但仍然有些问题需要解决，例如:脱靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等。第18页，共40页，编辑于2022年，星期六3.CRISPR/

13、Cas9 基因组编辑技术基因组编辑技术19871987年，年，Ishino Ishino 等在等在K12K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重复序列广泛发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十年的研究，在存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十年的研究，在20072007年终于证明这种重复序列与细菌获得性免疫的关系。年终于证明这种重复序列与细菌获得性免疫的关系。第19页，共40页，编辑于2022年，星期六在这个系统中，只凭借一段在这个系统中，只凭借一段 RNA RNA 便能识别外来基因

14、并将其降便能识别外来基因并将其降解的功能蛋白引起了研究者的兴趣。直到解的功能蛋白引起了研究者的兴趣。直到2012 2012 年，年，Jinek Jinek 等等第一次在体外系统中第一次在体外系统中CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 为一种可编辑的短为一种可编辑的短RNA RNA 介导的介导的DNADNA核酸内切酶，标志着核酸内切酶，标志着 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 基因组编基因组编辑技术成功问世。辑技术成功问世。3.CRISPR/Cas9 基因组编辑技术第20页，共40页，编辑于2022年，星期六CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构

15、成.转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体,指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂,并启动 DNA 损伤修复机制.从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统,其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同,PAM 序列也可能不同。第21页，共40页，编辑于2022年，星期六三种不同技术的比较三种不同技术的比较第22页，共40页，编辑于2022年，星期六续表续表第23页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑新技术的用途基因编辑新技术的用途n n基因功能研究n n基因治疗n n

16、构建模式动物n n改造和培育新品种第24页，共40页，编辑于2022年，星期六1.基因功能研究基因功能研究基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻辑环节，但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES 细胞筛选、嵌合体动物模型选育等一系列步骤，成功率受到多方面因素的限制。第25页，共40页，编辑于2022年，星期六1.基因功能研究基因功能研究即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术敲除大鼠或小鼠身上的某个基因一般也需要 1 年以上。基因编辑新技术则不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。第26页，共40页，编辑于2022年，星期六1.基因功能研究基因功能研究ZFN 技

17、术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草 等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变，其中在果蝇、斑马鱼、大鼠等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。第27页，共40页，编辑于2022年，星期六1.基因功能研究基因功能研究2009 年，威斯康辛医学院、Sangamo Biosciences、Sigma-Aldrich 等多家机构使用 ZFN 技术，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且带有该突变的大鼠所生育的后代同样带有该基因突变。第28页，共40

18、页，编辑于2022年，星期六2.基因治疗基因治疗传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细胞中替代有缺陷的基因，但这种方法难以精准控制，可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以精确定位，在靶位点进行修正或进行基因切除，达到基因治疗的目的。第29页，共40页，编辑于2022年，星期六2.基因治疗基因治疗Bacman 等人利用 TALEN 技术清除了来自于病人线粒体内的有病 DNA。这是 TALEN 首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗母系遗传的线粒体病。第30页，共40页，编辑于2022年，星期六2.基因治疗基因治疗Li 等人利用 ZFN 技术能在染色体上精确定位的优势，通过“剪切”和

19、“粘贴”基因，在实验小鼠体内实现了血友病治疗，避免了传统基因疗法带来的插入诱变风险，首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。第31页，共40页，编辑于2022年，星期六3.构建模式动物构建模式动物根据人类疾病所构建的动物模型，对研究这些疾病的发生及其治疗有着重要意义。基因打靶技术是在 ES 和同源重组技术的基础上发展起来的，模型构建耗时长、成本高，且模式动物的选择受到 ES 细胞的限制。第32页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑新技术不受 ES 细胞的限制，效率高，速度快，且定点编辑更加精确，可在多种细胞及生物体的特定位点进行切割和修饰。构建转基因小鼠第一人 Jaenisch 与其同

20、事最近利用 CRISPR-Cas 系统又构建了携带特异性突变的小鼠模型。3.构建模式动物第33页，共40页，编辑于2022年，星期六4.改造和培育新品种改造和培育新品种传统的改造动植物品种的转基因技术是将外源 DNA 片段插入受体的基因组中，改造基因功能，使其表达优良的性状，获得人类需要的品种。基因编辑技术则可以进行定点修饰，达到高效定向。第34页，共40页，编辑于2022年，星期六n nShukla 等对玉米进行肌醇磷酸激酶 1(inositol 1(inositol phosphate kinase 1phosphate kinase 1，IPK1)IPK1)基因的修饰，使其对除草剂的耐性

21、增强，在发育的种子中肌醇磷酸盐表达谱也发生了与预期一样的改变。n nTownsendTownsend等以烟草中的丙酮醇合酶等以烟草中的丙酮醇合酶(acetolactate(acetolactate synthase)synthase)基因 SuRSuR(SuRA和SuRB)SuRB)位点为靶标，育成了对咪唑啉酮(imidazolinone)除草剂和对磺脲除草剂和对磺脲(sulphonylurea)(sulphonylurea)除草剂都有抵抗力的新品种。除草剂都有抵抗力的新品种。第35页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑的不足基因编辑的不足基因编辑是一项新技术，还存在构建复杂和价格的问

22、题，其脱靶效应限制了其在基因治疗等应用上的发展。第36页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑技术的展望基因编辑技术的展望随着越来越多物种基因组测序的完成，基因功能的研随着越来越多物种基因组测序的完成，基因功能的研究成为后基因时代的重点。基因编辑技术既可以用正究成为后基因时代的重点。基因编辑技术既可以用正常基因替代突变基因进行性状改良和基因治疗，也可常基因替代突变基因进行性状改良和基因治疗，也可以用突变基因代替正常基因进行基因功能的研究。以用突变基因代替正常基因进行基因功能的研究。第37页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑技术的展望基因编辑技术的展望与传统的基因打靶技术相比，基

23、因编辑技术摆脱了对 ES ES 细胞的限制，可以应用于更多的物种，且定向细胞的限制，可以应用于更多的物种，且定向修饰更加精确，效率更高，所需时间更短修饰更加精确，效率更高，所需时间更短,得到的突变得到的突变可以通过种系遗传可以通过种系遗传.其中，CRISPRCRISPR 系统可以同时进行多靶点的切割，易于得到纯合子突变体。第38页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑技术的展望基因编辑技术的展望基因组编辑技术对应的友好位点的选择，多基因连接策略，表达调控策略等配套的技术体系正在形成，为今后大规模，多基因的动物改良奠定了基础。更多基因组编辑畜禽的出现会给畜牧业经济，人类营养水平和生活质量带来革命性地影响。可以预见，以基因组编辑技术为核心的现代生物技术产业将进入黄金时期。第39页，共40页，编辑于2022年，星期六基因编辑技术的展望基因编辑技术的展望总之，基因编辑技术的研发还处于起步阶段，但其已表现出的相对于基因打靶技术的优势已十分明显。在未来的发展中，基因编辑技术必将成为生命科学和生物医学等领域研究与应用的重要工具。第40页，共40页，编辑于2022年，星期六