细胞免疫荧光技术讲稿.ppt

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1、关于细胞免疫荧光技关于细胞免疫荧光技术术第一页，讲稿共十七页哦实验目的实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理掌握免疫荧光技术的基本原理掌握免疫荧光技术的基本原理掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法熟悉细胞免疫荧光技术的方法熟悉细胞免疫荧光技术的方法熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何获了解在免疫细胞化学技术中如何获了解在免疫细胞化学技术中如何获了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果得好的实验结果得好的实验结果得好的实验结果第二页，讲稿共十七页哦实验原理实验原理n原位检测原位检测n抗原抗体特异反应抗原抗体特异反应n间接法间接法 间接荧光抗体染色法示意图抗原抗原

2、抗体抗体荧光素标记荧光素标记的抗抗体的抗抗体激发光激发光显示荧光显示荧光Hela细胞细胞Vinculin第三页，讲稿共十七页哦实验用品实验用品试剂：试剂：固定液：固定液：4%PFA细胞通透：细胞通透：0.2%TritonX封闭试剂：封闭试剂：10%正常山羊血清正常山羊血清一抗：小鼠源抗一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体单克隆抗体二抗二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠标记的山羊抗小鼠IgGDAPI（4,6-二脒基二脒基-2-苯基吲哚）苯基吲哚）PBS洗涤缓冲液：洗涤缓冲液：PH7.4材料：材料：Hela细胞细胞细胞培养皿细胞培养皿仪器：仪器：荧光显微镜荧光显微镜第四页，讲稿

3、共十七页哦实验步骤实验步骤 一，细胞制备和细胞固定一，细胞制备和细胞固定将细胞铺在将细胞铺在24孔板中孔板中将细胞培养将细胞培养至所需密度至所需密度加入加入4%PFA固定固定10min染色染色或保存或保存PBS洗涤洗涤PBS洗涤洗涤第五页，讲稿共十七页哦实验步骤实验步骤 二，细胞免疫荧光二，细胞免疫荧光ICC染色染色0.2%TritonX处理处理5min 封闭封闭室温室温30min4过夜过夜371-2小时小时375-10min荧光显微镜荧光显微镜观察观察加入一抗加入一抗加入二抗加入二抗加入加入DAPI复染复染PBS洗涤洗涤PBS洗涤洗涤PBS洗涤洗涤第六页，讲稿共十七页哦实验结果实验结果三，观

4、察三，观察humanHeLacells第七页，讲稿共十七页哦实验中应注意的问题实验中应注意的问题n 细胞不要铺的过密细胞不要铺的过密:60-70%n 防止细胞污染防止细胞污染n 固定时间不要太长固定时间不要太长,一般一般10-30minnTrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理n 选择合适的封闭液选择合适的封闭液n 二抗孵育后二抗孵育后,一定要洗干净一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗必要时用恒温摇床摇洗第八页，讲稿共十七页哦 1.1.免疫荧光技术免疫荧光技术 2.2.免疫酶技术免疫酶技术 3.3.免疫亲和技术免疫亲和技术 4.4.胶体金技术胶体金技术 标

5、记物标记物 使抗体或抗原使抗体或抗原 抗体复合物在抗体复合物在 各种显微镜下各种显微镜下 可见的物质可见的物质免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术第九页，讲稿共十七页哦免疫细胞化学技术注意事项免疫细胞化学技术注意事项n 选择合适的方法选择合适的方法n 材料要留好材料要留好n 选择抗体选择抗体n 选择标记酶选择标记酶n 封闭液的选择封闭液的选择n 设定对照实验设定对照实验第十页，讲稿共十七页哦思考题思考题检测检测Hela细胞中蛋白细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法，定位情况，思考应选择什么方法，用什么仪器观察？用什么仪器观察？A第十一页，讲稿共十七页哦疑难解答疑难解答一，缺乏染色一，缺乏染色一

6、，缺乏染色一，缺乏染色 可能的原因可能的原因n 无抗原无抗原n 抗体失效抗体失效n 固定不充分固定不充分n 过度固定过度固定n 抗原修复无效抗原修复无效n 不兼容的二抗和一抗不兼容的二抗和一抗n 漏用试剂或未按正确的顺序漏用试剂或未按正确的顺序 加入试剂加入试剂相应的措施相应的措施n 用原位杂交方法检测蛋白表达用原位杂交方法检测蛋白表达n 按说明书储存抗体按说明书储存抗体;分装抗体分装抗体;避免反复冻融避免反复冻融n 增加固定时间或改用不同的固定剂增加固定时间或改用不同的固定剂n 减少固定时间减少固定时间;抗原修复抗原修复n 增加修复时间或更换修复液增加修复时间或更换修复液n 使用可以与一抗结

7、合的二抗使用可以与一抗结合的二抗n 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序第十二页，讲稿共十七页哦二，高背景二，高背景第十三页，讲稿共十七页哦可能的原因可能的原因n 一抗或二抗的浓度过高一抗或二抗的浓度过高n 一抗和一抗和/或二抗与组织的或二抗与组织的 非特异性结合非特异性结合n 组织过于干燥组织过于干燥n 试剂粘附在旧的试剂粘附在旧的 或未制备好的玻片上或未制备好的玻片上相应的措施相应的措施n预实验摸索最佳浓度预实验摸索最佳浓度n一抗孵育前封闭一抗孵育前封闭 (最好是二抗来源的血清最好是二抗来源的血清)n在染色过程中避免组织干燥在染色过程中避免组织干燥n用新

8、鲜制备或购买的玻片进行实验用新鲜制备或购买的玻片进行实验第十四页，讲稿共十七页哦三，细胞三，细胞/组织的形态被破坏组织的形态被破坏第十五页，讲稿共十七页哦可能的原因可能的原因n 抗原修复方法过于剧烈抗原修复方法过于剧烈n 组织切片从玻片上脱落组织切片从玻片上脱落n 组织切片撕裂或褶皱组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡切片下有气泡n 组织形态难以分辨组织形态难以分辨n 组织固定不充分组织固定不充分,自发裂解自发裂解相应的措施相应的措施n 预实验摸索合适的修复条件预实验摸索合适的修复条件n 增加固定时间增加固定时间;烤片烤片;使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片n 使用锋利的刀片使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域分析时避开受损的区域n 切片薄一些切片薄一些;冰冻过程形成冰晶冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水蔗糖脱水n 及时固定及时固定;增加固定时间增加固定时间;提高固定剂提高固定剂/组织的比例组织的比例;将组织切得较小将组织切得较小第十六页，讲稿共十七页哦感谢大家观看第十七页，讲稿共十七页哦