细胞产物分析技术细胞产物分离方法讲稿.ppt

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1、关于细胞产物分析技术细胞产物分离方法第一页，讲稿共九十一页哦样品的预处理样品的预处理细胞产物的提取细胞产物的提取细胞产物的分离细胞产物的分离产物的分析鉴定产物的分析鉴定经典分离方法经典分离方法红外光谱红外光谱紫外可见光谱紫外可见光谱色谱分离法色谱分离法质质 谱谱核磁共振谱核磁共振谱第二页，讲稿共九十一页哦经典分离方法经典分离方法液液-液萃取法液萃取法l l利用组分在两个互不相溶的液相中的溶解度差异而将其从一利用组分在两个互不相溶的液相中的溶解度差异而将其从一利用组分在两个互不相溶的液相中的溶解度差异而将其从一利用组分在两个互不相溶的液相中的溶解度差异而将其从一个液相转移到另一个液相的分离过程称

2、为液液萃取，也叫溶个液相转移到另一个液相的分离过程称为液液萃取，也叫溶个液相转移到另一个液相的分离过程称为液液萃取，也叫溶个液相转移到另一个液相的分离过程称为液液萃取，也叫溶剂萃取，简称萃取。剂萃取，简称萃取。剂萃取，简称萃取。剂萃取，简称萃取。l l待分离的一相称为待分离的一相称为待分离的一相称为待分离的一相称为被萃相被萃相被萃相被萃相，萃取后成为，萃取后成为，萃取后成为，萃取后成为萃余相萃余相，用做分离剂，用做分离剂，用做分离剂，用做分离剂的相的相的相的相 称为称为称为称为萃取相萃取相萃取相萃取相。第三页，讲稿共九十一页哦经典分离方法经典分离方法液液-液萃取法液萃取法 l l被萃取组分在萃

3、取相中的溶解度要大于被萃取相。被萃取组分在萃取相中的溶解度要大于被萃取相。被萃取组分在萃取相中的溶解度要大于被萃取相。被萃取组分在萃取相中的溶解度要大于被萃取相。l l一般一相为水相，一相为有机相。在水相中增加一般一相为水相，一相为有机相。在水相中增加盐离子浓度可以降低有机相在水中的溶解度。盐离子浓度可以降低有机相在水中的溶解度。l l萃取应采用少量多次原则。萃取应采用少量多次原则。l l从水相中萃取有机物质时，单级萃取时一般选择该从水相中萃取有机物质时，单级萃取时一般选择该从水相中萃取有机物质时，单级萃取时一般选择该从水相中萃取有机物质时，单级萃取时一般选择该物质的最佳溶剂。多级萃取溶剂选择

4、一般从弱极性物质的最佳溶剂。多级萃取溶剂选择一般从弱极性物质的最佳溶剂。多级萃取溶剂选择一般从弱极性物质的最佳溶剂。多级萃取溶剂选择一般从弱极性强极性。强极性。强极性。强极性。l l密度：石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丁醇、苯密度：石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丁醇、苯密度：石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丁醇、苯密度：石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丁醇、苯 水水水水 600m600m2 2/g/g0.4ml/g0.4ml/g150-180m150-180m80-10080-10020-30A20-30A 600m600m2 2/g/g0.4ml/g0.4ml/g125-180m125-180m80-12080-120

5、20-30A20-30A 600m600m2 2/g/g0.4ml/g0.4ml/g75-150m75-150m100-200100-20020-30A20-30A 600m600m2 2/g/g0.4ml/g0.4ml/g45-75m45-75m200-300200-30020-30A20-30A 600m600m2 2/g/g0.4ml/g0.4ml/g柱层析硅胶（粗孔）柱层析硅胶（粗孔）柱层析硅胶（粗孔）柱层析硅胶（粗孔）粒度粒度粒度粒度 目数目数目数目数 平均孔径平均孔径平均孔径平均孔径 比表面积比表面积比表面积比表面积 孔体积（约）孔体积（约）孔体积（约）孔体积（约）180-250m

6、180-250m60-10060-10080-100A80-100A 300-400m300-400m2 2/g/g0.8ml/g0.8ml/g125-180m125-180m80-12080-12080-100A80-100A 300-400m300-400m2 2/g/g0.8ml/g0.8ml/g75-150m75-150m100-200100-20080-100A80-100A 300-400m300-400m2 2/g/g0.8ml/g0.8ml/g45-75m45-75m200-300200-30080-100A80-100A 300-400m300-400m2 2/g/g0.8m

7、l/g0.8ml/g第四十九页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l常用固定相常用固定相常用固定相常用固定相硅胶硅胶硅胶硅胶硅胶的吸附性能取决于硅硅胶的吸附性能取决于硅硅胶的吸附性能取决于硅硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅醇基的数及含水量。胶中硅醇基的数及含水量。胶中硅醇基的数及含水量。胶中硅醇基的数及含水量。随着水分的增加吸附能力随着水分的增加吸附能力降低。若吸水量超过降低。若吸水量超过降低。若吸水量超过降低。若吸水量超过1212，吸附力极弱，不能用做吸附色谱，只可用于分配色谱的载吸附力极弱，不能用做吸附色谱，只可用于分配色谱的载吸附力极弱，不能用做吸附色谱，只可用于分配色谱的

8、载吸附力极弱，不能用做吸附色谱，只可用于分配色谱的载体。体。体。体。硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响着色谱分离的效果。着色谱分离的效果。着色谱分离的效果。着色谱分离的效果。第五十页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l常用固定相常用固定相硅胶硅胶硅胶应是中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸常带硅胶应是中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸常带硅胶应是中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸常带硅胶应是中性无色

9、颗粒，由于制备过程中接触强酸常带有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度不低于有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度不低于有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度不低于有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度不低于p pHH5 时才可使用；否则应用水洗至中性再在时才可使用；否则应用水洗至中性再在时才可使用；否则应用水洗至中性再在时才可使用；否则应用水洗至中性再在110110活化活化活化活化2424小时。小时。小时。小时。硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约为硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约为硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约为硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶

10、解性，约为0.010.01。在。在。在。在pH=9pH=9以上，则溶解度急剧上升。以上，则溶解度急剧上升。以上，则溶解度急剧上升。以上，则溶解度急剧上升。有时可以向硅胶中掺入某种试剂以改良吸附性能，提高有时可以向硅胶中掺入某种试剂以改良吸附性能，提高有时可以向硅胶中掺入某种试剂以改良吸附性能，提高有时可以向硅胶中掺入某种试剂以改良吸附性能，提高分离效果。通常用硝酸银处理过的硅胶对不饱和烃类有分离效果。通常用硝酸银处理过的硅胶对不饱和烃类有分离效果。通常用硝酸银处理过的硅胶对不饱和烃类有分离效果。通常用硝酸银处理过的硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。改良吸附剂的制备一般是将含极好的分离作用。改良

11、吸附剂的制备一般是将含极好的分离作用。改良吸附剂的制备一般是将含极好的分离作用。改良吸附剂的制备一般是将含1 1 1010填加试剂的水或丙酮溶液与硅胶混匀，稍后于填加试剂的水或丙酮溶液与硅胶混匀，稍后于填加试剂的水或丙酮溶液与硅胶混匀，稍后于填加试剂的水或丙酮溶液与硅胶混匀，稍后于110110干干干干燥即可。燥即可。燥即可。燥即可。第五十一页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l常用固定相常用固定相常用固定相常用固定相硅胶硅胶硅胶硅胶硅胶的再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂烘硅胶的再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂烘干活化处理即可使用。必要时用干活化处理即可使用。必要时用

12、0.5氢氧化钠水溶氢氧化钠水溶液浸泡洗涤、过滤、水洗，再以液浸泡洗涤、过滤、水洗，再以510盐酸浸泡盐酸浸泡洗涤最后用蒸馏水洗至中性，洗涤最后用蒸馏水洗至中性，110活化，过筛即可。活化，过筛即可。5050 200m200m的硅胶每克吸附剂承载的硅胶每克吸附剂承载的硅胶每克吸附剂承载的硅胶每克吸附剂承载10mg10mg样品样品样品样品，吸附剂每吸附剂每吸附剂每吸附剂每克硅胶载样克硅胶载样克硅胶载样克硅胶载样30mg30mg时时时时只能用于被分离物质的只能用于被分离物质的只能用于被分离物质的只能用于被分离物质的RfRf值差别很值差别很值差别很值差别很大的情况大的情况大的情况大的情况。上样较多上样

13、较多上样较多上样较多时时可达到过滤的目的。可达到过滤的目的。第五十二页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l常用固定相常用固定相常用固定相常用固定相氧化铝氧化铝氧化铝氧化铝色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝铝铝铝pH约为约为约为约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝性氧化铝性氧化铝性氧化铝pH

14、pH值为值为7.57.5，用于分离中性物质，应用最广；碱，用于分离中性物质，应用最广；碱，用于分离中性物质，应用最广；碱，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝性氧化铝性氧化铝性氧化铝pHpH为为为为9-109-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。等。等。等。吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。第五十三页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱

15、l l常用固定相常用固定相常用固定相常用固定相氧化铝氧化铝常用规格：常用规格：常用规格：常用规格：5050100100目、目、100100200200目、目、目、目、200300300目、目、目、目、300300400400目、目、目、目、400500500目、目、目、目、500500目以上目以上外观外观外观外观白色微球和沙状白色微球和沙状白色微球和沙状白色微球和沙状白色微球白色微球白色微球白色微球 白色微球白色微球白色微球白色微球 粒径粒径粒径粒径(m)75(%)(m)75(%)250250250250250250 PHPH值值值值 4.54.55.55.56.56.57.57.58 8 酸

16、碱度酸碱度酸碱度酸碱度 酸性酸性酸性酸性 中性中性中性中性 碱性碱性碱性碱性 第五十四页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l常用固定相常用固定相常用固定相常用固定相聚酰胺聚酰胺聚酰胺聚酰胺由酰胺聚合而成的一类高分子物质，又由酰胺聚合而成的一类高分子物质，又由酰胺聚合而成的一类高分子物质，又由酰胺聚合而成的一类高分子物质，又称锦纶、尼龙称锦纶、尼龙称锦纶、尼龙称锦纶、尼龙等，等，等，等，层析常用的层析常用的层析常用的层析常用的是是是是锦纶锦纶锦纶锦纶6 6和锦纶和锦纶和锦纶和锦纶6666；其单体物质是已内酰胺、已二胺和已二酸。其单体物质是已内酰胺、已二胺和已二酸。分子中的酰胺

17、键是其结构的重要部分分子中的酰胺键是其结构的重要部分，酰胺键也是与其酰胺键也是与其酰胺键也是与其酰胺键也是与其它极性键基团产生氢键的物质基础。它极性键基团产生氢键的物质基础。它极性键基团产生氢键的物质基础。它极性键基团产生氢键的物质基础。l l是是是是吸附层析吸附层析吸附层析吸附层析，酰胺键与物质分子中的极性键的相互作酰胺键与物质分子中的极性键的相互作酰胺键与物质分子中的极性键的相互作酰胺键与物质分子中的极性键的相互作用用应该应该应该应该是吸附作用的主要原因是吸附作用的主要原因是吸附作用的主要原因是吸附作用的主要原因；分离物质的氢键作用是聚酰胺分离物质的氢键作用是聚酰胺层析的根本原因层析的根本

18、原因；但非氢键物质也可用聚酰胺进行分离。但非氢键物质也可用聚酰胺进行分离。但非氢键物质也可用聚酰胺进行分离。但非氢键物质也可用聚酰胺进行分离。原理目前尚未完全阐明。原理目前尚未完全阐明。原理目前尚未完全阐明。原理目前尚未完全阐明。第五十五页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l常用固定相常用固定相常用固定相常用固定相聚酰胺聚酰胺通常有两种杂质：一种是蜡质通常有两种杂质：一种是蜡质，另一种是锦纶的聚合原另一种是锦纶的聚合原另一种是锦纶的聚合原另一种是锦纶的聚合原料单体及其小分子聚合物料单体及其小分子聚合物料单体及其小分子聚合物料单体及其小分子聚合物。原料单体及其小分子聚合物原料

19、单体及其小分子聚合物可与酚类物质形成复合物可与酚类物质形成复合物，而，而蜡质能被醇液洗脱下来，蜡质能被醇液洗脱下来，蜡质能被醇液洗脱下来，蜡质能被醇液洗脱下来，与分离之物质混在一起则难以除去。除去原料单体及其小分与分离之物质混在一起则难以除去。除去原料单体及其小分与分离之物质混在一起则难以除去。除去原料单体及其小分与分离之物质混在一起则难以除去。除去原料单体及其小分子聚合物的方法子聚合物的方法子聚合物的方法子聚合物的方法是是是是用二甲基甲酰胺（用二甲基甲酰胺（DMF）或）或D DMFMF：醋：醋：醋：醋酸：水：乙醇（酸：水：乙醇（酸：水：乙醇（酸：水：乙醇（5 5：1010：3030：2020

20、）混合液洗脱。除去蜡质）混合液洗脱。除去蜡质）混合液洗脱。除去蜡质）混合液洗脱。除去蜡质的方法的方法的方法的方法是是是是用甲醇：二氯乙烷（用甲醇：二氯乙烷（用甲醇：二氯乙烷（用甲醇：二氯乙烷（1 1：1 1）混合液洗脱。）混合液洗脱。）混合液洗脱。）混合液洗脱。第五十六页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l装柱装柱装柱装柱 要求要求要求要求:固定相的上表面一定要固定相的上表面一定要固定相的上表面一定要固定相的上表面一定要 平整，并且固定相的高度要根平整，并且固定相的高度要根 据需要，短了可能分离效果不据需要，短了可能分离效果不据需要，短了可能分离效果不据需要，短了可能分离效

21、果不 好，长了也会出现扩散或拖尾好，长了也会出现扩散或拖尾好，长了也会出现扩散或拖尾好，长了也会出现扩散或拖尾 导致分离效果不好。导致分离效果不好。导致分离效果不好。导致分离效果不好。湿法装柱湿法装柱湿法装柱湿法装柱:是先把硅胶混悬于是先把硅胶混悬于 流动相溶剂中，然后加入到装流动相溶剂中，然后加入到装 有溶剂的柱子顶端，在保持一有溶剂的柱子顶端，在保持一有溶剂的柱子顶端，在保持一有溶剂的柱子顶端，在保持一 定流速的条件下固定相逐渐沉定流速的条件下固定相逐渐沉 积并达到需要的高度，并始终保持一定的液面高度，积并达到需要的高度，并始终保持一定的液面高度，积并达到需要的高度，并始终保持一定的液面高

22、度，积并达到需要的高度，并始终保持一定的液面高度，不可将柱子不可将柱子不可将柱子不可将柱子“走干走干”，最大的优点是柱子装的比较，最大的优点是柱子装的比较结实，没有气泡。结实，没有气泡。第五十七页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l装柱装柱装柱装柱 干法装柱：直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打干法装柱：直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打干法装柱：直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打干法装柱：直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面柱子两侧

23、（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，减压抽不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，减压抽不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，减压抽不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，减压抽气可以使得柱子装得结实，接着是用洗脱剂气可以使得柱子装得结实，接着是用洗脱剂气可以使得柱子装得结实，接着是用洗脱剂气可以使得柱子装得结实，接着是用洗脱剂“走柱子走柱子走柱子走柱子”，干法装柱较方便，技术要求低，但容易产生气，干法装柱较方便，技术要求低，但容易产生气，干法装柱较方便，技术要求低，但容易产生气，干法装柱较方便，技术要求低，但容易产生气泡，在上样前需要用大量溶剂淋洗

24、才能达到湿法装泡，在上样前需要用大量溶剂淋洗才能达到湿法装泡，在上样前需要用大量溶剂淋洗才能达到湿法装泡，在上样前需要用大量溶剂淋洗才能达到湿法装柱的效果。因而相对成本较高。柱的效果。因而相对成本较高。柱的效果。因而相对成本较高。柱的效果。因而相对成本较高。第五十八页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l上样上样 湿法上样：适合湿法的样品湿法上样：适合湿法的样品湿法上样：适合湿法的样品湿法上样：适合湿法的样品 是粘度不大均匀液体样品或是粘度不大均匀液体样品或是粘度不大均匀液体样品或是粘度不大均匀液体样品或 者在极性弱于洗脱剂的溶剂者在极性弱于洗脱剂的溶剂者在极性弱于洗脱剂的溶

25、剂者在极性弱于洗脱剂的溶剂 中溶解度好的固体样品，需保证上样过程中不会析出。中溶解度好的固体样品，需保证上样过程中不会析出。中溶解度好的固体样品，需保证上样过程中不会析出。中溶解度好的固体样品，需保证上样过程中不会析出。用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。样品沿柱子内壁于硅用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。样品沿柱子内壁于硅用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。样品沿柱子内壁于硅用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。样品沿柱子内壁于硅胶面上方胶面上方胶面上方胶面上方0.5cm0.5cm0.5cm0.5cm以内距离均匀地加样，加样的速度以柱子不以内距离均匀地加样，加样的速度以柱子不以内距离均匀地加样，加样

26、的速度以柱子不以内距离均匀地加样，加样的速度以柱子不出现气泡为限。待所有样品上完后，用尽可能少的溶剂洗出现气泡为限。待所有样品上完后，用尽可能少的溶剂洗出现气泡为限。待所有样品上完后，用尽可能少的溶剂洗出现气泡为限。待所有样品上完后，用尽可能少的溶剂洗涤样品瓶，待样品在固定相上恰好走干后依上样法将溶液涤样品瓶，待样品在固定相上恰好走干后依上样法将溶液涤样品瓶，待样品在固定相上恰好走干后依上样法将溶液涤样品瓶，待样品在固定相上恰好走干后依上样法将溶液加到固定相上。加到固定相上。加到固定相上。加到固定相上。第五十九页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l上样上样上样上样 干法上样

27、：干法就是把待分离的样品用少量低沸点溶剂干法上样：干法就是把待分离的样品用少量低沸点溶剂干法上样：干法就是把待分离的样品用少量低沸点溶剂干法上样：干法就是把待分离的样品用少量低沸点溶剂溶解后，再加入少量固定相，拌匀后再挥干溶剂。如此溶解后，再加入少量固定相，拌匀后再挥干溶剂。如此溶解后，再加入少量固定相，拌匀后再挥干溶剂。如此溶解后，再加入少量固定相，拌匀后再挥干溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层，注意保留足够的溶得到的粉末再小心加到柱子的顶层，注意保留足够的溶得到的粉末再小心加到柱子的顶层，注意保留足够的溶得到的粉末再小心加到柱子的顶层，注意保留足够的溶剂使加入的干粉恰好能被覆盖以防柱

28、子开裂。此时加入剂使加入的干粉恰好能被覆盖以防柱子开裂。此时加入剂使加入的干粉恰好能被覆盖以防柱子开裂。此时加入剂使加入的干粉恰好能被覆盖以防柱子开裂。此时加入的干粉层中可能会有大量的气泡，但由于是松的，可以的干粉层中可能会有大量的气泡，但由于是松的，可以的干粉层中可能会有大量的气泡，但由于是松的，可以的干粉层中可能会有大量的气泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做搅拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平用玻棒稍做搅拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平用玻棒稍做搅拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平用玻棒稍做搅拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平整。整。整。整。若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破

29、可考虑若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破可考虑若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破可考虑若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破可考虑在上样前先在柱子上加一层石英砂。过程中时刻保持在上样前先在柱子上加一层石英砂。过程中时刻保持在上样前先在柱子上加一层石英砂。过程中时刻保持在上样前先在柱子上加一层石英砂。过程中时刻保持柱子不要干出气泡或裂纹！柱子不要干出气泡或裂纹！柱子不要干出气泡或裂纹！柱子不要干出气泡或裂纹！第六十页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l洗脱洗脱洗脱洗脱 柱层析所用的流动相，习惯上称为柱层析所用的流动相，习惯上称为柱层析所用的流动相，习惯上称为柱层

30、析所用的流动相，习惯上称为 洗脱剂洗脱剂,可将目的组分自混合样品可将目的组分自混合样品 中逐次分离出来。中逐次分离出来。洗脱的过程中，洗脱剂自柱上端加洗脱的过程中，洗脱剂自柱上端加洗脱的过程中，洗脱剂自柱上端加洗脱的过程中，洗脱剂自柱上端加 入入,固定相上端始终在洗脱剂溶剂不固定相上端始终在洗脱剂溶剂不固定相上端始终在洗脱剂溶剂不固定相上端始终在洗脱剂溶剂不 能干，每能干，每能干，每能干，每30303030分钟分钟分钟分钟1 1小时内流出的洗小时内流出的洗小时内流出的洗小时内流出的洗 脱剂体积等于所用吸附剂的重量为脱剂体积等于所用吸附剂的重量为脱剂体积等于所用吸附剂的重量为脱剂体积等于所用吸附

31、剂的重量为 宜。洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。宜。洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。宜。洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。宜。洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。根据需要分段收集，然后用薄层色谱检测。根据需要分段收集，然后用薄层色谱检测。根据需要分段收集，然后用薄层色谱检测。根据需要分段收集，然后用薄层色谱检测。第六十一页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l洗脱剂洗脱剂 在柱色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和洗脱在柱色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和洗脱在柱色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和洗脱在柱色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和洗脱剂之间发生吸附剂之间发生吸附

32、剂之间发生吸附剂之间发生吸附-溶解分配，强极性洗脱剂对极性大溶解分配，强极性洗脱剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性洗脱剂对极性小的有机物溶解的多，弱极性或非极性洗脱剂对极性小的有机物溶解的多，随洗脱剂的流过不同极性的有机的有机物溶解的多，随洗脱剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。物以不同的次序形成分离带。当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。溶剂分级洗脱。溶剂分级洗脱。溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为洗脱

33、剂只洗脱了混合物中如一种溶剂作为洗脱剂只洗脱了混合物中如一种溶剂作为洗脱剂只洗脱了混合物中如一种溶剂作为洗脱剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能洗脱，需换一种极性更大的一种化合物，对其它组分不能洗脱，需换一种极性更大的一种化合物，对其它组分不能洗脱，需换一种极性更大的一种化合物，对其它组分不能洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的洗脱剂可以将各溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的洗脱剂可以将各溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的洗脱剂可以将各溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的洗脱剂可以将各组分分离。组分分离。组分分离。组分分离。第六十二页，讲稿共九十一页哦色谱分

34、离法色谱分离法柱色谱柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱l l利用各种装置施加压力进行的液相色谱，压力可高达利用各种装置施加压力进行的液相色谱，压力可高达利用各种装置施加压力进行的液相色谱，压力可高达利用各种装置施加压力进行的液相色谱，压力可高达100bar100bar100bar100bar。l l可允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂，从而获可允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂，从而获可允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂，从而获可允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂，从而获得更高的分辨率。得更高的分辨率。得更高的分辨率。得更高的分辨率。l l可加快洗脱剂的流速缩短分离

35、时间。在对敏感化合物进可加快洗脱剂的流速缩短分离时间。在对敏感化合物进可加快洗脱剂的流速缩短分离时间。在对敏感化合物进可加快洗脱剂的流速缩短分离时间。在对敏感化合物进行长时间的常压色谱分离时，化合物的结构可能会发生行长时间的常压色谱分离时，化合物的结构可能会发生行长时间的常压色谱分离时，化合物的结构可能会发生行长时间的常压色谱分离时，化合物的结构可能会发生转变，而缩短分离时间的最大优点在于可以避免这种转转变，而缩短分离时间的最大优点在于可以避免这种转转变，而缩短分离时间的最大优点在于可以避免这种转转变，而缩短分离时间的最大优点在于可以避免这种转变的发生。变的发生。变的发生。变的发生。第六十三页

36、，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱l l根据分离中所用压力的大小可把制备型柱色谱区分为快根据分离中所用压力的大小可把制备型柱色谱区分为快根据分离中所用压力的大小可把制备型柱色谱区分为快根据分离中所用压力的大小可把制备型柱色谱区分为快速色谱（约速色谱（约速色谱（约速色谱（约2bar2bar2bar2bar）、低压液相色谱（）、低压液相色谱（）、低压液相色谱（）、低压液相色谱（barbar）。中压液）。中压液）。中压液）。中压液相色谱（相色谱（相色谱（相色谱（520 bar520 bar520 bar520 bar）及高压液相色谱（）及高压液

37、相色谱（）及高压液相色谱（）及高压液相色谱（20 bar)20 bar)低压、中压与高压液相色谱的压力范围之间会存低压、中压与高压液相色谱的压力范围之间会存在一定交叠。在一定交叠。l l分离中所用色谱柱及固定相颗粒的大小需根据分离分离中所用色谱柱及固定相颗粒的大小需根据分离的难易程度而定。一般对于难分离的样品应采用小的难易程度而定。一般对于难分离的样品应采用小颗粒的固定相及稍长的色谱柱分离所需压力也会加颗粒的固定相及稍长的色谱柱分离所需压力也会加大。大。第六十四页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱快速色谱快速色谱快速色谱快速色谱l lSt

38、illStill等于等于等于等于1978197819781978年介绍了快速色谱技术。年介绍了快速色谱技术。l l色谱分离时长时间的洗脱可造成敏感化合物的分解并色谱分离时长时间的洗脱可造成敏感化合物的分解并使色带脱尾，快速色谱大大缩短分离所需时间从而避使色带脱尾，快速色谱大大缩短分离所需时间从而避免产生上述问题。免产生上述问题。l l快速色谱中使用最广泛的固定相为硅胶。一些粒度范快速色谱中使用最广泛的固定相为硅胶。一些粒度范围较窄的球形硅胶是专门为快速色谱而设计的。此外围较窄的球形硅胶是专门为快速色谱而设计的。此外也可采用具有一定粒度范围的非球形硅胶。也可采用具有一定粒度范围的非球形硅胶。l

39、l硅胶快速色谱可对天然产物进行最终纯化，但更常见的硅胶快速色谱可对天然产物进行最终纯化，但更常见的硅胶快速色谱可对天然产物进行最终纯化，但更常见的硅胶快速色谱可对天然产物进行最终纯化，但更常见的是用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化，然后再利是用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化，然后再利是用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化，然后再利是用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化，然后再利用其他具有高分辨率的色谱技术进行纯化。用其他具有高分辨率的色谱技术进行纯化。用其他具有高分辨率的色谱技术进行纯化。用其他具有高分辨率的色谱技术进行纯化。第六十五页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱加

40、压柱色谱加压柱色谱快速色谱快速色谱快速色谱快速色谱l l快速色谱分离装置包括一装有活快速色谱分离装置包括一装有活快速色谱分离装置包括一装有活快速色谱分离装置包括一装有活塞，长度适合的玻璃柱。可用干塞，长度适合的玻璃柱。可用干塞，长度适合的玻璃柱。可用干塞，长度适合的玻璃柱。可用干法或湿法将固定相加入其中。干法或湿法将固定相加入其中。干法或湿法将固定相加入其中。干法或湿法将固定相加入其中。干法装柱效果更好，但法装柱效果更好，但法装柱效果更好，但法装柱效果更好，但需用大量溶需用大量溶需用大量溶需用大量溶剂使固定相完全润湿。在固定相剂使固定相完全润湿。在固定相剂使固定相完全润湿。在固定相剂使固定相完

41、全润湿。在固定相的顶部最好加一层沙子。的顶部最好加一层沙子。的顶部最好加一层沙子。的顶部最好加一层沙子。第六十六页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l固定相的上端应留有足够的空间固定相的上端应留有足够的空间固定相的上端应留有足够的空间固定相的上端应留有足够的空间以便反复加入洗脱剂，也可在柱以便反复加入洗脱剂，也可在柱以便反复加入洗脱剂，也可在柱以便反复加入洗脱剂，也可在柱顶部加一球形磨口储液槽。顶部加一球形磨口储液槽。顶部加一球形磨口储液槽。顶部加一球形磨口储液槽。l l加样后可施加高于大气压加样后可施加高于大气压加样后可施加高于大气压加样后可施加高于大气压lbarlbar

42、的的的的压力以加速样品的洗脱。在气体入压力以加速样品的洗脱。在气体入压力以加速样品的洗脱。在气体入压力以加速样品的洗脱。在气体入口处可利用一针式阀门控制压缩气口处可利用一针式阀门控制压缩气口处可利用一针式阀门控制压缩气口处可利用一针式阀门控制压缩气体的流速。体的流速。体的流速。体的流速。l l利用不同尺寸的色谱柱对利用不同尺寸的色谱柱对利用不同尺寸的色谱柱对利用不同尺寸的色谱柱对0.0110.0g0.0110.0g样品所进行的分离通常可样品所进行的分离通常可样品所进行的分离通常可样品所进行的分离通常可在在在在15min内完成。内完成。内完成。内完成。加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱快速

43、色谱快速色谱快速色谱快速色谱第六十七页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l使用最广泛的低压液相色谱系统是使用最广泛的低压液相色谱系统是使用最广泛的低压液相色谱系统是使用最广泛的低压液相色谱系统是E MerckE MerckE MerckE Merck公司生产的公司生产的公司生产的公司生产的LobarLobarLobarLobar柱系列产品，一般与其他分离方法结合起来使用，将柱系列产品，一般与其他分离方法结合起来使用，将柱系列产品，一般与其他分离方法结合起来使用，将柱系列产品，一般与其他分离方法结合起来使用，将其用作中间或最后的纯化手段。其用作中间或最后的纯化手段。其用作中间

44、或最后的纯化手段。其用作中间或最后的纯化手段。l l预制色谱柱是由玻璃制成，色谱柱中的固定相被柱两端的预制色谱柱是由玻璃制成，色谱柱中的固定相被柱两端的预制色谱柱是由玻璃制成，色谱柱中的固定相被柱两端的预制色谱柱是由玻璃制成，色谱柱中的固定相被柱两端的熔融玻璃封闭。色谱柱两端连有聚四氯乙烯环的金属管可熔融玻璃封闭。色谱柱两端连有聚四氯乙烯环的金属管可熔融玻璃封闭。色谱柱两端连有聚四氯乙烯环的金属管可熔融玻璃封闭。色谱柱两端连有聚四氯乙烯环的金属管可与输液泵相连，金属管及聚四氯乙烯环被柱端的旋钮固定与输液泵相连，金属管及聚四氯乙烯环被柱端的旋钮固定与输液泵相连，金属管及聚四氯乙烯环被柱端的旋钮固

45、定与输液泵相连，金属管及聚四氯乙烯环被柱端的旋钮固定于柱体。于柱体。于柱体。于柱体。加压柱色谱加压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱 第六十八页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱l l因分离过程中需使用输液泵一般采用组成恒定的洗脱因分离过程中需使用输液泵一般采用组成恒定的洗脱因分离过程中需使用输液泵一般采用组成恒定的洗脱因分离过程中需使用输液泵一般采用组成恒定的洗脱剂。剂。剂。剂。l l利用反相利用反相利用反相利用反相Lobar RP18Lobar RP18Lobar RP18Lobar RP18色谱系统从山甘草中分离得到三色谱系统从山甘草中分离得到三色谱系统从山甘

46、草中分离得到三色谱系统从山甘草中分离得到三萜皂苷类成分，所用溶剂系统为乙醇萜皂苷类成分，所用溶剂系统为乙醇萜皂苷类成分，所用溶剂系统为乙醇萜皂苷类成分，所用溶剂系统为乙醇-水（水（水（水（1:11:11:11:1）和乙）和乙）和乙）和乙腈腈腈腈-水（水（水（水（1:11:1）加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱 第六十九页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱低压柱色谱 l lLobarLobar柱规格分为柱规格分为柱规格分为柱规格分为 A A、B B、C C三种型号预

47、制色谱往的填料有硅胶、三种型号预制色谱往的填料有硅胶、三种型号预制色谱往的填料有硅胶、三种型号预制色谱往的填料有硅胶、RPRP1818、RP-8RP-8、NH2-NH2-、CN-CN-及及及及dioldiol键合相硅胶等。键合相硅胶等。键合相硅胶等。键合相硅胶等。第七十页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱加压柱色谱中压柱色谱中压柱色谱中压柱色谱中压柱色谱 l lLobarLobarLobarLobar色谱分离系统具有使用方便，分辨率较高的优色谱分离系统具有使用方便，分辨率较高的优点。然而，用这些色谱柱难以分离点。然而，用这些色谱柱难以分离5g5g5

48、g5g以上的样品。以上的样品。l l中压液相色谱可采用更长、具有更大内径的色谱柱，可以中压液相色谱可采用更长、具有更大内径的色谱柱，可以中压液相色谱可采用更长、具有更大内径的色谱柱，可以中压液相色谱可采用更长、具有更大内径的色谱柱，可以一次性分离更多的样品。一次性分离更多的样品。一次性分离更多的样品。一次性分离更多的样品。l l中压液相色谱比低压液波相色谱使用的填料颗粒度更中压液相色谱比低压液波相色谱使用的填料颗粒度更中压液相色谱比低压液波相色谱使用的填料颗粒度更中压液相色谱比低压液波相色谱使用的填料颗粒度更小，分辨率更高，需使用更大的压力来维持适当的流小，分辨率更高，需使用更大的压力来维持适

49、当的流小，分辨率更高，需使用更大的压力来维持适当的流小，分辨率更高，需使用更大的压力来维持适当的流速所需速所需速所需速所需l l压力可由压缩空气或往复泵提供。先利用分析型压力可由压缩空气或往复泵提供。先利用分析型压力可由压缩空气或往复泵提供。先利用分析型压力可由压缩空气或往复泵提供。先利用分析型HPLCHPLCHPLCHPLC可可可可以十分有效地选择适当的溶剂系统。以十分有效地选择适当的溶剂系统。以十分有效地选择适当的溶剂系统。以十分有效地选择适当的溶剂系统。第七十一页，讲稿共九十一页哦色谱分离法色谱分离法柱色谱柱色谱加压柱色谱加压柱色谱中压柱色谱中压柱色谱中压柱色谱中压柱色谱 l l中压色谱

50、柱可用于分离中压色谱柱可用于分离中压色谱柱可用于分离中压色谱柱可用于分离100mg至至至至100g100g的样品。的样品。的样品。的样品。l l活塞泵及可替换泵头可在最大压力为活塞泵及可替换泵头可在最大压力为活塞泵及可替换泵头可在最大压力为活塞泵及可替换泵头可在最大压力为 40bar40bar时，使流时，使流时，使流时，使流速在速在速在速在3160mL3160mLminmin之间调节。之间调节。l l该系统接有溶该系统接有溶剂梯度形成装置剂梯度形成装置剂梯度形成装置剂梯度形成装置并可用各种紫外并可用各种紫外并可用各种紫外并可用各种紫外检测仪检测。检测仪检测。检测仪检测。检测仪检测。l l柱体大