第五章遗传工程小鼠课件.pptx

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1、第五章遗传工程小鼠第1页，此课件共60页哦转基因与转基因动物转基因与转基因动物转基因超级鼠转基因超级鼠1982年，英国的年，英国的自然自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速培育出具快速生长效应的生长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快度快23倍，体积大一倍。倍，体积大一倍。第2页，此课件共60页哦遗传工程动物明星多利世界上第一只用已经分化的成熟的体细胞已经

2、分化的成熟的体细胞(乳腺细胞)克隆出的羊第3页，此课件共60页哦遗传工程动物明星乙肝小鼠持续表达乙肝病毒表面抗原的转基因小鼠。将乙型肝炎病毒基因注入小鼠受精卵，整合进基因组，让乙型肝炎病毒在小鼠体内生存，并代代相传乙型肝炎的病因发病机理及防治药物筛选疫苗验证第4页，此课件共60页哦遗传工程动物明星荧光鼠取小鼠早期囊胚，注射转染了绿色荧光蛋白基因的小鼠胚胎干细胞后植入代孕母鼠子宫内第5页，此课件共60页哦 一、转基因小鼠技术的发展史一、转基因小鼠技术的发展史 转基因小鼠技术兴起于转基因小鼠技术兴起于60年代，年代，至至80年代中期逐渐成熟。其中关键的技年代中期逐渐成熟。其中关键的技术是实现术是实

3、现外源基因的导入及整合外源基因的导入及整合，这一技，这一技术的发展到目前已经历了四个阶段：术的发展到目前已经历了四个阶段：1.实现外源基因的导入。实现外源基因的导入。2.实现外源基因的定点整合实现外源基因的定点整合-基因打靶。基因打靶。3.实现外源基因的组织特异性表达。实现外源基因的组织特异性表达。4.实现外源基因的时间可控性表达。实现外源基因的时间可控性表达。第6页，此课件共60页哦 第一阶段：实现外源基因的导入第一阶段：实现外源基因的导入 1974年，年，Jaenisch等用等用显微注射法显微注射法将将SV40的的DNA导入到小鼠的导入到小鼠的囊胚囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠

4、的肝、肾组）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了织中检测到了SV40的的DNA。这一结果证明将外源基因导入胚胎。这一结果证明将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。细胞中并实现整合是可能的。以后有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中以后有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中的转移并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了的转移并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录逆转录病毒载体法病毒载体法、电脉冲法电脉冲法等。等。SV40第7页，此课件共60页哦超级小鼠的建立超级小鼠的建立 1982年年，美美国国学学者者Palmiter将将大大鼠鼠生生长长激激素素基基因因导导入入

5、小小鼠鼠受受精精卵卵，所所生生7只只子子代代小小鼠鼠中中有有6只只生生长长加加快快，体体重重明明显显增增加加，这这就就是是所所谓谓的的“超超级级小小鼠鼠”(supermouse)诞诞生生了了(Palmiter et al.,1982:Nature,Vol.300,December 16,1982)。“超超级级小小鼠鼠”的的建建立立成成功功轰轰动动了了整整个个生生命命科科学学界界，科科学学家家们们对对此此表表现现出出浓浓厚厚的的兴兴趣趣，许许多多实实验验室室竞竞相相开开展展这这方方面面的的研研究工作，因此，转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。究工作，因此，转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。第8页，

6、此课件共60页哦 第二阶段：转基因的定点整合第二阶段：转基因的定点整合。1987年年，美美国国北北卡卡罗罗莱莱纳纳大大学学Smithies和和犹犹他他大大学学Capecchi领领导导的的研研究究小小组组根根据据同同源源重重组组的的原原理理，实实现现了了导导入入的的外外源源基基因因的的定定点点整整合合，这这一一技技术术亦亦称称为为“基基因因打打靶靶”(Gene targeting).基基因因打打靶靶技技术术的的应应用用，一一方方面面可可以以使使导导入入的的外外源源基基因因定定点点整整合合于于人人们们希希望望整整合合的的部部位位，从从而而避避免免了了外外源源基基因因随随机机整整合合对对内内源源基基

7、因因的的影影响响。另另一一方方面面，人人们们还还可可以以利利用用基基因因打打靶靶技技术术定定点点灭灭活活一一个个内内源源基基因因，亦亦称称为为“基基因因敲敲除除”(Gene knockout)。因因此此基基因因打打靶靶技技术术为为在在整整体体水水平平研研究究某某一一基基因因的的功功能能以以及及进进行行基基因因治疗开辟了新的途径。治疗开辟了新的途径。第9页，此课件共60页哦转基因的组织特异性表达转基因的组织特异性表达 随着一系列随着一系列组织特异性启动子（组织特异性启动子（promoter）的的发现和应用，导入的外源基因逐步实现了在特定发现和应用，导入的外源基因逐步实现了在特定组织细胞内的表达。

8、这样就使得对转入的外源基组织细胞内的表达。这样就使得对转入的外源基因功能的研究精确到了因功能的研究精确到了组织特异性表达的水平组织特异性表达的水平.第10页，此课件共60页哦转基因的组织特异性表达转基因的组织特异性表达第11页，此课件共60页哦问题：问题：表达时间能否控制？表达时间能否控制？第12页，此课件共60页哦遗传工程动物制作的基本原理和技术对 遗传物质（DNA）的体外施工主要建立在基因水平上，因此也被称为基因工程/重组DNA技术相比于传统保种、育种技术的优势：1、高度预见性2、精确3、高效率4、打破自然界限制（时空、种属）打破自然界限制（时空、种属）第13页，此课件共60页哦基因工程动

9、物原理：分子遗传学技术手段：分子生物学、微生物学基本过程：体外构建杂交DNA(重组），导入活细胞，发育为个体结果：改变原有遗传性状，获得新品种/物种意义：使基因操作走向整体动物水平从分子水平改造动物/改变动物基因组，从整体水平（活体动物）观察效应第14页，此课件共60页哦基因工程动物基因工程动物：通过基因工程基因工程技术/重组DNA，人为改改变遗传性状变遗传性状的动物转基因动物：以实验方法将特定外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于染色体基因组，并能够遗传给后代的一类动物（有别于嵌合体动物）1、其所有细胞均整合有外源基因2、其外源基因能够遗传给子代第15页，此课件共60页哦嵌合体嵌合体在

10、希腊神话中是指具有狮头、羊身和蛇尾的一种怪物。种内嵌合体1965年 获得了小鼠的嵌合体后代1968年 获得了绵羊的嵌合体后代1974年 获得了大鼠、家兔的嵌合体后代1984年 获得了牛的嵌合体后代1987年 获得了猪的嵌合体后代种间嵌合体1973年 小鼠与大鼠1980年 家养小鼠与野生小鼠1983年 牛与水牛1984年 绵羊与山羊第16页，此课件共60页哦嵌合体哺乳动物嵌合体的生产方法1卵裂球聚合法将不同遗传性能而发育阶段相同或相近的胚胎卵裂球聚合在一起获得嵌合体的方法，胚胎发育阶段在8细胞至桑椹胚阶段较为理想。2囊胚注射法把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团细胞或EC细胞、ES细胞直接注射到另

11、一枚囊胚的腔隙中获得嵌合体的方法。第17页，此课件共60页哦嵌合体嵌合体的生产效率低，种间嵌合体仅在少数动物上取得成功，远缘动物嵌合体仍存在很大障碍。通过嵌合方式可能会得到经济价值或观赏价值更高的动物。种间嵌合体技术也为拯救濒危动物提供一种方法。特异性嵌合体技术若能使嵌入的细胞定向分化为嵌合体的某一组织或某一器官，有极高的医学价值（人心猪，真人耳鼠）。第18页，此课件共60页哦转基因动物广义：对动物基因组的所有改动狭义：以显微注射、反转录病毒介导、胚胎干细胞介导等方式转入基因，获得新功能转基因动物基因转移/基因打靶：以精确的基因替换技术获得新基因，knock-in knock-out第19页，

12、此课件共60页哦第一节、转基因小鼠转基因小鼠第20页，此课件共60页哦转基因技术转基因（狭义）原理和局限1、细胞学原理：利用MII期卵母细胞无核膜、外源基因易导入特点2、胚胎学原理：利用雌雄原核融合之前雄原核易见特点3、分子生物学原理：随机整合整合位点、表达效果的不可预期性第21页，此课件共60页哦早期胚胎早期胚胎-单细胞期受精卵单细胞期受精卵第22页，此课件共60页哦 受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成一受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成一个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称为全个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称为全能性。随着分化发育的进程，转基因会分布到各能性。随着分化发育的进程

13、，转基因会分布到各种组织细胞中去，包括生殖细胞，因此，转基因种组织细胞中去，包括生殖细胞，因此，转基因是可以遗传的。是可以遗传的。第23页，此课件共60页哦转基因技术常用转基因技术手段1、显微注射将外源基因直接注射到受精卵原核内，迄今应用较为普遍和富有成就对DNA片段大小无限制无需载体，可获无载体片段的转入目的基因操作简单，周期短各种随机整合结果：位点、多拷贝可能不整合/游离体第24页，此课件共60页哦转基因技术2、电脉冲法利用高压电短脉冲破坏细胞膜电位，造成细胞膜可逆性穿孔，以便外源DNA进入细胞瞬时转染/游离体、稳定转染/整合DNA用量大、细胞容易死亡第25页，此课件共60页哦转基因技术3

14、、逆转录病毒法利用逆转录病毒侵入宿主细胞并整合于DNA的能力，适合难以观察到雄原核的禽类受精卵整合率较高单拷贝单位点可能得到嵌合体、逆转录病毒的潜在危害、可携带DNA长度有限第26页，此课件共60页哦转基因载转基因载体的构建体的构建启动子（启动子（promoter）拟表达基因编码序列拟表达基因编码序列(CDS).受精卵原核受精卵原核DNA显微注射显微注射受精卵获得受精卵获得显微注射显微注射受精卵体外培养受精卵体外培养代孕母鼠输卵管移代孕母鼠输卵管移植植 转基因转基因 后鉴定后鉴定PCR、southern印迹印迹与野生型小鼠交配与野生型小鼠交配RNA印迹、印迹、RT-PCR、western bl

15、ot等等转基因小鼠（原核注射法）构建过程转基因小鼠（原核注射法）构建过程第一法第一法 雄原核显微注射法雄原核显微注射法第27页，此课件共60页哦一、设计转基因一、设计转基因载体载体一个完整的转基因构件应包括目的基因目的基因、启动子启动子、加强子加强子和标记标记基因基因或报告基因报告基因。转基因构件的设计上还要考虑原核载体序列的影响。1 1、转基因调控序列、转基因调控序列 包括基因加强子和启动子。在启动子的选择上可以如下两个方面进行考虑：（1）如需要得到外源基因全身一致表达的转基因品系出可选择一个管家基因启动子。（2）与一致表达相对的就是组织特异性表达，组织特异性表达的启动子成分要复杂的多，将在

16、后面的条件转基因中介绍。第28页，此课件共60页哦二、雄原核显微注射法显微注射法常用转基因技术手段1、显微注射将外源基因直接注射到受精卵原核内，迄今应用较为普遍和富有成就对DNA片段大小无限制无需载体，可获无载体片段的转入目的基因操作简单，周期短各种随机整合结果：位点、多拷贝可能不整合/游离体第29页，此课件共60页哦一、DNADNA显微注射技术显微注射技术 2003 John Wiley and Sons Publishers优点优点：1.可靠性高、重复性好可靠性高、重复性好2.2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高3.3.导入导入DNADNA片

17、段的大小和类型不受限制片段的大小和类型不受限制4.4.转基因在代与代之间传递的稳定性好转基因在代与代之间传递的稳定性好1980 PNAS 77,7380-7384缺点：缺点：1.1.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响2.2.可能会出现不希望的插入突变可能会出现不希望的插入突变3.3.装置和技术的花费大时间长装置和技术的花费大时间长第30页，此课件共60页哦1、注射前准备 用于显微操作的供体和受体母鼠的处理程序（1）供体准备；（2）受体注射前准备，即见下图。第31页，此课件共60页哦第32页，此课件共60页哦第33页，此课件共60页哦三、显微注射转基

18、因小鼠模型的建立三、显微注射转基因小鼠模型的建立（1）受体母鼠怀孕产仔。胚胎移植后2021天受体母鼠产仔，正常情况下产仔数是移胚胎数的50%80%。（2）断奶时子代鼠编号、剪下1cm左右的尾部组织，提取DNA作整合检测。整合检测的方法有PCR、Southern杂交、限制性内切酶检测，检测结果阴性淘汰，阳性则作为G0代小鼠用于繁殖。通过显微注射法建立转基因小鼠模型、获得10个G0代整合阳性小鼠是必须的。（3）向C57BL/6或其他背景品系回交，F1代小鼠整合检测阳性，则表示外源基因已稳定整合到转基因鼠的生殖系中，这个外源基因是可能遗传的。第34页，此课件共60页哦（4）背景品系的纯化 采用基因导

19、入法继续向C57BL/6或其背景品系回交，即可建成以C57BL/6为遗传背景或回交品系为背景的能稳定遗传的近交系。（5）胚胎冷冻保种 自F1代起，每一代都应冷冻200枚以上胚胎，以防止繁殖过程中出现基因丢失、繁殖障碍或其他原因造成转基因品系断线。（6）基因表达研究 自F1代以后要重点研究的基因的表达，小鼠形态、功能的变化，组织病理变化，最终建立医学动物模型。第35页，此课件共60页哦胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化

20、的多能干细胞，可被诱导分化为所有机体细胞类型；哺乳动物囊胚期内的细胞团分离出的尚未分化的胚胎细胞（囊胚期内层细胞），但不能发育为胎盘但不能发育为胎盘，不不具有发育为完整个体的全能性具有发育为完整个体的全能性它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。第二法、胚胎干细胞技术第36页，此课件共60页哦胚胎干细胞介导将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原

21、有基因结构及功能没有影响或影响最小。培育筛选无损囊胚植入代孕母体子宫发育为转基因动物，也可整合外源基因的ES细胞注入受体囊胚腔中发育为嵌合体，理想中的嵌合体小鼠C中，导入外源目的基因的ES细胞最好发育成卵巢或睾丸。对ES细胞的操作和培养容易第37页，此课件共60页哦将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。第38页，此课件共60页哦 第39页，此课件共60页哦转基因技术2、电脉冲法利用高压电短脉冲破坏细胞膜电位，造成细胞膜可逆性穿孔，以便外源DNA进入细胞瞬时转染/游离体、

22、稳定转染/整合DNA用量大、细胞容易死亡第40页，此课件共60页哦转基因技术3、逆转录病毒法利用逆转录病毒侵入宿主细胞并整合于DNA的能力，适合难以观察到雄原核的禽类受精卵整合率较高单拷贝单位点可能得到嵌合体、逆转录病毒的潜在危害、可携带DNA长度有限第41页，此课件共60页哦转基因技术4、精子载体法利用受精作用避免人工方法导致原核损伤实践中成功率较低第42页，此课件共60页哦转基因技术基因定点突变（基因打靶）利用DNA同源重组，即同源DNA之间相互配对并互换的自然现象（自然状况下可增加自身和后代遗传多样性促进生物进化）构建打靶载体（目的基因上下游同源DNA），实现特定基因的剔除/导入第43页

23、，此课件共60页哦基因打靶定向改变生物活体遗传信息。遗传定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，第44页，此课件共60页哦转基因动物应用用转基因动物建立疾病动物模型模型来源一般途径：1、理化生物造模手段诱发获得（诱发模型）2、传统定向培育或自发筛选获得（自发模型）-效果不确切不稳定-周期长-各种技术上和伦理的限制第45页，此课件共60页哦转基因动物应用转基因动物大量用于遗传病、传染病、肿瘤的研究，且以大鼠、小鼠和兔为主遗传病：单基因遗传疾病、多基因遗传疾病（舞蹈症、人囊性纤维化）传染病：突破病毒宿

24、主的特异性（乙肝小鼠、人脊髓灰质炎小鼠）肿瘤：肿瘤和基因的关系第46页，此课件共60页哦转基因动物应用转基因动物用于功能基因组研究体外研究-纸上谈兵基因结构和功能基因表达的组织特异性、时相特异性基因表达调控基因治疗：基因补偿、纠正、导入、反义RNA第47页，此课件共60页哦转基因动物应用转基因动物用于人体器官移植研究同种器官来源不足器官移植后免疫排斥利用转基因技术改造供体器官避免排斥反应，如关闭引起免疫应答的基因（猪 a-1,3-半乳糖转移酶基因）、替换动物补体调节蛋白因子基因（组织工程再造器官组织：人耳鼠）第48页，此课件共60页哦转基因动物应用用 转基因动物生产药物、生物制品动物生物反应器

25、（会走路的药厂）：将具有生物医学重要作用的生物活性物质基因导入动物DNA，从动物体收获基因产物（重组蛋白）第一批目标基因：血液产品第二批目标基因：抗体、激素、受体、细胞因子、疫苗、营养药物、食品等第49页，此课件共60页哦转基因动物应用乳腺生物反应器强大的蛋白合成能力，高品质收获、提取等后续工作简便独立的分泌系统，外源蛋白产物不影响自身功能实例小鼠-（人t-PA基因）-人源性组织纤溶酶原活化因子牛-（人乳铁蛋白基因）-人源化牛乳山羊-（人凝血酶III基因）-凝血酶第50页，此课件共60页哦转基因动物应用猪-（人血红蛋白基因）-猪血/人血液制品小鼠-（人生长激素基因）-小鼠尿液/人生长激素第51

26、页，此课件共60页哦胚胎工程胚胎工程针对：两性生殖细胞-囊胚目的：增加胚胎数量、提高胚胎质量应用：细胞生物学、发育生物学、生殖生物学第52页，此课件共60页哦胚胎工程超数排卵-10倍体外受精-提供大量受精卵胚胎培养-胚胎工程基本技术，各期胚胎培养难度不同胚胎冷冻保存-种质保存、转移胚胎移植-胚胎克隆、受精卵移植胚胎分割-同卵多胞胎胚胎嵌合-制造嵌合体核移植-体细胞核卵的激活和孤雌发育第53页，此课件共60页哦试管动物试管动物体外人工受精+早期胚胎培养+移植+代孕发育生物学研究克服生殖缺陷、定向培育提高繁殖力获得大量个体遵循遗传规律、有性生殖第54页，此课件共60页哦克隆克隆动物克隆-自我复制：

27、蛙-羊-小鼠-牛-猫-猪-猴经无性繁殖产生多个遗传上完全相同的个体利用细胞潜在全能性第55页，此课件共60页哦克隆胚胎分割-最简单的克隆人工干预多胞胎人工干预多胞胎将早期（未着床）胚胎分割后使其分别发育为完全相同的个体利用桑葚胚或更早期胚胎细胞的全能性不是严格意义上的克隆（无性繁殖）胚胎分割+融合：将两枚来自2对不同亲代具有不同遗传组成的胚胎分割后融合，突破传统生殖界限构成嵌合体，创造新物种，理论上可以融合无限多胚胎第56页，此课件共60页哦克隆核移植动物克隆的关键技术将供体细胞核导入去核卵母细胞（受体）构建胚胎并使之发育成个体体细胞核移植采用高度分化的体细胞为供体真正意义上的克隆动物唤醒基因

28、胚胎克隆胚胎细胞核移植采用早期胚胎细胞为供体比胚胎分割进一步第57页，此课件共60页哦多利羊的培育过程是：将一只母羊（A羊）卵细胞的细胞核吸出，得到不含核的卵细胞。然后，将实验室中培养的另一只母羊（B羊）的乳腺上皮细胞的细胞核注入到无细胞核的卵细胞中并进行电刺激，这样就通过核移植技术形成了一个同时含有B羊核遗传物质和A羊细胞质的重组卵细胞。融合后的卵细胞经过体外细胞培养形成早期胚胎。然后把这个胚胎移植到第三只羊（C羊）的子宫中，让C羊为胚胎发育提供发育场所和营养物质，这个过程利用了胚胎移植技术。胚胎就在C羊子宫内发育成熟。C羊产下的羊就是克隆羊多利。多利产生的过程中没有使用基因工程技术。第58页，此课件共60页哦克隆体细胞克隆的应用体细胞克隆大规模复制特定品种：如优良品种、转基因品种干细胞治疗：患者细胞-重组胚胎-培育-分离ES细胞-诱导定向分化-导入患者体内（多能干细胞：具有分化为多种细胞的潜能，但失去发育成完整个体的能力）组织再生：如神经组织第59页，此课件共60页哦第60页，此课件共60页哦