第四章补充沉淀分离与结晶课件.ppt

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1、第四章补充沉淀分离与结晶第1页，此课件共60页哦通过改变溶液条件，使溶质的溶解度降低通过改变溶液条件，使溶质的溶解度降低而以固体形式从溶液中分离出的一种操作而以固体形式从溶液中分离出的一种操作技术。技术。盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法结晶法结晶法2第2页，此课件共60页哦第一节第一节 盐析法盐析法 (salt precipitation)定义：盐析法是利用各种生物分子定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使性盐，使目的物目的物或或杂蛋白杂蛋白以沉淀以沉淀析出

2、析出，达到纯化目的的方法。，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐缺点：分辨率不高，要除盐3第3页，此课件共60页哦两种现象：两种现象：盐溶盐溶：低盐情况，盐离子：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶强度的增高，蛋白质溶解度增大解度增大盐析盐析：高盐，盐离子强度：高盐，盐离子强度增加，蛋白质增加，蛋白质溶解度减溶解度减小小4第4页，此课件共60页哦蛋白质盐析向蛋白质溶液中加入一定浓度的无机盐(NH4)2SO4或Na2SO4溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性

3、质。因此，盐析是一个可逆的过程。利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。第5页，此课件共60页哦蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。第6页，此课件共60页哦由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不

4、同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。第7页，此课件共60页哦一、基本原理一、基本原理8第8页，此课件共60页哦原理原理1.形成形成离子对离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。用减弱而能相互靠拢，聚集起来。2.中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白

5、质脱去了水化膜水化膜，使其沉淀。，使其沉淀。9第9页，此课件共60页哦蛋白质溶解度与离子强度关系蛋白质溶解度与离子强度关系loglogS S=-K Ks s S S蛋白质溶解度蛋白质溶解度，g/Lg/L；盐离子强度盐离子强度,C Ci ii i离子浓度，离子浓度，mol/Lmol/L；Z Zi ii i离子化合价；离子化合价；常数常数,为纵坐标上的截距为纵坐标上的截距;K Ks s盐析常数盐析常数。10第10页，此课件共60页哦、K KS S 为纵坐标上的截距，为纵坐标上的截距，为纵坐标上的截距，为纵坐标上的截距，是外推截距是外推截距，与无机盐种，与无机盐种类无关。类无关。KSKS是盐析常数是

6、盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和温度和pHpH无关。无关。两种类型：两种类型：（1 1 1 1）在一定的）在一定的）在一定的）在一定的pHpH和温度下改变离子强度（盐浓度）和温度下改变离子强度（盐浓度）和温度下改变离子强度（盐浓度）和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作进行盐析，称作进行盐析，称作进行盐析，称作KsKs盐析法盐析法。（2 2）在一定离子强度下仅改变）在一定离子强度下仅改变）在一定离子强度下仅改变）在一定离子强度下仅改变pHpH和温度进行盐析，和温度进行盐析，称作称作盐析法盐析法。11第11页，此课件共60页哦（一）、无机盐的种类（

7、一）、无机盐的种类 盐盐析析能能力力：半半径径小小的的高高价价离离子子在在盐盐析析时时的的作作用用较较强强，阴阴离离子子的的盐盐析析效效果果比比阳阳离离子子好好，尤尤其其以以高高价价阴阴离离子子更更为明显。为明显。PO4 3-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵12二、影响盐析的因素二、影响盐析的因素第12页，此课件共60页哦(二）溶质（蛋白质等）种类的影响二）溶质（蛋白质等）种类的影响13第13页，此课件共60页哦（三）蛋白质浓度的影响（三）蛋白质浓度的影响蛋白质浓度提蛋白质浓度提高，盐用量减高，盐用量

8、减少。少。14第14页，此课件共60页哦（四）温度的影响（四）温度的影响温度的变化会影响温度的变化会影响 值。值。在无盐或稀盐溶液中，大在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在度升高而增大的，但在高高盐溶液中常相反盐溶液中常相反。15第15页，此课件共60页哦（五）（五）pHpH的影响的影响当溶液的当溶液的pHpH在蛋白质等在蛋白质等电点附近时，电点附近时，值最小。值最小。利用利用 值最低点时值最低点时pHpH的不的不同，可以分级沉淀蛋白同，可以分级沉淀蛋白质质.16第16页，此课件共60页哦(六六)盐的饱和度盐的饱和度不同蛋白质的盐析要求的盐的饱

9、和度不一样；分段盐析法。第17页，此课件共60页哦三、盐析基本操作三、盐析基本操作 1.1.中性盐的选择；中性盐的选择；2.pH2.pH的选择；的选择；3.3.温度与时间的控制；温度与时间的控制；4.4.饱和度。饱和度。18第18页，此课件共60页哦（二）盐析方法和注意事项（二）盐析方法和注意事项 1 1、分步盐析法分步盐析法2 2、重复盐析法、重复盐析法 3 3、反抽提法反抽提法 一定的盐浓度下将一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量的目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度盐溶将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。液平衡，溶出其中的杂蛋白。19第19页，此课件

10、共60页哦分部盐析法分部盐析法20第20页，此课件共60页哦反抽提法反抽提法(RNA(RNA聚合酶聚合酶)21第21页，此课件共60页哦注意事项注意事项“局部过浓局部过浓”：少量多次加入；少量多次加入；温度温度 （室温）（室温）加入加入方法方法：1.固体法：搅拌下，少量多次加入；固体法：搅拌下，少量多次加入；2.饱和溶液法饱和溶液法:在蛋白质溶液中加入预先调好在蛋白质溶液中加入预先调好pH的（的（NH4)2SO4溶液；溶液；3.透析法透析法:将盛蛋白质溶将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的（液的透析袋放入一定浓度的（NH4)2SO4溶液中，溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。使用通过

11、透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。使用于小体积样品。于小体积样品。22第22页，此课件共60页哦第二节第二节 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀(Organic Solvent Precipitation)(Organic Solvent Precipitation)定义：向水溶液中加入一定义：向水溶液中加入一定量定量亲水性亲水性的有机溶剂，的有机溶剂，降低溶质的降低溶质的溶解度溶解度，使，使其沉淀析出的分离纯化方其沉淀析出的分离纯化方法。法。23第23页，此课件共60页哦1 1、降低了介质的、降低了介质的介电常数介电常数，使溶质分子之间，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。的静电引力增加，聚集

12、形成沉淀。2 2、水溶性有机溶剂本身的、水溶性有机溶剂本身的水合作用水合作用降低了自由降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水水化层的厚度化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。凝集。24一、基本原理一、基本原理第24页，此课件共60页哦一些溶剂的介电常数一些溶剂的介电常数 25第25页，此课件共60页哦优点：优点：乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，密度差较大，可可通过通过离心收集。离心收集。缺点：缺点：容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本容易使蛋白质变性，操作常需低温，成

13、本高，需高，需防火防爆防火防爆。26第26页，此课件共60页哦二、影响沉淀效果的因素二、影响沉淀效果的因素 （一）有机溶剂种类及用量（一）有机溶剂种类及用量 常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。（二）（二）pHpH的影响的影响 许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pHpH应在应在等电点附近等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。，还须考虑蛋白质的稳定性。27第27页，此课件共60页哦（三）温度（三）温度（低温沉淀低温沉淀）有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。随温度降低

14、而显著地减小。（四）无机盐的含量（四）无机盐的含量 低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。性。高盐高盐：增大蛋白质在有机溶剂：增大蛋白质在有机溶剂水溶液中水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。28第28页，此课件共60页哦 多价阳离子，如多价阳离子，如CaCa2+2+2+2+、ZnZn2+2+2+2+能与蛋白质结合形成复能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。合物，使蛋白质溶解度降低。胰岛素精制：胰岛素精制：胰岛素精制：胰岛素精制：29（五）某些金属离子的助沉淀作用（五）某些金属离子的助沉淀作用第29页，此课件共

15、60页哦（六）样品浓度（六）样品浓度 浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白质浓度蛋白质浓度0.5%0.5%2%2%；粘多糖浓度粘多糖浓度1%1%2%2%。30第30页，此课件共60页哦第三节第三节 其它沉淀方法其它沉淀方法 一、等电点沉淀法一、等电点沉淀法 对于两性物质，等电点时净电荷为零，对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间分子间排斥电位降低排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，吸引力增大，能相互聚集起来，发生

16、沉淀。发生沉淀。31第31页，此课件共60页哦胰岛素纯化：胰岛素纯化：胰岛素胰岛素 pH8pH8 除去碱性杂蛋白除去碱性杂蛋白 pH3 除去酸性杂蛋白除去酸性杂蛋白 32第32页，此课件共60页哦蛋白质等电点沉淀在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。第33页，此课件共60页哦金属离子沉淀：与生物分子的金属离子沉淀：与生

17、物分子的酸性功能团酸性功能团作用的作用的金属复合盐法金属复合盐法；有机酸沉淀有机酸沉淀:与生物分子的与生物分子的碱性功能团碱性功能团作用作用的的有机酸复合盐法有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸（如苦味酸盐、苦酮酸盐、盐、单单宁酸盐等）。宁酸盐等）。34二、成盐沉淀法二、成盐沉淀法第34页，此课件共60页哦 1 1金属离子沉淀：金属离子沉淀：MnMn2+2+、FeFe2+2+、CoCo2+2+、NiNi2+2+、ZnZn2+2+、CaCa2+2+、BaBa2+2+、MgMg2+2+等；等；2 2生成有机酸类复合盐沉淀生成有机酸类复合盐沉淀（1 1）单单宁即鞣酸宁即鞣酸 （2 2）雷凡诺雷凡诺 （

18、3 3）三氯乙酸（三氯乙酸（TCATCA）35第35页，此课件共60页哦雷凡诺雷凡诺 36第36页，此课件共60页哦猪心提取液猪心提取液 洗脱液洗脱液 上清液上清液 上清上清 细胞色素细胞色素C C 沉淀（去除）沉淀（去除）37吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀TCA透析第37页，此课件共60页哦三、亲和沉淀三、亲和沉淀 利用亲和反应原理，利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载将配基与可溶性的载体偶联后形成体偶联后形成载体载体-配配配配基复合物（亲和沉淀剂）基复合物（亲和沉淀剂）基复合物（亲和沉淀剂）基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地，该复合物可选择性地，该复合物可选择性地，该复合物可

19、选择性地与蛋白质结合，在一定与蛋白质结合，在一定与蛋白质结合，在一定与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。条件下沉淀出来。条件下沉淀出来。条件下沉淀出来。中性可溶，酸性沉淀。中性可溶，酸性沉淀。38第38页，此课件共60页哦 39第39页，此课件共60页哦四、四、高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀 水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（量的聚乙二醇（PEGPEG）、葡聚糖、右旋糖苷）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使硫酸酯等，能使蛋白质水合作用减弱而发蛋白质水合作用减弱而发生沉淀生沉淀。五、表面活性剂五、表面活性剂沉淀沉淀 十六烷基三甲基季胺溴化物

20、（十六烷基三甲基季胺溴化物（CTABCTAB）十六烷基氯化吡啶（十六烷基氯化吡啶（CPCCPC）40酸性多酸性多糖糖第40页，此课件共60页哦41第41页，此课件共60页哦六、选择性变性沉淀法六、选择性变性沉淀法热变性沉淀法热变性沉淀法酸碱变性沉淀法酸碱变性沉淀法利用试剂（氯仿）利用试剂（氯仿）42第42页，此课件共60页哦第四节第四节 结晶结晶(crystallization)(crystallization)定义：定义：溶液中的溶质在一定条件下因分子溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。有规则的排列而结合成晶体。通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母通过结晶，溶液中的大部分

21、杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到液中，经过滤、洗涤可得到纯度高纯度高的晶体。的晶体。43第43页，此课件共60页哦结晶的方法一般有2种：一种是蒸发溶剂法，它适用于温度对溶解度影响不大的物质。沿海地区“晒盐”就是利用的这种方法。另一种是冷却热饱和溶液法。此法适用于温度升高，溶解度也增加的物质。如北方地区的盐湖，夏天温度高，湖面上无晶体出现；每到冬季，气温降低，石碱(Na2CO310H2O)、芒硝(Na2SO4 10H2O)等物质就从盐湖里析出来。在实验室里为获得较大的完整晶体，常使用缓慢降低温度，减慢结晶速率的方法。第44页，此课件共60页哦晶体在一定条件下所形成的特定晶形，称为晶习。向溶液

22、添加或自溶液中除去某种物质(称为晶习改变剂)可以改变晶习，使所得晶体具有另一种形状。这对工业结晶有一定的意义。晶习改变剂通常是一些表面活性物质以及金属或非金属离子。第45页，此课件共60页哦一、结晶过程一、结晶过程指溶指溶质质自自动动从从过饱过饱和溶液和溶液中析出形成新相的中析出形成新相的过过程程。C C2 2 小晶体的溶解度小晶体的溶解度；C C1 1 普通晶体的溶解度；普通晶体的溶解度；晶体密度；晶体密度；M M 晶体质量；晶体质量；晶体与溶液间的界面张力；晶体与溶液间的界面张力；2 2 小晶体的半径小晶体的半径；1 1 普通晶体的半径；普通晶体的半径；46第46页，此课件共60页哦结晶包

23、括三个过程：结晶包括三个过程：(1)(1)形成形成过饱和溶液过饱和溶液;(2)(2)晶核形成晶核形成;(3)(3)晶体生长。晶体生长。47第47页，此课件共60页哦晶核生成（成核）和晶体生长两个阶段，两个阶段的推动力都是溶液的过饱和度（溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值）。晶核的生成有三种形式：即初级均相成核、初级非均相成核及二次成核。在高过饱和度下，溶液自发地生成晶核的过程，称为初级均相成核；溶液在外来物（如大气中的微尘）的诱导下生成晶核的过程，称为初级非均相成核；而在含有溶质晶体的溶液中的成核过程，称为二次成核。二次成核也属于非均相成核过程，它是在晶体之间或晶体与其他固体（器壁、搅拌器等

24、）碰撞时所产生的微小晶粒的诱导下发生的。第48页，此课件共60页哦浓度温度图浓度温度图49第49页，此课件共60页哦二、过饱和溶液的形成二、过饱和溶液的形成(结晶方法结晶方法)（一）、蒸发法、冷却法（一）、蒸发法、冷却法（二）、（二）、温度诱导法温度诱导法（三）、（三）、盐析结晶法盐析结晶法（四）、透析结晶法（四）、透析结晶法（五）、有机溶剂结晶法（五）、有机溶剂结晶法 50第50页，此课件共60页哦温度诱导法温度诱导法51第51页，此课件共60页哦盐析结晶法盐析结晶法52第52页，此课件共60页哦透析结晶法透析结晶法53第53页，此课件共60页哦（六）、（六）、等电点法等电点法（七）、微量扩

25、散法（七）、微量扩散法 （八）、（八）、化学反应结晶法化学反应结晶法 调节溶液的调节溶液的pHpH或向溶液中加入或向溶液中加入反应剂反应剂，生，生成新物质，结晶析出。成新物质，结晶析出。（九）、共沸蒸馏结晶（九）、共沸蒸馏结晶 54第54页，此课件共60页哦等电点法等电点法55第55页，此课件共60页哦化学反应结晶法化学反应结晶法56第56页，此课件共60页哦综合利用综合利用57第57页，此课件共60页哦三、提高晶体质量的途径三、提高晶体质量的途径 工业上通常希望得到工业上通常希望得到粗大而均匀粗大而均匀的晶体，的晶体，便于过滤与洗涤。便于过滤与洗涤。（一）、晶体大小（一）、晶体大小 影影响响

26、晶体大小的主要因素有晶体大小的主要因素有过饱和度过饱和度、温、温度、搅拌速度、晶种度、搅拌速度、晶种等。等。58第58页，此课件共60页哦晶种晶种59第59页，此课件共60页哦（二）、晶体形状（二）、晶体形状 改变晶体外形，可用改变晶体外形，可用:选择不同的溶剂、选择不同的溶剂、控制过控制过饱和度、饱和度、结晶温度结晶温度、调节溶液的、调节溶液的pHpH和有目的地加和有目的地加入某种能改变晶形的杂质等。入某种能改变晶形的杂质等。（三）、晶体纯度（三）、晶体纯度 由于由于晶体表面具有一定的物理吸附能力晶体表面具有一定的物理吸附能力，因此表因此表面上有很多母液和杂质黏附在晶体上。晶体愈细小面上有很多母液和杂质黏附在晶体上。晶体愈细小，表面积越大，表面自由能越高，吸附杂质愈多。，表面积越大，表面自由能越高，吸附杂质愈多。60第60页，此课件共60页哦