基因工程核酸的提取与纯化PPT讲稿.ppt

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1、基因工程核酸的提取与纯化第1页，共93页，编辑于2022年，星期六很多时候，基因工程学家有必要准备至少3种不同种类的DNA。首先-全细胞DNA：作为提取所需克隆基因的材料来源，是必须得到的。作为提取所需克隆基因的材料来源，是必须得到的。全细胞全细胞DNADNA可以从细菌培养物、植物、动物细胞可以从细菌培养物、植物、动物细胞或其他任何用作研究的生物中获取。或其他任何用作研究的生物中获取。第2页，共93页，编辑于2022年，星期六第二种-纯净的质粒DNA：从细菌中制备质粒从细菌中制备质粒DNADNA与纯化细胞总与纯化细胞总DNADNA遵循基本相同遵循基本相同的步骤，只是在某个阶段有着一些明显的差别

2、。的步骤，只是在某个阶段有着一些明显的差别。在这个阶段内，质粒在这个阶段内，质粒DNADNA必须从细胞中的主要染色体必须从细胞中的主要染色体DNADNA中分离出来，同时主要染色体中分离出来，同时主要染色体DNADNA仍然要保留在仍然要保留在细胞中。细胞中。第3页，共93页，编辑于2022年，星期六最后，如果用噬菌体克隆载体，需要制备噬菌体DNA。噬菌体噬菌体DNADNA一般都是从噬菌体颗粒中制得，不从被侵染细一般都是从噬菌体颗粒中制得，不从被侵染细胞中制得，因此不存在被细菌胞中制得，因此不存在被细菌DNADNA污染的问题。污染的问题。但在除去噬菌体衣壳过程中需要用到专门技术。但在除去噬菌体衣壳

3、过程中需要用到专门技术。一个例外：一个例外：M13M13噬菌体的双链复制模式，噬菌体的双链复制模式，像细菌质粒一样，像细菌质粒一样，M13M13噬菌体噬菌体DNADNA也能够从被侵染的大肠杆也能够从被侵染的大肠杆菌中获得。菌中获得。第4页，共93页，编辑于2022年，星期六1 1 全细胞全细胞DNADNA的制备的制备制备细菌细胞的制备细菌细胞的全部全部DNADNA时，用的是最简单的时，用的是最简单的DNADNA纯化步骤。纯化步骤。步骤分为步骤分为4 4个阶段：个阶段：(1)(1)培养细胞的生长和收集。培养细胞的生长和收集。(2)(2)细胞被破碎并释放出内含物。细胞被破碎并释放出内含物。(3)(

4、3)细胞抽提物被除去细胞抽提物被除去DNADNA外的所有成分。外的所有成分。(4)(4)得到的得到的DNADNA溶液被浓缩。溶液被浓缩。第5页，共93页，编辑于2022年，星期六第6页，共93页，编辑于2022年，星期六1.1 1.1 细菌培养物的生长和收集细菌培养物的生长和收集让绝大多数细菌在液体培养基让绝大多数细菌在液体培养基 肉汤培养基肉汤培养基 中生长中生长起来并不困难。起来并不困难。培养基必须能够提供一个基本营养物的混合平衡培养基必须能够提供一个基本营养物的混合平衡体系，而每种基本营养成分的浓度应该能够保体系，而每种基本营养成分的浓度应该能够保证细菌有效的生长和繁殖。证细菌有效的生长

5、和繁殖。在在M9M9和和LBLB是两种典型的培养基。是两种典型的培养基。第7页，共93页，编辑于2022年，星期六M9培养基M9是一种典型的确定成分培养基，其中所有成分都是可知的。无机营养成分的混合物：提供基本元素，如氮、镁和钙葡萄糖：提供碳源和能量。实际上，额外的生长因子如微量元素和维生素也必须加入M9中以维持细菌生长。需准确添加何种补充成分要视具体情况而定。第8页，共93页，编辑于2022年，星期六LB培养基一种更加复杂的一种更加复杂的不确定成分培养基不确定成分培养基，即即LBLB包含的成分及成分含量都是未知的。包含的成分及成分含量都是未知的。因为两种主要成分：胰蛋白胨和酵母提取物，本身就

6、是不确定因为两种主要成分：胰蛋白胨和酵母提取物，本身就是不确定化学成分的复杂混合物。化学成分的复杂混合物。胰蛋白胨胰蛋白胨：提供氨基酸以及小的肽段；：提供氨基酸以及小的肽段；酵母提取物酵母提取物(酵母细胞部分消化后的干粉酵母细胞部分消化后的干粉)：提供氮源、糖类以及：提供氮源、糖类以及其他有机和无机营养。其他有机和无机营养。类似类似LBLB的混合培养基的混合培养基并不需要另外再补充成分并不需要另外再补充成分，并能够维持种类范，并能够维持种类范围很广的细菌生长。围很广的细菌生长。第9页，共93页，编辑于2022年，星期六当细菌培养物需要在严格准确的条件控制下生长时，必须应用确定成分培养基。当培养

7、物仅仅作为一种DNA的来源时，更适用混合培养基。在37、LB培养基、150-250r/min旋转条件下大肠杆菌细胞大约每20min分裂一次，直到达到了约2109-3109个ml的最大密度。培养物的生长状况能够通过读取600nm可见光分光光度值(OD值)来进行监测(图3-2)，在该波长下每个单位的OD值相当于0.8109个ml。第10页，共93页，编辑于2022年，星期六第11页，共93页，编辑于2022年，星期六为了便于获得细胞的提取物，细菌必须尽在可能小的体积中被获得，因此需要在离心机中对培养物进行离心以收集细胞(图3-3)。较低的离心转速就能够使细菌在离心管底部聚集，上层的培养基能够很容易

8、倒出。1000ml培养基中获得的最大密度的细菌能够通过离心后再次悬浮在不到10ml的液体中。第12页，共93页，编辑于2022年，星期六第13页，共93页，编辑于2022年，星期六1.2 细胞提取物的制备释放细胞内含物之前必须去除:细胞膜；坚固的细胞壁；特殊细菌(含E.coli)细胞壁外第二层外膜。裂解细菌细胞的技术大体分为两种：物理方法和化学方法。第14页，共93页，编辑于2022年，星期六物理方法：以机械力的方法打破细胞外的屏障；化学方法：将细胞暴露在能够对细胞整体结构产生影响的化学药物中。以制备DNA为目的进行细胞破碎时，化学方法的使用更加广泛。第15页，共93页，编辑于2022年，星期

9、六化学方法包括：一种能够攻击细胞壁的成分 一种能够除去细胞膜的成分图3-4(a)。所用的化学物质通常视细菌的种类而定。削弱细胞壁：溶菌酶；乙二胺四乙酸盐(EDTA)；或两者相结合。常用于：大肠杆菌和相关的菌第16页，共93页，编辑于2022年，星期六溶菌酶：存在于鸡蛋清、一些分泌物如眼泪和唾液。能够消化赋予细胞壁坚固性的多聚混合物。EDTA：通过螯合除去钙离子（保持整个细胞壁结构必不可少）；抑制细胞质中降解DNA的酶。第17页，共93页，编辑于2022年，星期六某些条件下，用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁足以导致细胞破裂，但通常还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠(SDS)。去垢剂：通过移除液体分

10、子并导致细胞膜破裂，协助了整个细胞外壁的溶解过程。第18页，共93页，编辑于2022年，星期六溶解细胞、制备细胞提取物的最后一步：细胞内不溶性残渣的去除。方法：离心底部：部分消化的细胞壁碎片等成分上清：细胞提取物第19页，共93页，编辑于2022年，星期六第20页，共93页，编辑于2022年，星期六1.3 从细胞提取物中纯化DNA细菌提取物包含：DNA;大量的蛋白质和RNA（属于多余成分）。去蛋白质的标准方法：加入苯酚;或1:1的苯酚与氯仿的混合物。原理：能沉淀出蛋白质但仍保留核酸(DNA和RNA)在水溶液中。第21页，共93页，编辑于2022年，星期六结果：如果细胞提取物和有机溶剂逐渐混合并

11、离心后，沉淀出的蛋白质分子会聚集在水溶液和有机溶剂分层的两相界面处形成白色的凝集物(图3-5)。所以：水溶液中的核酸分子就能够用吸管分离出来。第22页，共93页，编辑于2022年，星期六第23页，共93页，编辑于2022年，星期六有时单独使用苯酚不足以彻底去掉蛋白、纯化核酸。解决方法：通过连续多次苯酚提取但不理想。因为：每进行一次混合和离心都会导致一定数量的DNA分子断裂。正确的处理办法：苯酚提取前，先用蛋白酶对细胞提取物进行处理，比如链霉蛋白酶或蛋白酶K。这些酶将肽段降解成更小单元，便于苯酚提取。第24页，共93页，编辑于2022年，星期六一些RNA分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过程中被

12、除去，但是绝大多数的RNA都和DNA一起保留在水溶液中。最有效的除去RNA的方法：使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子，把它们变成核苷酸单元。第25页，共93页，编辑于2022年，星期六1.4 DNA样品的浓缩最常用：乙醇沉淀。在盐(严格来说是单价阳离子如钠离子)存在下，无水乙醇在-20或以下能够有效地使多聚核苷酸沉淀。乙醇沉淀法的额外优点是将短链和单体核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶处理产生的核苷酸因此在这一步得到了去除。第26页，共93页，编辑于2022年，星期六对于浓的DNA溶液，乙醇能够在样品的上方形成一个分层，使得核酸分子在两相界面处沉淀出来。一个技巧：将一根玻璃棒穿过乙醇层伸入

13、核酸溶液中。当棒子被取出的时候，DNA分子就会呈纤维状黏附在棒上面而从溶液中取出。当乙醇和DNA溶液混合时，DNA沉淀能够通过离心得到，并随后能溶解在合适量的水中。第27页，共93页，编辑于2022年，星期六第28页，共93页，编辑于2022年，星期六1.5 DNA浓度的测量在实施基因克隆实验时，确切知道溶液中的DNA含量是十分关键的。DNA浓度能够通过紫外吸收分光光度测定法进行测定。被DNA溶液吸收的紫外线的量能够直接正比于样品溶液中的DNA含量。通常吸收量在260nm被测定，1.0的吸收值对应于每毫升中50g双链DNA。第29页，共93页，编辑于2022年，星期六紫外吸收还被用来检测DNA

14、的纯度。纯净的DNA样品，在波长260nm和280nm的吸收量之比(A260A280)应为1.8。如果实际测量时比例小于1.8，表示样品被蛋白质或苯酚污染。第30页，共93页，编辑于2022年，星期六1.6 从细菌外的生物体制备全细胞DNA尽管各种来源细胞DNA的纯化基本步骤不变，但要考虑所用细胞的一些特性，并对实验步骤加以调整。主要的调整发生在细胞破碎阶段。破碎细菌时所使用的化学药物对其他生物细胞并不总是适用。比如，溶菌酶对植物细胞就毫无作用。专一性的降解酶对绝大多数的细胞壁都适用，通常一些物理方法，如用研钵对冷冻材料研磨更有效。绝大多数动物细胞仅用去垢剂处理就能够去掉外被。第31页，共93

15、页，编辑于2022年，星期六需要着重考虑：需要提取DNA的细胞的生化成分。细菌：主要的细胞提取物是蛋白质、DNA和RNA。苯酚提取或蛋白酶降解，核糖核酸酶分解RNA，就能得到纯净的DNA样品。如果细胞中还包含大量的其他生化成分，这些处理就显得不足以制得纯净的DNA。植物组织的处理尤其困难，因为它们经常含有大量的碳水化合物，这些碳水化合物不能够通过苯酚提取而除去，所以需要使用一些不同的方法。第32页，共93页，编辑于2022年，星期六染色体染色体细菌细菌33004200kb酵母酵母15,000kb果蝇果蝇1.28x105kb人人3x106kb植物植物2x1051x108kb天花病毒天花病毒288

16、kb痘病毒痘病毒196kb质体质体几几100以上以上kb线粒体线粒体藻类藻类线状线状15kb酵母酵母环状环状1978kb植物植物环状环状100150kb动物动物(扁虫到人扁虫到人)环状环状1518kb锥虫锥虫网状网状6000kb(幼体幼体)短膜虫短膜虫网状网状30,000kb(幼体幼体)(Kinetoplast）叶绿体叶绿体双子叶植物双子叶植物121（菠菜）（菠菜）154kb（豌豆）（豌豆）单子叶植物单子叶植物151（玉米）（玉米）182kb（浮萍）（浮萍）藻类藻类132（裸藻）（裸藻）191kb（衣藻）（衣藻）第33页，共93页，编辑于2022年，星期六2 2 质粒质粒DNADNA的制备的制

17、备从细菌中纯化质粒和全细胞DNA的制备一样，具有相同的一般方法：含质粒的细胞培养物，在液体培养基中生长；细菌被收集，制成细胞提取物。细胞提取物被除掉蛋白质和RNA，DNA则利用乙醇沉淀法尽可能进行浓缩。第34页，共93页，编辑于2022年，星期六在质粒制备过程中，通常需要从同处于细胞中、大量的细菌染色体DNA中分离出含量相对较少的质粒DNA。分离这两种不同类型的DNA是十分困难的。在基因克隆实验过程中，即使存在极小量的杂质细菌DNA，也很容易导致结果不理想。分离方法的原理：质粒DNA与细菌DNA物理性质上的一些差异，其中最明显的是分子大小。最大的质粒是大肠杆菌染色体的8，绝大多数质粒远远小于它

18、。第35页，共93页，编辑于2022年，星期六质粒DNA与细菌DNA在构造上也有不同。质粒和细菌染色体是环状分子，但在细胞提取物的制备过程中染色体通常断裂形成线状的片段。因此可以用从线状DNA分子中分离出环状DNA分子的方法用来纯化质粒。第36页，共93页，编辑于2022年，星期六2.1 基于分子大小的分离通常出现在细胞提取物的制备过程这一阶段。如果细胞在非常仔细控制的条件下溶解，就能够保证只有很少量的染色体DNA碎片出现。这样得到的DNA片段仍然很大-远远大于质粒-能够通过离心与细胞残存物一同被清除。这一过程因为细菌染色体通常都贴附在细胞外壁上而变得容易，如果这种贴附不断裂，染色体片段就会与

19、细胞残存物一同沉淀出来。第37页，共93页，编辑于2022年，星期六细胞裂解必须进行得非常小心谨慎，以防止细菌DNA的大规模断裂。在蔗糖存在时用EDTA和溶菌酶进行处理，可以防止细胞的立刻破裂。接下来，细胞壁被部分瓦解后形成原生质球粒体，但是细胞质膜仍然完好无损。现在细胞溶解将受到非离子去垢剂如Triton-100(这是因为离子去垢剂如SDS，会引起染色体断裂)的诱导，因此离心后的裂解上清中，包含有几乎全部的质粒DNA。澄清溶菌液也不可避免残存一些染色体DNA。而且，如果质粒本身就是大分子，它们本身也有可能与细胞残留物一起沉淀出来。因此利用分子大小分离DNA本身并不十分有效。第38页，共93页

20、，编辑于2022年，星期六第39页，共93页，编辑于2022年，星期六2.2 基于构造的分离把质粒DNA描述成环状分子构象不准确.因为所谓的双链DNA环实际上能分为两种截然不同的构象。绝大多数质粒都是以超螺旋分子的形式存在于细胞中。超螺旋的发生是因为在质粒复制过程中在被称作拓扑异构酶的作用下，质粒DNA双螺旋的部分松散造成的。超螺旋构象只有在两条多聚核苷酸链都完好无缺的条件下才能够保持，从而也被命名为共价闭合环状DNA。第40页，共93页，编辑于2022年，星期六如果其中一条多聚核苷酸链断裂，双螺旋就会回复其正常的松弛状态，质粒就会因此转变成另外一种构象，称作开环结构。因为超螺旋分子很容易同其

21、他非超螺旋DNA分子相分离，故超螺旋构象在质粒制备中非常重要。有两种不同的方法被用于从细胞粗提物中纯化质粒DNA.如果一开始能够制得澄清溶菌液，会获得更好的结果。第41页，共93页，编辑于2022年，星期六如果其中一条多聚核苷酸链断裂，双螺旋就会回复其正常的松弛状态，质粒就会因此转变成另外一种构象，称作开环结构。因为超螺旋分子很容易同其他非超螺旋DNA分子相分离，故超螺旋构象在质粒制备中非常重要。在这里，有两种不同的方法常常被用到，它们都能够用于从细胞粗提物中纯化质粒DNA，当然如果一开始能够制得澄清溶菌液，会获得更好的结果。第42页，共93页，编辑于2022年，星期六第43页，共93页，编辑

22、于2022年，星期六碱变性原理：在一个窄的pH范围内非超螺旋DNA被变性，而超螺旋质粒DNA不发生变性。如果氢氧化钠被加入细胞提取液或澄清溶菌液中，pH被调整到12.0-12.5的范围内，连接非超螺旋DNA分子的氢键被打破，导致双螺旋松解，两条核酸链相互分离(图3-11)。如果此时加入酸，变性细菌DNA链会杂乱地聚集成一堆。这些不溶的交联网状物质会被离心除去，只剩下纯净的质粒DNA在悬液中。第44页，共93页，编辑于2022年，星期六这一处理方法的额外优点:在某些环境下(尤其是利用SDS溶解细胞以及醋酸盐中和溶液时)，绝大多数蛋白质和RNA也变成不溶物并在离心的步骤中被除去。因此如果使用碱变性

23、的方法，苯酚提取和核糖核酸酶的处理就没有必要了。第45页，共93页，编辑于2022年，星期六第46页，共93页，编辑于2022年，星期六溴乙锭-氯化铯密度梯度离心这是平衡与密度梯度离心中一个专门的分支。密度梯度是通过在非常高的转速下对氯化铯溶液进行离心而得到的图3-12(a)。梯度的产生是因为在强的离心力的作用下，铯离子和氯离子被推到了离心管的底部。这些离子在向下迁移过程中通过扩散达到了平衡态，这样自上而下氯化铯密度不断升高的浓度梯度就建立起来了。第47页，共93页，编辑于2022年，星期六氯化铯溶液中的大分子在离心过程中会在不同的梯度位置形成条带图3-12(a)。一个特定分子形成条带的确切位

24、置取决于它的浮力密度：DNA的浮力密度约为1.7g/cm3，因此在离心过程中，DNA分子会迁移到氯化铯密度为1.7g/cm3的梯度位置。相反，蛋白质分子的浮力密度要低得多，因此离心后会浮在离心管中靠上的位置.RNA因为浮力密度最大沉在离心管的最底部图3-12(b)。因此密度梯度离心能够分离DNA，RNA、蛋白质，并且能够代替苯酚提取和核糖核酸酶处理来对DNA进行纯化。第48页，共93页，编辑于2022年，星期六第49页，共93页，编辑于2022年，星期六更重要的是，密度梯度离心在溴乙锭(EtBr)存在下能够用来从非超螺旋分子中分离超螺旋DNA。溴乙锭通过插入两个相邻的碱基对而结合在DNA分子上

25、，导致双螺旋的部分松解图3-13。这种松解又会导致浮力密度的降低，对于线形DNA分子来说大约会降低0.125g/cm3。而超螺旋DNA不存在游离端，几乎不可能发生松解，因此只能够结合有限量的EtBr。所以超螺旋分子的浮力密度降低会小一些，大约会降低0.085g/cm3。第50页，共93页，编辑于2022年，星期六所以，超螺旋分子在溴乙锭-氯化铯密度梯度中形成的条带，与线形和开链DNA所形成的不在同一位置图3-14(a)。第51页，共93页，编辑于2022年，星期六第52页，共93页，编辑于2022年，星期六第53页，共93页，编辑于2022年，星期六溴乙锭-氯化铯密度梯度离心处理澄清溶菌液时：

26、质粒DNA会在不同于线形细菌DNA的位置形成条带；蛋白质带悬浮在离心管的顶部；RNA沉降在离心管的底部。第54页，共93页，编辑于2022年，星期六因为EtBr上连接有荧光示踪剂，DNA条带的位置能够通过将紫外光照射在离心管上而被看见。纯净质粒DNA可以通过穿透离心管的一侧并利用注射器吸出样品的方法被分离出来。附着在质粒DNA上的EtBr可以用正丁醇萃取出来，而氯化铯则可以用透析的方法除去。最终得到的质粒制备物纯度实际上达到了100，从而可以用作克隆载体。第55页，共93页，编辑于2022年，星期六2.3 质粒扩增质粒DNA的制备会受到一个无法回避的事实的影响，那就是质粒仅仅占细菌细胞全部DN

27、A的很小一部分。因此从细菌培养物中获得的质粒DNA令人失望地少。质粒扩增能够提供一种增加DNA产量的方法。扩增的目的就是增加质粒的拷贝数量。某些多拷贝质粒(那些拷贝数超过20个的质粒)具有能够在不进行蛋白质合成的情况下进行复制的能力。这和细菌的主要染色体复制形成了鲜明的对照，因为细菌染色体在不同时进行蛋白质合成情况下是无法进行复制的。第56页，共93页，编辑于2022年，星期六培养含目的质粒DNA的细菌的过程中，可以利用这一特点。在细胞的密度达到了令人满意的程度后，一种蛋白质合成抑制物(例如氯霉素)被加入培养物中，并继续进行培养超过12h。这一期间，质粒分子持续复制，而与此同时染色体的复制和细

28、胞分裂却被阻断。得到的质粒的拷贝数增加到了上千个。由此可见，扩增是一种增加多拷贝质粒产量的非常有效的方法。第57页，共93页，编辑于2022年，星期六第58页，共93页，编辑于2022年，星期六3 噬菌体DNA的制备噬菌体DNA的纯化，与前面的关键区别在于：对噬菌体DNA来说，初始材料不是细胞提取物。因为噬菌体颗粒能够从被侵染细菌的细胞外培养基中大量获得。当这样的培养物被离心时，细菌聚集成小球沉淀在离心管的底部，把噬菌体颗粒留在了悬液中(图3-16)。噬菌体颗粒接着被从悬液中收集起来。噬菌体DNA需要经过一个去除蛋白的步骤以除去蛋白衣壳后才能够得到。第59页，共93页，编辑于2022年，星期六

29、第60页，共93页，编辑于2022年，星期六成功纯化大量的噬菌体DNA却要受到一些缺陷的影响。对于噬菌体来说，虽然细胞外的噬菌体浓度(每毫升培养物含有噬菌体颗粒的数量)已经足够高（噬菌体合理的噬菌体浓度为11010个/ml），但只能产生500ng的DNA。因此如果要获得足够量DNA，需要500-1 000 mL的大体积培养。第61页，共93页，编辑于2022年，星期六3.1 培育培养物以获得高的密度大体积培养物的生长不存在任何问题(50L和50L以上体积的细菌培养在生化技术上是很常见的)，但是获得最大噬菌体浓度需要一定的技巧。天然的噬菌体是溶源性的，被侵染培养物主要是由含有已经整合到细菌染色体

30、的前噬菌体的细胞所组成(图2-7)。在这种环境下，细胞外的噬菌体浓度非常低。第62页，共93页，编辑于2022年，星期六第63页，共93页，编辑于2022年，星期六为了得到高产量的细胞外噬菌体，培养物必须被诱导，以使所有细菌进入侵染循环中的溶解阶段，导致细胞死亡并将噬菌体颗粒释放到培养基中。诱导过程通常是很难控制的，但是绝大多数实验用噬菌体的cI基因含有温度敏感突变.。cI是将噬菌体DNA保持在整合状态所需要依赖的基因。如果该基因突变失活，则cI基因就不能够再正常发挥作用并引起细胞溶解的发生。第64页，共93页，编辑于2022年，星期六在cI温度敏感突变中，cI基因在30时发挥作用，正常的溶源

31、性能够发生。在42时，cI温度敏感突变基因就不能够再正常工作，溶源性也就不能够继续保持。因此，被携带cI温度敏感突变的噬菌体侵染的大肠杆菌培养物，在从培养温度30提高到42时，就能够被诱导产生细胞外噬菌体。第65页，共93页，编辑于2022年，星期六第66页，共93页，编辑于2022年，星期六3.2 非溶源性噬菌体的制备绝大多数的噬菌体都是溶源性噬菌体，但很多源自噬菌体的克隆载体都经过了改造，切除了cI以及其他一些基因，以消除细菌的溶源性。因此这些噬菌体就不能够整合到细菌基因组中，并且只能够通过细菌溶解循环来侵染细胞。第67页，共93页，编辑于2022年，星期六对于溶解性噬菌体来说，获得高浓度

32、的关键在于培养物的生长方式，尤其是在细胞被外源噬菌体颗粒侵染的阶段。如果噬菌体在细胞分裂达到其最大分裂速度之前加入，所有细胞都会立刻溶解，这样得到的噬菌体浓度非常低。另一方面，如果细胞密度太高的情况下加入噬菌体，培养物不能够彻底溶解，所得的噬菌体浓度也比较低。第68页，共93页，编辑于2022年，星期六理想的情况是，在培养物的生长时间，和噬菌体接种体的大小处于一种平衡状态。即，培养物仍在继续生长，但最终所有的细胞都被侵染和溶解。但，判断这种完美的生长状态需要一定的技术和经验。第69页，共93页，编辑于2022年，星期六第70页，共93页，编辑于2022年，星期六第71页，共93页，编辑于202

33、2年，星期六3.3 从被侵染培养物中收集噬菌体通过离心可以将已溶解细菌细胞的残留物，和一些不经意留下的未被侵染的细胞分离出来，而把噬菌体颗粒留在上清中。但需要将悬液的体积减少到5mL或更少，以便更有利于进行DNA抽提。第72页，共93页，编辑于2022年，星期六噬菌体颗粒非常小，以至于必须用很高的离心转速才能够聚集，因此噬菌体的收集通常要在聚乙二醇(PEG)存在情况下沉淀得到。聚乙二醇是一种长链多聚化合物，在盐存在下，能够吸收水分，使像噬菌体颗粒这样的大分子聚集沉淀。这些沉淀能够通过离心被收集并在一个适当的小体积中重新溶解(图3-19)。第73页，共93页，编辑于2022年，星期六第74页，共

34、93页，编辑于2022年，星期六3.4 从噬菌体颗粒中纯化DNA通过PEG沉淀再重新溶解造成的去蛋白作用，有时候对于提取纯净的噬菌体DNA来说已经足够了，但是通常噬菌体还要再经历一个中间的纯化步骤。这一纯化步骤是必要的，因为PEG沉淀物仍然包含有一定的细菌残渣，这其中可能含有不希望有的环状DNA。第75页，共93页，编辑于2022年，星期六这些污染物能够通过CsCl密度梯度离心从噬菌体中分离出来，噬菌体以1.45-1.50g/cm3结合在CsCl梯度上(图3-20)，并且像前面描述的提取DNA条带方法那样从梯度中提取出来。利用透析除去CsCl得到纯净的噬菌体制备物。然后，既能够通过苯酚法也能够

35、通过蛋白酶消化蛋白外壳，来实现DNA的抽提。第76页，共93页，编辑于2022年，星期六第77页，共93页，编辑于2022年，星期六3.5 M13噬菌体DNA纯化的几个问题M13噬菌体和噬菌体侵染循环存在很多不同，使M13拥有某些纯化的优势，这使得分子生物学家更希望制备M13噬菌体。首先，M13噬菌体的双链复制模式，就像一个高拷贝数的质粒那样，非常易于通过标准的质粒纯化步骤进行纯化。这些步骤包括：被M13噬菌体侵染的细胞提取物的制备，通过密度梯度(如EtBr-CsCl)离心从细菌DNA中分离出M13噬菌体。第78页，共93页，编辑于2022年，星期六相对于噬菌体，被M13侵染的细胞不断向培养基

36、中分泌M13噬菌体，且永远都不会发生溶解，高浓度的M13噬菌体仅仅通过将细胞培养到一个很高的密度就能够达到。事实上，不需要用到任何特别的技巧，就能够达到每毫升1012个M13噬菌体或更高的浓度。这样高的浓度意味着大量的单链M13噬菌体DNA能够从小体积的培养基中获得，比如5mL或更小的体积。第79页，共93页，编辑于2022年，星期六而且，既然被侵染细胞不发生溶解，就不存在细胞残渣污染噬菌体悬液的问题。因此，对噬菌体制备必要的CsCl密度梯度离心步骤，在M13噬菌体制备中很少需要用到。第80页，共93页，编辑于2022年，星期六总之，单链M13噬菌体DNA的制备包括：小体积被侵染培养物的生长；

37、离心沉淀细菌；PEG沉淀噬菌体颗粒；苯酚抽提分离噬菌体蛋白外壳；乙醇沉淀浓缩制得DNA。第81页，共93页，编辑于2022年，星期六第82页，共93页，编辑于2022年，星期六4.14.1制备制备RNARNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNaseRNase的作用的作用RNaseRNase的特点：抗酸抗碱的特点：抗酸抗碱,具很广具很广pHpH作用范围作用范围;抗高温严寒抗高温严寒(0-65(0-65均具活性）均具活性）抗变性剂抗变性剂解决办法：外源解决办法：外源RNaseRNase高温，高温，焦磷酸二乙酯焦磷酸二乙酯(DEPC)(DEPC)处理所有溶液处理所有溶液 （TrisTrisHClH

38、Cl除外）和器皿，除外）和器皿，操作者带手套操作者带手套 内源内源RNaseRNase高温抽提，强蛋白质变性剂，高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase RNase抑制剂，蛋白酶抑制剂，蛋白酶K K等等 4.RNA4.RNA的分离与纯化的分离与纯化第83页，共93页，编辑于2022年，星期六4.24.2总总RNARNA的制备的制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：分为以下三种制备方法：热苯酚抽提法热苯酚抽提法 胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 LiCl/LiCl/尿素法尿素法 第84页，共93页，编辑于2022年，星期六胍盐法

39、效果最好胍盐法效果最好即使即使RNaseRNase含量很高的组织（胰脏）也特别有效含量很高的组织（胰脏）也特别有效可使可使RNaseRNase迅速变性迅速变性制备的制备的RNARNA有较高翻译活性有较高翻译活性在在RNARNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的第85页，共93页，编辑于2022年，星期六分子量大小分级分离分子量大小分级分离 i.i.蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 ii.ii.凝胶电泳凝胶电泳核酸序列分级分离核酸序列分级分离 i.i.分子杂交法：适用于同源性很高的分子杂交法：适用于同源性很高的RNARNA的分离的分离DNADNA分子

40、变性分子变性 结合到结合到NCF RNANCF RNADNADNA杂交杂交 洗涤洗涤 洗膜洗膜 乙醇沉淀乙醇沉淀4.34.3RNARNA的分级分离的分级分离第86页，共93页，编辑于2022年，星期六ii.ii.亲和层析法：亲和层析法：低聚低聚dTdT纤维素纤维素:用于用于poly(A)poly(A)较长的较长的mRNAmRNA；多聚多聚U U琼脂糖琼脂糖:用于用于poly(A)poly(A)较短的较短的mRNAmRNA（20A20A）RNARNA进样吸附进样吸附 洗涤洗涤 洗脱洗脱 收集收集260nm260nm处吸收峰样处吸收峰样品品 乙醇沉淀乙醇沉淀iii.iii.无无poly(A)mRN

41、Apoly(A)mRNA的分离的分离 纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体 核糖体亚基核糖体亚基+mRNP +mRNP 离心离心 mRNP mRNP 蛋白酶蛋白酶K K mRNA mRNA 低聚（低聚（dTdT）纤维素层析）纤维素层析 洗出液洗出液 乙醇沉淀（无多聚乙醇沉淀（无多聚A mRNAA mRNA）第87页，共93页，编辑于2022年，星期六4.44.4 RNA RNA的质量评估方法的质量评估方法 1)1)光密度值测定法光密度值测定法 A260/A280=2.0A260/A280=2.0 2)2)凝胶电泳凝胶电泳 3)3)体外蛋白质翻译体外蛋白质翻译第88页，共93页，编辑于2022年，星期六

42、4.5.14.5.1多聚核糖体的分离多聚核糖体的分离 超速离心法（超速离心法（30-4030-40万万g g，离心，离心2-3 h2-3 h）镁盐沉淀法（镁盐沉淀法（0.1 M Mg0.1 M Mg+）分级分离法分级分离法分离特异性多聚核糖体分离特异性多聚核糖体4.54.5 多聚核糖体多聚核糖体RNARNA的制备的制备第89页，共93页，编辑于2022年，星期六游离与结合的核糖体分离；游离与结合的核糖体分离；核糖体大小分级分离：核糖体大小分级分离：利用连续密度梯度分离特大和特小的核糖体利用连续密度梯度分离特大和特小的核糖体第90页，共93页，编辑于2022年，星期六核糖体免疫沉淀法核糖体免疫沉

43、淀法直接免疫沉淀法直接免疫沉淀法：新生肽链新生肽链+抗体，然后蔗糖密度梯度离心抗体，然后蔗糖密度梯度离心 间接免疫沉淀法：间接免疫沉淀法：新生肽链新生肽链+抗体抗体+抗抗-抗体（二抗），抗体（二抗），形成不形成不可溶复合物，然后离心分离可溶复合物，然后离心分离 免疫亲和层析法免疫亲和层析法：新生肽链新生肽链-抗体复合物，不溶性交联抗原基质亲和层析柱抗体复合物，不溶性交联抗原基质亲和层析柱吸附、洗脱吸附、洗脱免疫沉淀法优点：免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为可分离到含量仅为1%1%的的mRNAmRNA，但必须使用，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶高纯度的抗体，不能发生交叉反应和

44、污染核酸酶第91页，共93页，编辑于2022年，星期六4.5.2 4.5.2 多聚核糖体多聚核糖体RNARNA的分离的分离纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体+SDS+SDS，蔗糖密度梯度离心，蔗糖密度梯度离心或蛋白酶或蛋白酶K-K-苯酚抽提苯酚抽提第92页，共93页，编辑于2022年，星期六细胞裂解物细胞裂解物胍盐法胍盐法总总RNA分子杂交法分子杂交法特异特异RNA分子分子热苯酚法热苯酚法凝胶电泳凝胶电泳围围RNA大小分级分离大小分级分离大小范大小范蔗糖密度蔗糖密度梯度离心梯度离心一定一定LiCl/核酸序列核酸序列尿素法尿素法离心离心分级分离分级分离亲和层析法亲和层析法poly（A）RNA分子分子高速离心法高速离心法全部多聚核糖体全部多聚核糖体上清液上清液镁盐沉淀法镁盐沉淀法蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心结合与结合与游离多聚核糖体游离多聚核糖体分级分离法分级分离法蔗糖连续密度蔗糖连续密度一定范围大小核糖体一定范围大小核糖体多聚核糖体多聚核糖体RNA免疫沉淀法免疫沉淀法特异性多聚核糖体特异性多聚核糖体第93页，共93页，编辑于2022年，星期六