第三液相色谱法.ppt

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1、第三液相色谱法第三液相色谱法现在学习的是第1页，共51页现在学习的是第2页，共51页现在学习的是第3页，共51页4.1.1 特点特点 特点：高压、高效、高速、高灵敏度特点：高压、高效、高速、高灵敏度 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。现在学习的是第4页，共51页4.1.2.流程流程现在学习的是第5页，共51页4.1.3.主要部件主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇

2、乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯氯仿仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)现在学习的是第19页，共51页4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱

3、子。柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。）化铝固定相等。）（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（d）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，器时，流动相不应有紫外吸收。流动相不应有紫外吸收。现在学习的是第20页，共51页4.2.1.液液-固吸附色谱固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography 固定相：为为固固体体吸吸附附剂剂，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，

4、较较常常使使用用的的是是510 m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸；：组分在固定相上的吸附与解吸；适适用用于于分分离离相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，对对具具有有官官能能团团的化合物和异构体有较高选择性；的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；4.2 主要分离类型与基本原理现在学习的是第21页，共51页有机氯农药残留量分析有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷

5、流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。量进行分析。现在学习的是第22页，共51页4.2.2.液液-液分配色谱液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动

6、动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（正正相相 normal phase），反反之之，流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性（反反相相 reverse phase）。正正相相与与反反相的出峰顺序相反。相的出峰顺序相反。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六二氧六环环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲二氯甲烷烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小

7、)现在学习的是第23页，共51页固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由由氧氧化化硅硅、氧氧化化铝铝、硅硅藻藻土土等等制制成成的的多多孔孔球球体体；早早期期采采用用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）3040m的的玻玻璃璃微微球球，表表面面附附着着一一层层厚厚度度为为1 2m的的多孔硅胶。多

8、孔硅胶。表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底；现在学习的是第24页，共51页 化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广（3）化学键合固定相）化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应：将各种不同基团通过化学反应 键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。现在学习的是第25页，共51页化学

9、键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；现在学

10、习的是第26页，共51页稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器现在学习的是第27页，共51页4.2.3.离子交换色谱离子交换色谱 ion-exchange chromatography 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴阴离离子子离离子子交

11、交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用酸酸性性水水溶溶液液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液碱性水溶液；基本原理：组组分分在在固固定定相相上上发发生生的的反反复复离离子子交交换换反反应应；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、电电荷荷、存存在在形形式式等等有关。亲和力大，保留时间长。有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +H+阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。现在学

12、习的是第28页，共51页离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相 结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1）阳阳离离子子交交换换树树脂脂（强强酸酸性性、弱酸性）弱酸性）（2）阴阴离离子子交交换换树树脂脂（强强碱碱性性、弱碱性）弱碱性）现在学习的是第29页，共51页4.2.4.离子对色谱离子对色谱 ion pair chromatography 原理：将将一一种种（或或多多种种）与与溶溶质质离离子子电电荷荷

13、相相反反的的离离子子（对对离离子子或或反反离离子子）加加到到流流动动相相中中使使其其与与溶溶质质离离子子结结合合形形成成疏疏水水性性离离子子对对化化合合物物，使其能够在两相之间进行分配；使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常常采采用用烷烷基基铵铵类类，如如氢氢氧氧化化四四丁丁基基铵铵或或氢氢氧氧化十六烷基三甲铵作为对离子；化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非非极极性性的的疏疏水水固固定定相相(C-18柱柱)，含含有有阳阳离离子子Y+的的甲甲醇醇-水水或或乙乙腈腈-水水作作为为流流动动

14、相相，试试样样离离子子X-进进入入流流动动相相后，生成疏水性离子对后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。后；在两相间分配。现在学习的是第30页，共51页4.2.5.尺寸排斥色谱尺寸排斥色谱size-exclusion chromatography 原理：按按分分子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散到到凝凝胶胶空空隙隙，由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶溶剂剂分分子子小小，故故在在最后出峰。最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出

15、峰；可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-105范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离 现在学习的是第31页，共51页M.W.tR现在学习的是第32页，共51页M.W.tR现在学习的是第33页，共51页M.W.tR现在学习的是第34页，共51页M.W.tR现在学习的是第35页，共51页4.2.6.亲和色谱亲和色谱 Affinity chromatograph 原理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲亲和和力，进行选择性分离。力，进行选择性分离。先先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的所所

16、谓谓间间隔隔臂臂(环环氧氧、联联胺胺等等)，再再连连接接上上配配基基(酶酶、抗抗原原等等)，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保保留留。改改变变淋洗液后洗脱。淋洗液后洗脱。现在学习的是第36页，共51页以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七在七十年代出现、八十年代迅速发展。十年代出现、八十年代迅速发展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗

17、脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。4.3 离子色谱法离子色谱法现在学习的是第37页，共51页1.离子色谱法原理离子色谱法原理 离离子子交交换换原原理理，与与传传统统离离子子交交换的不同点：换的不同点：采采用用交交换换容容量量非非常常低低的的特特制制离离子子交交换换树树脂为固定相；脂为固定相；细细颗颗粒粒柱柱填填料料，高高柱柱效效；采采用用高高压压输输液液泵；泵；低低浓浓度度淋淋洗洗液液或或本本底底电电导导抑抑制制（在在分分离离柱柱后后，采采用用抑抑制制柱柱来来消消除除淋淋洗液的高本底电导）；洗液的高本底电导）；可采

18、用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。现在学习的是第38页，共51页离子色谱连续抑制装置图离子色谱连续抑制装置图现在学习的是第39页，共51页4 离子色谱的应用离子色谱的应用阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流流动动相相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量，流量138 mL/hr。七七种种阴阴离离子子在在20分分钟钟内内基基本本上上得得到到完完全

19、全分分离离，各各组组分分含含量量在在350 ppm。现在学习的是第40页，共51页1.概述 超超临临界界流流体体：在在高高于于临临界界压压力力与与临临界界温温度度时时，物物质质的的一一种种状状态。性质介于液体和气体之间。态。性质介于液体和气体之间。超超临临界界流流体体色色谱谱(SFC)，8080年年代代快快速速发发展展，具具有有液液相相、气气相相色色谱谱不不具有的优点具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比）比LC有更高的柱效和分离效率。有更高的柱效和分离效率。4.4 超临界色谱超临界色谱(SFC)Supercritical Fluid Chromato

20、graph现在学习的是第41页，共51页2.超临界流体性质超临界流体性质（1 1）性质介于液体和气体之间）性质介于液体和气体之间;具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。（2 2）可可通通过过改改变变超超临临界界流流体体的的密密度度（程程序序改改变变）调调节节组组分分分分离离（类类似似于于气气相相色色谱谱的的程程序序升升温温，液液相相色色谱谱中中的的梯梯度度淋淋洗洗）。超超临临界界流流体体的的密度与压力有关。密度与压力有关。现在学习的是第42页，共51页3.原理原理 SFC的流动相：超临界流体；的流动相：超临界流体；CO2、N

21、2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细和毛细管柱管柱SFC。分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离。分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离。通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值。通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值。现在学习的是第43页，共51页程程序序升升压压现在学习的是第44页，共51页1.结构流程 现在学习的是第45页，共51页2

22、.主要部件主要部件（1）SFC的高压泵的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；机控制流动相的密度和流量；（2）SFC的色谱柱和固定相的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；现在学习的是第46页，共51页（3）流动相）流动相 SFC的流动相：超临界流体；的流动相：超临界流体；CO2

23、、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；性；（4）检测器）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器检测器现在学习的是第47页，共51页蜂皇浆中壬烯双酸的分析蜂皇浆中壬烯双酸的分析LC 说明说明 蜂皇浆作为食品和中药已广为人知，但其中的蜂皇浆作为食品和中药已广为人知，但其中的10羟基羟基壬烯双酸壬烯双酸(10-HDA)是蜂皇浆中的特有成分，

24、它的含量和检是蜂皇浆中的特有成分，它的含量和检查方法是蜂皇浆组成基准中的重要项目。它的分析例如下所示。查方法是蜂皇浆组成基准中的重要项目。它的分析例如下所示。前处理法前处理法 采取一定量的试样，加蒸馏水混合溶解，加一定量的内标采取一定量的试样，加蒸馏水混合溶解，加一定量的内标(安安息香酸息香酸/甲醇甲醇)后，用后，用0.45m的一次性过滤器过滤。的一次性过滤器过滤。现在学习的是第48页，共51页 分析条件：分析条件：柱柱：STR ODS-II(4.6mm150mm)流动相流动相：10mM磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液/甲醇甲醇=55/45(V/V)流量流量：1.0mL/min 温度：温度：40 检测

25、检测：紫外吸光度：紫外吸光度=210nm 内标物质壬烯双酸现在学习的是第49页，共51页 离子交换色谱法检测三聚氰胺离子交换色谱法检测三聚氰胺1.提取液提取液:乙腈乙腈2.流动相流动相:0.05%磷酸二氢钾水溶液磷酸二氢钾水溶液-乙腈乙腈(70:30)3.色谱柱色谱柱:SCX离子交换色谱柱离子交换色谱柱(250mm4.6mm)4.检测检测器器:紫外检测紫外检测器器,波波长长 240nm现在学习的是第50页，共51页LC-MS(高效液相色谱高效液相色谱-质谱联用质谱联用)检测三聚氰检测三聚氰胺胺 色谱条件色谱条件 流动相流动相:乙酸铵水溶液乙酸铵水溶液-甲醇甲醇(90:10)色谱柱色谱柱:C18反向柱反向柱 150mm 2.1mm 质谱质谱条件条件 电电离方式离方式:电喷雾电电喷雾电离源离源(ESI)现在学习的是第51页，共51页