酶的分离纯化.ppt

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1、关于酶的分离纯化现在学习的是第1页，共120页一、概述一、概述1.工业上应用的酶制剂：工业上应用的酶制剂：纯纯度度不不高高，如如工工业业上上用用于于织织物物退退浆浆的的-淀淀粉粉酶酶纯纯度度不不高高;用用于于皮皮革革工工业业和和食食品品工工业业的的蛋蛋白白酶酶，其其纯纯度度和和质质量量要求也不高；要求也不高；2.食食品品工工业业中中用用的的酶酶制制剂剂：如如-淀淀粉粉酶酶纯纯度度较较高高；分分离离纯化要根据使用目的进行。纯化要根据使用目的进行。现在学习的是第2页，共120页酶分离纯化包括三个基本环节：酶分离纯化包括三个基本环节：其一其一 抽提，把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；抽提，把酶从材料转

2、入溶剂中制成酶溶液；其二其二 纯化，把杂质从酶溶液中除掉或把酶从酶溶液中分离纯化，把杂质从酶溶液中除掉或把酶从酶溶液中分离 出出来；来；其三其三 制剂，即是将酶制成各种剂型。制剂，即是将酶制成各种剂型。现在学习的是第3页，共120页分离纯化应注意以下问题分离纯化应注意以下问题分离纯化过程中必须注意的问题：分离纯化过程中必须注意的问题：（1）防防止止酶酶的的变变性性失失活活：大大多多数数酶酶在在pH4或或10的的条条件件下下不不稳稳定定；应应防防止止酶酶溶溶液液形形成成泡泡沫沫避避免免酶酶失失活活；重重金金属属要要引引起起酶酶失失活活，避避免免接接触触；有有机机溶溶剂剂能能使使酶酶变变性性；防防

3、止止微微生生物物污污染染、蛋蛋白白酶酶也也使使酶酶变变性；操作应在低温下进行。性；操作应在低温下进行。（2）酶酶的的分分离离纯纯化化的的目目的的：是是将将酶酶从从酶酶溶溶液液中中分分离离出出来来，因因此此，在在不破坏酶活性的条件下，可使用各种方法。不破坏酶活性的条件下，可使用各种方法。（3）从从原原料料开开始始每每步步都都必必须须检检测测酶酶活活性性，一一个个好好的的方方法法使使酶酶的的纯纯度度提提高高倍倍数大，活力回收高，同时重复性好。数大，活力回收高，同时重复性好。现在学习的是第4页，共120页蛋白酶的纯化结果蛋白酶的纯化结果纯纯化步化步骤骤steps总总蛋白量蛋白量Total prote

4、in(mg)总总酶酶活活Tatal activity(u)比活性比活性Specific activity (u/mg)纯纯化倍数化倍数Purification fold收率收率 Recovery (%)(%)发发酵液酵液Culture fluid228770833.811100硫酸硫酸铵铵分分级盐级盐析析(NH4)2SO4Fraction80.63448656.081.6658.2离子交离子交换层换层析析Anion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex A252.01640.64820.322421.28凝胶凝胶过滤层过滤层析析Gel-filtrat

5、ion chromatography on Sephadex G751.11064.16967.4228.6113.81现在学习的是第5页，共120页 二、酶活力的测定二、酶活力的测定1.酶酶的的活活性性测测定定 酶酶活活力力（Enzyme Activity）也也称称酶酶活活性性，是是指指酶酶催催化化一一定定化化学学反反应应的的能能力力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。1.1酶酶的的活活力力单单位位（Enzyme Activity Unit,U）：酶酶的的活活力力单单位位用用U来

6、来表表示示。1961年年国国际际酶酶学学委委员员会会曾曾规规定定，在在特特定定的的条条件件（25、具具有有最最适适底底物物浓浓度度、最最适适温温度度、最最适适pH值值和和离离子子强强度度系系统统）下下，每每分分钟钟内内能能转转化化1mol底底物物或或催催化化1mol产产物物形形成成所所需需要要的的酶酶量量为为1个个国国际际单单位位（IU）。近近来来，国国际际上上又又用用Katal作作为为酶酶的的标标准准单单位位，即即在在一一秒秒钟钟内内转转化化1mol底物所需的酶量规定为底物所需的酶量规定为1个个Katal，用用Kat（开特）表示。开特）表示。1 1Kat=1mol/s=60mol/min=6

7、010Kat=1mol/s=60mol/min=60106 6mol/min=mol/min=6106107 7IUIU 。现在学习的是第6页，共120页目前酶活力单位状况目前酶活力单位状况 实际上研究工作中及商品酶制剂中，酶活力单位的实际上研究工作中及商品酶制剂中，酶活力单位的定义一直处于混乱中，各自随意制定单位。因此，同一定义一直处于混乱中，各自随意制定单位。因此，同一种酶有几种不同的活力单位，或同样的活力单位不一定种酶有几种不同的活力单位，或同样的活力单位不一定酶活力是相同的，也不便于比较酶活力，要比较文献报酶活力是相同的，也不便于比较酶活力，要比较文献报道的酶活力或者不同品牌酶制剂活力

8、大小时，必须注意道的酶活力或者不同品牌酶制剂活力大小时，必须注意他们的酶活力定义方法及测定方法系统和条件。他们的酶活力定义方法及测定方法系统和条件。现在学习的是第7页，共120页酶活力的表示方法酶活力的表示方法对液体状态的酶活力常以对液体状态的酶活力常以U/ml（酶液）表示。酶液）表示。固体酶制剂酶的活力常以固体酶制剂酶的活力常以U/mg表示。表示。1.1比比活活力力（性性）：酶酶比比活活力力（Specific Activity）是是酶酶纯纯度度的的量量度度，是是指指单单位位重重量量的的蛋蛋白白质质中中所所具具有有酶酶的的活活力力单单位位数数，一一般般用用IUmg蛋蛋白白质质表表示示。一一般般

9、来来说说，酶酶的的比比活活力力越越高高，酶酶越越纯纯。即即表表示单位蛋白质中酶催化反应的能力越大。示单位蛋白质中酶催化反应的能力越大。比活力比活力 相对酶纯度指标相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。现在学习的是第8页，共120页1.2酶活力的测定方法酶活力的测定方法1.2酶酶活活力力的的测测定定方方法法：酶酶活活力力与与底底物物浓浓度度、酶酶的的用用量量、pH、温温度度、激激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。酶活性测定可

10、用终止反应法或连续反应法。（1）终止反应法（）终止反应法（Stopped Method）底底物物 酶酶 一一定定时时间间反反应应完完全全 停停止止 取取出出反反应应物物 分分离离 再再确确定定反反应应物物的的消消耗量或产物的形成量耗量或产物的形成量 算出酶活性。算出酶活性。(2)连连续续反反应应法法:无无须须终终止止反反应应而而是是在在酶酶反反应应过过程程中中用用光光学学仪仪器器来来监监测测反反应应进行情况。进行情况。现在学习的是第9页，共120页终止反应法终止反应法1、酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成可用分光光谱法或荧光光谱仪测定的化合物。、酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成可用分

11、光光谱法或荧光光谱仪测定的化合物。2、化化学学法法是是利利用用化化学学反反应应使使产产物物转转变变成成一一个个可可用用某某种种物物理理方方法法测测出出的的化化合合物物，可可定定量量地地测测出出反反应应物物，再再算算出出酶酶活活性性。如如脲脲酶酶催催化化尿尿素素水水解解反反应应，产产物物是是NH3和和CO2，可可用用比比色色法法、滴滴定定法法、气气体体体体积积量量度度法法等等检检测测出出酶酶活活性性。此此法法的的优优点点是是设设备备简简单单，不不需需特殊仪器，应用较广，但工作量大，对于反应速度较快的酶，时间难于控制。特殊仪器，应用较广，但工作量大，对于反应速度较快的酶，时间难于控制。3、分分光光

12、光光度度测测定定法法是是酶酶学学研研究究常常用用的的方方法法。酶酶反反应应中中的的底底物物或或产产物物往往往往含含有有不不饱饱和和的的或或环环状状的的原原子子团团，如如CHCH、CO、NN、C6H5等等，他他们们在在可可见见光光区区、紫紫外外光光区区或或红红外外光光区区具具有有吸吸光光性性，反反应应底底物物或或产产物物显显示示不不同同吸吸收收光光谱谱，因因此此，根根据据光光吸吸收收的的变变化化来来测测定定酶酶反反应应的的进进行行情情况况。此此法法特特点点是是迅迅速速、简简便便、灵灵敏敏和和专专一一性性强强。放放射射性性化化学学法法是是具具有有放放射射性性的的产产物物测测定定的的方方法法，根根据

13、据全全放放射射量量，算算出出产产物物量量，从从而计算出酶活。而计算出酶活。现在学习的是第10页，共120页终止反应的方法：终止反应的方法：1.1.反应时间到后，立即取出反应液，沸水处理酶失活。反应时间到后，立即取出反应液，沸水处理酶失活。2.2.加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶失活。加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶失活。3.3.加入酸或碱溶液，使反应液的加入酸或碱溶液，使反应液的pHpH值远离最适值远离最适pHpH值而终止反应。值而终止反应。4.4.取出反应液立即置于冰箱、冰粒堆或冰盐水中，使反应液快取出反应液立即置于冰箱、冰粒堆或冰盐水中，使反应液快速降低在速降低在1010而终止

14、反应，回避最适温度。而终止反应，回避最适温度。现在学习的是第11页，共120页1.3酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的问题：酶活力测定中应注意的问题：(1)(1)底底物物的的浓浓度度:底底物物纯纯度度、浓浓度度、辅辅因因子子的的浓浓度度必必须须大大于于酶酶浓浓度度(即即过过饱饱和和)，否否则则，底底物物浓浓度度本本身身是是一一个个限限制制因子；底物要新鲜配置。因子；底物要新鲜配置。现在学习的是第12页，共120页1.3酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的问题：酶活力测定中应注意的问题：(2)(2)反反应应必必须须

15、在在酶酶的的最最适适条条件件：如如最最适适温温度度、pHpH和和离离子子强度等强度等;(3)(3)测测定定酶酶活活性性所所用用的的试试剂剂中中不不应应含含有有酶酶的的抑抑制制剂剂、激激活剂；同时底物本身不能有裂解。活剂；同时底物本身不能有裂解。(4)(4)测测定定酶酶活活力力一一定定要要在在反反应应的的初初速速度度状状态态，酶酶浓浓度度、底底物物浓浓度度、反反应应时时间间都都保保证证在在初初速速度度反反应应状状态态才才具具有有代表性。代表性。现在学习的是第13页，共120页蛋白酶活力测定蛋白酶活力测定原理原理:1、蛋白酶降解蛋白质呈色反应，如弹性蛋白、蛋白酶降解蛋白质呈色反应，如弹性蛋白酶降解

16、地衣红弹性蛋白呈红色酶降解地衣红弹性蛋白呈红色;2、酪蛋白蛋白酶、酪蛋白蛋白酶 产生的产生的肽和氨基酸肽和氨基酸 遇到三氯醋酸后不再沉淀而是溶遇到三氯醋酸后不再沉淀而是溶解在三氯醋酸中解在三氯醋酸中 用佛锡二氏指示剂用佛锡二氏指示剂显色，取上清液再用分光光度法测定。此法具有显色，取上清液再用分光光度法测定。此法具有快速和准确的优点。快速和准确的优点。现在学习的是第14页，共120页1、试剂：、试剂：（1）磷酸盐缓冲液（）磷酸盐缓冲液（pH8.0）取）取3.56克二水磷酸二氢钠溶于克二水磷酸二氢钠溶于740ml蒸馏水中，用蒸馏水中，用1mol/L NaOH溶液将溶液将pH调至调至8.0，定容至，

17、定容至1000ml。（2）三氯醋酸溶液：取）三氯醋酸溶液：取6.54克三氯醋酸溶于蒸馏水中，定容至克三氯醋酸溶于蒸馏水中，定容至100ml。（3）碳酸钠溶液：取）碳酸钠溶液：取21.2克碳酸钠溶于蒸馏水中，定容至克碳酸钠溶于蒸馏水中，定容至500 100ml。（4）佛锡二氏指示剂：用）佛锡二氏指示剂：用4份蒸馏水稀释份蒸馏水稀释1份佛锡二氏指示剂。份佛锡二氏指示剂。（5）底物溶液：取）底物溶液：取1.5克酪蛋白（生化试剂）放入克酪蛋白（生化试剂）放入30ml 0.1mol/L NaOH溶液中，并加热溶液中，并加热至酪蛋白完全溶解。冷却后用正磷酸（至酪蛋白完全溶解。冷却后用正磷酸（H3PO4用蒸

18、馏水按用蒸馏水按1：25稀释）将稀释）将pH调至调至8.0,用蒸馏水定容至用蒸馏水定容至100ml。（6）酶溶液：用磷酸盐缓冲液稀释酶，配制的酶溶液浓度应为酶溶液：用磷酸盐缓冲液稀释酶，配制的酶溶液浓度应为0.3Uml。(7)酪氨酸标准溶液：取酪氨酸标准溶液：取25mg 酪氨酸溶于酪氨酸溶于o.1mol/L 盐酸盐酸250ml 中，配制成中，配制成0.1mg/ml 再用再用此盐酸液按此盐酸液按1：10稀释。稀释。现在学习的是第15页，共120页2、测定程序：、测定程序：用吸液管将用吸液管将1.0ml底物溶液滴入一试管底物溶液滴入一试管，并置于水浴中调温至，并置于水浴中调温至37。加加1.0ml

19、 酶溶液，振荡，并按动秒表计时，于酶溶液，振荡，并按动秒表计时，于37精确保温精确保温60分钟后加分钟后加2.0ml三氯醋酸溶液，终止反应。在水浴中再放置三氯醋酸溶液，终止反应。在水浴中再放置25分后过滤此反应液。取出分后过滤此反应液。取出1.0ml上清液与上清液与5.0ml碳酸钠溶液和碳酸钠溶液和1.0ml佛锡二氏指示剂混合，将此溶佛锡二氏指示剂混合，将此溶液于液于37再静止再静止20分。然后用分光光度计于分。然后用分光光度计于660nm处的处的空白值为参比测定吸光度空白值为参比测定吸光度(1cm比色皿比色皿)。现在学习的是第16页，共120页蛋白酶的活力测定蛋白酶的活力测定 单位：单位：m

20、l实验组实验组空白值空白值底物溶液底物溶液蒸馏水蒸馏水混合，调温至混合，调温至37，加酶溶液，加酶溶液混合，按动秒表，于混合，按动秒表，于37精确保温精确保温60分；加三氯醋酸分；加三氯醋酸于于37静置静置25分，过滤，取出分，过滤，取出1.0 ml上清液，加碳酸钠溶液上清液，加碳酸钠溶液佛锡二氏指示剂于佛锡二氏指示剂于37再静置再静置25分后，用分光光度计在分后，用分光光度计在660nm处以空白值为参比测定吸光度处以空白值为参比测定吸光度1.01.02.05.01.01.01.02.05.01.0定义：在此条件下产生相当于定义：在此条件下产生相当于100ug酪氨酸时所需的酶量为一个酶活力单酪

21、氨酸时所需的酶量为一个酶活力单位。位。现在学习的是第17页，共120页弹性蛋白酶活力的测定方法弹性蛋白酶活力的测定方法根据根据Sacher法法 并参照我国现行药用弹性蛋白酶测定方法并参照我国现行药用弹性蛋白酶测定方法 单位单位 ml实验组实验组空白值空白值底物溶液（浓度）底物溶液（浓度）蒸馏水蒸馏水混合，调温至混合，调温至37,加酶溶液加酶溶液pH7.4,0.2mol/L硼酸硼酸混合混合,37保温保温,计时计时60分钟分钟,加加pH6.0，0.7mol/L磷酸钠终止液磷酸钠终止液静置静置20分左右过滤分左右过滤,取上清液用分光光度计比色取上清液用分光光度计比色590nm1ml1ml2ml2ml

22、1ml1ml2ml2ml定义：在此条件下降解定义：在此条件下降解1mg底物或产生底物或产生1mg的产物所需的酶量为一个的产物所需的酶量为一个酶活力单位。酶活力单位。现在学习的是第18页，共120页酶活力的计算方法酶活力的计算方法标准曲线的测定及绘制标准曲线的测定及绘制以酪氨酸的浓度为横坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，E660吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。酶活力单位的定义：在此条件下（酶活力单位的定义：在此条件下（37振荡振荡20分钟）溶解分钟）溶解1mg底物或产生底物或产生1mg的产物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活力单位的产物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活力单位

23、U。试液号试液号酪氨酸标准溶液酪氨酸标准溶液量量ml(0.1mg/ml)0.1mol/L 盐酸盐酸/ml酪氨酸溶液酪氨酸溶液ug E660空白空白12345670.10.20.40.50.60.81.010.90.80.60.50.40.2_1020405060801000.0920.1730.3210.4200.5020.6680.825现在学习的是第19页，共120页酶活性单位的计算最后酶的活性单位最后酶的活性单位=计算值计算值酶溶液的稀释倍数酶溶液的稀释倍数现在学习的是第20页，共120页-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定D6060消色法消色法定义：在定义：在pH6.0，60条件下，每小时催

24、化条件下，每小时催化1g可溶性淀粉成为糊精的酶量为可溶性淀粉成为糊精的酶量为1个酶活力单位。个酶活力单位。原理：利用碘遇淀粉变蓝检验淀粉转化为糊精。原理：利用碘遇淀粉变蓝检验淀粉转化为糊精。方法：试剂如下：方法：试剂如下：（1）碘原液：碘）碘原液：碘11g，碘化钾碘化钾22g，定容至定容至500ml。（2）标准稀碘液：碘原液标准稀碘液：碘原液15ml，加碘化钾加碘化钾8g，定容至定容至500ml。（3）比色稀碘液：取碘原液）比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾加碘化钾20g，定容至，定容至500ml。（4）2可溶性淀粉：称可溶性淀粉可溶性淀粉：称可溶性淀粉2g，用少许蒸馏水混合均匀，再慢慢用少

25、许蒸馏水混合均匀，再慢慢倾入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸倾入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸2分钟，冷却后定容至分钟，冷却后定容至100ml（当天配制使用）。当天配制使用）。（5）pH6.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液：磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液：Na2HPO412H2O称取称取45.23g，柠檬酸柠檬酸8.07g，加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至1000ml。（6）标准糊精液：称取分析纯糊精标准糊精液：称取分析纯糊精0.3g，用少许蒸馏水混均后倾入用少许蒸馏水混均后倾入400ml水中，冷却后定容至水中，冷却后定容至500ml，加几滴甲苯防腐，冰箱保存。加几滴甲苯防腐，冰箱保存。现在学习的是第21页，共120页 操作方

26、法操作方法1、取、取1ml标准糊精液，置于盛有标准糊精液，置于盛有3ml标准碘液的试管中，作为比较颜色的标标准碘液的试管中，作为比较颜色的标准管。（或吸取准管。（或吸取2ml置于白色瓷板的空穴内，作为比色标准）置于白色瓷板的空穴内，作为比色标准）2、在、在25200mm试管中，加入试管中，加入2可溶性淀粉液可溶性淀粉液20ml，加缓冲液加缓冲液5ml，在在60水浴中平衡约水浴中平衡约5分钟，加入分钟，加入0.5ml酶液，立即计时并充分混匀，定时取出酶液，立即计时并充分混匀，定时取出1ml反应液于预先盛有比色稀碘液的试管内，或取出反应液于预先盛有比色稀碘液的试管内，或取出0.5ml于预先盛于预先

27、盛有比色稀碘液的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙（红）色，有比色稀碘液的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙（红）色，与标准色相同时，即为反应终止点，记录时间。反应时间控制与标准色相同时，即为反应终止点，记录时间。反应时间控制 在在22.5分内；测定照明用分内；测定照明用40W日光灯，灯与瓷板的间距应为日光灯，灯与瓷板的间距应为60厘米左右为宜；厘米左右为宜；白瓷板可用白瓷板可用10 ml比色管代替。比色管代替。3、计算：、计算：-淀粉酶活力淀粉酶活力(60/t20 2 n)0.5 (单位单位/ml)t 反应时间（分）反应时间（分）n酶液稀释倍数酶液稀释倍数0.5使用的酶液量（

28、使用的酶液量（ml）2 淀粉浓度淀粉浓度20可溶性淀粉的毫升数可溶性淀粉的毫升数 现在学习的是第22页，共120页-淀粉酶活力测定方法二淀粉酶活力测定方法二D3060 消色法消色法定义：在定义：在pH6.0，30条件下，每小时催化条件下，每小时催化1ml 2可溶性淀粉成为糊精的酶可溶性淀粉成为糊精的酶量为量为1个酶活力单位。个酶活力单位。原理：利用碘遇淀粉变蓝检验淀粉转化为糊精。原理：利用碘遇淀粉变蓝检验淀粉转化为糊精。方法：试剂如下：方法：试剂如下：（1）碘原液：碘）碘原液：碘11g，碘化钾碘化钾22g，定容至定容至500ml。（2）pH5.7醋酸缓冲液。醋酸缓冲液。（3）比色稀碘液：取碘原

29、液）比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾加碘化钾20g，定容至，定容至500ml。（4）2可溶性淀粉：称可溶性淀粉可溶性淀粉：称可溶性淀粉2g，用少许蒸馏水混合均匀，再慢慢倾用少许蒸馏水混合均匀，再慢慢倾入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸2分钟，冷却后加分钟，冷却后加5ml pH5.7醋酸缓冲液定醋酸缓冲液定容至容至100ml（当天配制使用）。当天配制使用）。（5）标准比色液）标准比色液：CoCl226H2O称取称取2.5g，重铬酸钾重铬酸钾0.384g，以以0.01N的的HCl定容至定容至100ml。现在学习的是第23页，共120页操作方法操作方法1、取、取20ml 2可溶

30、性淀粉液于试管内，预热可溶性淀粉液于试管内，预热5分钟。加入分钟。加入10ml稀释酶稀释酶液（液（30），混匀，并立即计时，在，混匀，并立即计时，在30反应，定时取出反应，定时取出0.5ml反应液滴反应液滴到预先盛有比色稀碘液的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色逐渐到预先盛有比色稀碘液的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙（红）色，与标准色相同时，即为反应终止点，记录反变为棕橙（红）色，与标准色相同时，即为反应终止点，记录反应时间。反应时间控制应时间。反应时间控制 在在1060分内；测定照明用分内；测定照明用40W日光灯，日光灯，灯与瓷板的间距应为灯与瓷板的间距应为60厘米左右为宜；白瓷板可

31、用厘米左右为宜；白瓷板可用10 ml比色管代替。比色管代替。3、计算：、计算：-淀粉酶活力淀粉酶活力60/t20 n (单位单位/ml)t 反应时间（分）反应时间（分）n酶液稀释倍数酶液稀释倍数现在学习的是第24页，共120页糖化酶活力的测定方法糖化酶活力的测定方法1、定义：以单位时间内生成一定量的葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。但酶反应的条、定义：以单位时间内生成一定量的葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。但酶反应的条件各不相同，酶活力单位定义也有所差别。件各不相同，酶活力单位定义也有所差别。2、试剂：、试剂：（1）0.1mol/L乙酸乙酸乙酸钠缓冲液乙酸钠缓冲液(pH4.6)，称取称取6.7g

32、 乙酸钠乙酸钠(CH3COONa 3H2O)，吸吸取冰醋酸取冰醋酸2.6ml，用蒸馏水溶解定容至用蒸馏水溶解定容至1000ml，然后以酸度校正然后以酸度校正 pH。（2）0.05 mol/L Na 2S2O3溶液：按溶液：按GB601化学试剂标准溶液制备方法中化学试剂标准溶液制备方法中2.7执行。执行。（3）0.1mol/L I2液液：按按GB601化学试剂标准溶液制备方法中化学试剂标准溶液制备方法中2.10执行。执行。（4）0.1mol/L NaOH溶液：按溶液：按GB601化学试剂标准溶液制备方法化学试剂标准溶液制备方法2.2执行。执行。（5）2mol/L H2SO4溶液：取分析纯浓硫酸（

33、相对密度溶液：取分析纯浓硫酸（相对密度1.84）5.6ml缓缓加入适量蒸缓缓加入适量蒸馏水中，冷却后用蒸馏水定容至馏水中，冷却后用蒸馏水定容至100ml，摇匀。摇匀。（6）20 NaOH溶液：称取溶液：称取20g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至100ml。（7）2可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉2g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100ml，此溶液需当天配制。此溶液需当天配制。现在学习的是第25页，共120

34、页-淀粉酶、糖化酶作用的机理淀粉酶、糖化酶作用的机理-淀粉酶作用的机理：是内切淀粉酶，能随机水解淀粉，可淀粉酶作用的机理：是内切淀粉酶，能随机水解淀粉，可溶性糊精及低聚糖中的溶性糊精及低聚糖中的-1，4葡萄糖苷键，转化为低粘度的葡萄糖苷键，转化为低粘度的液化淀粉，产物为糊精和少量葡萄糖、麦芽糖。液化淀粉，产物为糊精和少量葡萄糖、麦芽糖。糖化酶作用的机理：糖化酶又叫葡萄糖淀粉酶，它将淀粉从糖化酶作用的机理：糖化酶又叫葡萄糖淀粉酶，它将淀粉从非还原性末端水解非还原性末端水解-1，4葡萄糖苷键，转化为葡萄糖葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。-淀粉酶：外切性淀粉酶，又叫淀粉淀粉酶：外切性淀粉酶，又叫淀粉1，4

35、麦芽糖苷酶，水解麦芽糖苷酶，水解淀粉成麦芽糖，主要用于饴糖、高麦芽糖、啤酒、醋等生产淀粉成麦芽糖，主要用于饴糖、高麦芽糖、啤酒、醋等生产中。中。现在学习的是第26页，共120页操作方法操作方法1、取酶液、取酶液1ml或酶粉或酶粉2g，加入加入50ml烧杯中，用少量的乙酸乙酸钠缓冲液烧杯中，用少量的乙酸乙酸钠缓冲液(pH4.6)溶解，溶解，并用玻璃棒混匀，将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣再加入少量上述缓冲溶液。并用玻璃棒混匀，将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣再加入少量上述缓冲溶液。如此反复如此反复34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，用次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液

36、定容至刻度，摇匀，用4层纱布层纱布过滤。再用滤纸滤清，滤液用于测定。浓缩酶液可直接吸取一定量于容量瓶中，用缓过滤。再用滤纸滤清，滤液用于测定。浓缩酶液可直接吸取一定量于容量瓶中，用缓冲溶液稀释定容至刻度。冲溶液稀释定容至刻度。2、测定：取甲乙两支试管中，分别加入、测定：取甲乙两支试管中，分别加入2可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液25ml，0.1mol/L 乙酸乙酸乙酸钠缓冲液（乙酸钠缓冲液（pH4.6）5ml，摇匀。于（摇匀。于（400.2）的恒温水浴中预热）的恒温水浴中预热510分。在甲分。在甲管中加入酶制备液管中加入酶制备液2ml，立即计时摇匀。在此温度下准确反应立即计时摇匀。在此温度下准确反

37、应1小时后，立即在甲乙两小时后，立即在甲乙两管各加管各加20氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀。将两管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加摇匀。将两管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加酶制备液酶制备液2 ml（作为对照）。取两管中上述反应液各作为对照）。取两管中上述反应液各5ml加入碘量瓶中，准确加入加入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L I2液液10ml，再加入再加入0.1mol/L NaOH溶液溶液15ml，边加边摇匀，放置暗处边加边摇匀，放置暗处15分分钟，加入钟，加入2mol/L 硫酸硫酸2ml，用用0.05mol/L Na 2S2O3溶液滴定至无色为终点。溶液滴定至无色为终点。3、计

38、算：糖化酶酶活（、计算：糖化酶酶活（AB）c 90.05 12 32.25 n（U ml）A空白试验消耗空白试验消耗Na 2S2O3溶液的毫升数溶液的毫升数 B样品消耗样品消耗Na 2S2O3溶液的毫升数溶液的毫升数 C Na 2S2O3溶液的当量浓度溶液的当量浓度 n稀释倍数稀释倍数 90.05 1 ml 1mol/L Na 2S2O3相当相当于葡萄糖毫克数于葡萄糖毫克数 1 2折算成折算成1 ml酶液的量酶液的量 32.2反应液总体积反应液总体积5吸取反应液的毫升数吸取反应液的毫升数 为了方便计算，可按稀释倍数参考表计算，系数乘以滴定空白为了方便计算，可按稀释倍数参考表计算，系数乘以滴定空

39、白和样品所消耗和样品所消耗0.05mol/L Na 2S2O3溶液的差值（溶液的差值（AB）为酶活力单位。为酶活力单位。现在学习的是第27页，共120页果胶酶的活力测定方法果胶酶的活力测定方法1、原理：果胶酶水解果胶，生成半乳糖醛酸，生成半乳糖醛酸具有还、原理：果胶酶水解果胶，生成半乳糖醛酸，生成半乳糖醛酸具有还原性糖醛基，可用次亚碘酸法定量测定，以此来表示果胶酶的活性。原性糖醛基，可用次亚碘酸法定量测定，以此来表示果胶酶的活性。2、试剂和配制方法：、试剂和配制方法：（1）果胶粉（）果胶粉（Sigma公司产品）公司产品）10gL水溶液。称取果胶粉水溶液。称取果胶粉1.0000g，精精确到确到0

40、.0002g，加水溶解，煮沸，冷却。有不溶物质需进行过滤。调加水溶解，煮沸，冷却。有不溶物质需进行过滤。调pH至至3.5，用水定容至，用水定容至100ml，在冰箱中储存备用，使用时间不超过在冰箱中储存备用，使用时间不超过3d。（2）硫代硫酸钠（硫代硫酸钠（Na2S2O3）标准溶液：浓度标准溶液：浓度0.05 mol/L，按按GB601配制配制与标定与标定0.1mol/L溶液，使用时准确稀释一倍。溶液，使用时准确稀释一倍。（3）碳酸钠）碳酸钠(NaCO3)溶液：浓度为溶液：浓度为1 mol/L，按按GB601配制。配制。（4）碘标准溶液（）碘标准溶液（I2）：）：浓度为浓度为0.1mol/L，按

41、按GB601配制与标定，贮存配制与标定，贮存于棕色瓶中。于棕色瓶中。（5）硫酸溶液：浓度为）硫酸溶液：浓度为2mol/L，取浓硫酸（相对密度取浓硫酸（相对密度1.84）5.6ml，缓缓缓加入适量水中，冷却后定容至缓加入适量水中，冷却后定容至100ml，摇匀。摇匀。现在学习的是第28页，共120页（6）可溶性淀粉指示液（）可溶性淀粉指示液（10g/L）:按按GB603配制。配制。（7）0.1mol/L柠檬酸柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，柠檬酸钠缓冲溶液，pH为为3.5。甲液：称取一倍结晶水柠檬酸甲液：称取一倍结晶水柠檬酸21.01g，用水溶解并定容至用水溶解并定容至1000 ml；乙液：称取乙液：称

42、取2倍结晶水柠檬酸三钠倍结晶水柠檬酸三钠29.41g，用水溶解定容至用水溶解定容至1000 ml 取甲液取甲液140ml、乙液乙液60ml混匀，缓冲液的混匀，缓冲液的pH应为应为3.5，用，用pH调试。调试。3、仪器：比色管、仪器：比色管25 ml；恒温水浴（恒温水浴（500.2）；容量瓶；容量瓶25ml、50ml、100ml、滴定管滴定管25ml。200ml、250ml；碘量瓶碘量瓶250ml；吸罐吸罐1ml和和5ml；4、测定程序：精确称固体酶、测定程序：精确称固体酶1克于克于50ml烧杯中，以上述柠檬酸柠檬酸钠缓冲烧杯中，以上述柠檬酸柠檬酸钠缓冲液稀释定容、摇匀，液稀释定容、摇匀，4层纱

43、布过滤，滤液备用。液体酶制剂准确吸层纱布过滤，滤液备用。液体酶制剂准确吸1ml，用柠檬用柠檬酸柠檬酸钠稀释定容。酸柠檬酸钠稀释定容。甲乙两比色管甲乙两比色管 分别加入果胶溶液分别加入果胶溶液5ml （500.2）预热预热5 10分分 甲管加入柠檬酸柠檬酸钠缓冲液甲管加入柠檬酸柠檬酸钠缓冲液5ml，乙管加入乙管加入4ml和稀释酶液和稀释酶液1ml 立即摇立即摇匀计时匀计时此温度下反应此温度下反应30分钟，加热煮沸分钟，加热煮沸5分终止反应分终止反应冷却冷却取甲乙管反应取甲乙管反应液各液各5 ml于碘量瓶中，准确加入于碘量瓶中，准确加入1mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液1 ml、0.1mol/L碘液

44、碘液5 ml，摇匀于暗处摇匀于暗处20分钟分钟取出加入硫酸溶液取出加入硫酸溶液2 ml，用用0.5mol/L硫代硫酸钠硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液标准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3滴，继续滴定至蓝色刚好消失为其终滴，继续滴定至蓝色刚好消失为其终点，计录甲管点，计录甲管(空白空白)、乙管（样品、乙管（样品）反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，同时做平行测定。同时做平行测定。现在学习的是第29页，共120页计算方法计算方法定义：定义：1g 酶粉或酶粉或1ml酶液在酶液在50、pH3.5的条件下，的条件下，1h分解果胶产生分解果胶产生1mg半乳糖

45、醛酸为一个半乳糖醛酸为一个酶活单位。酶活单位。X（V1V2）c0.51 194.14 n10（5 1 0.5）（V1V2）c n 396.05其中其中X样品的酶活力，样品的酶活力，Ug（Uml）V1 空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml V2 样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml c 硫代硫酸钠标准溶液的浓度，硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L 0.51 1m mol硫代硫酸钠相当于硫代硫酸钠相当于0.51 m mol的游离半乳糖醛酸。的游离半乳糖醛酸。194.14 半乳糖醛酸的摩尔质量，半乳糖醛酸的摩尔质量，gmol

46、n 酶液稀释倍数酶液稀释倍数 10反应液总体积，反应液总体积，ml 5滴定时取反应混合物的体积，滴定时取反应混合物的体积，ml 1反应时加入稀释酶液的体积，反应时加入稀释酶液的体积，ml 0.5反应时间，反应时间，h现在学习的是第30页，共120页香菇漆酶的活性测定香菇漆酶的活性测定含铜的多酚氧化酶含铜的多酚氧化酶(苯二醇氧化还原酶苯二醇氧化还原酶)作用作用:降解木质素，使苯氧基类除草剂、工业废水驱除毒性。降解木质素，使苯氧基类除草剂、工业废水驱除毒性。酶作用的底物：临联甲苯胺酶作用的底物：临联甲苯胺检测方法：参考文献，于检测方法：参考文献，于0.2mol/L、pH4.0的醋酸缓冲液的醋酸缓冲

47、液3.5ml中加入中加入3.3610-3mol/L的临联甲苯胺的临联甲苯胺0.5ml，再加入适当稀释的酶液，再加入适当稀释的酶液0.5ml，25反应反应5分钟后于分钟后于595nm处比色。以每分钟使处比色。以每分钟使OD600增加增加0.01为一为一个酶活性单位。个酶活性单位。某大学的研究生报道的某大学的研究生报道的现在学习的是第31页，共120页尿酸酶尿酸酶嘌呤嘌呤 尿酸尿酸 肾脏排泄肾脏排泄尿酸尿酸 尿囊素、尿囊素、CO2和过氧化氢和过氧化氢缺乏尿酸酶，血清尿酸过高易导致高尿酸症，这是心血管缺乏尿酸酶，血清尿酸过高易导致高尿酸症，这是心血管疾病、痛风的主要诱因。细菌、酵母菌及植物中都能产生

48、疾病、痛风的主要诱因。细菌、酵母菌及植物中都能产生尿酸酶。尿酸酶。尿酸酶尿酸酶现在学习的是第32页，共120页尿酸酶活性的测定尿酸酶活性的测定是否有标准方法？是否有标准方法？重庆医科大学的研究：反应体系重庆医科大学的研究：反应体系1.2ml，含，含1.156ml硼酸缓冲液硼酸缓冲液（0.05mol/L,pH8.8,含含0.10mmol/L二乙三胺五醋酸二乙三胺五醋酸DETAPA），溶），溶解在二甲基亚砜的解在二甲基亚砜的3.75mmol/L尿酸尿酸0.024ml和和0.02ml酶溶液，在酶溶液，在25测定酶作用下测定酶作用下293nm吸收变化初速度（延迟吸收变化初速度（延迟40sec后共记录后

49、共记录1.0min），定义每分钟氧化），定义每分钟氧化1.0mol尿酸的尿酸的酶酶量量为为一个活性一个活性单单位。位。现在学习的是第33页，共120页三、蛋白质纯化的主要步骤三、蛋白质纯化的主要步骤1.捕获阶段捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。2.中度纯化阶段中度纯化阶段:目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。病毒等。3.精制阶段精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。现在学习的是第34页，共120页蛋白质纯化的具体步骤蛋白质纯化的具体步骤原

50、料的获得原料的获得 清理清理 组织破碎组织破碎 蛋白质成分的粗提蛋白质成分的粗提蛋白质成分的细提蛋白质成分的细提纯蛋白的鉴别纯蛋白的鉴别纯化方案纯化方案最后最后现在学习的是第35页，共120页酶溶液的制备酶溶液的制备酶溶液的制备有三个过程酶溶液的制备有三个过程:材料预处理和破碎细胞材料预处理和破碎细胞抽提抽提抽抽提提液液的的浓浓缩缩。酶酶的的抽抽提提 酶酶的的抽抽提提目目的的在在于于将将尽尽可可能能多多的的酶酶、尽尽可可能能少少的的杂质从原料组织和细胞中引入溶液，以利于酶的纯化。杂质从原料组织和细胞中引入溶液，以利于酶的纯化。（一）酶源材料的预处理（一）酶源材料的预处理 动物材料要先去除结缔组