细胞因子及抗体检测技术讲稿.ppt

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1、关于细胞因子及抗体检测技术第一页，讲稿共四十四页哦背景知识背景知识l l研究细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机研究细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和指导临制、免疫相关疾病的发生、发展规律和指导临床治疗均具有重要意义床治疗均具有重要意义l l抗体具有高特异性、高亲和力等特点，目前已抗体具有高特异性、高亲和力等特点，目前已广泛应用于免疫学、微生物学、肿瘤学、遗传广泛应用于免疫学、微生物学、肿瘤学、遗传学以及分子生物学等各个领域学以及分子生物学等各个领域第二页，讲稿共四十四页哦 细胞因子的检测方法：细胞因子的检测方法：1)1)生物学方法生物学方法 依赖性细胞株依

2、赖性细胞株 ：生物分析法：生物分析法 功能检测功能检测 ：生物分析法：生物分析法 2)2)分子生物学方法分子生物学方法 分子杂交技术分子杂交技术 ：mRNAmRNA表达水平的测定表达水平的测定 多聚酶链反应技术（多聚酶链反应技术（PCRPCR）：）：mRNAmRNA的测定的测定 3 3）免疫学方法）免疫学方法 免疫测定免疫测定 ：免疫酶技术：免疫酶技术 功能测定与抗体抑制功能测定与抗体抑制 第三页，讲稿共四十四页哦抗体检测技术抗体检测技术 免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术 免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术 间接血凝试验间接血凝试验间接血凝试验间接血凝试验 放射免疫测定放

3、射免疫测定放射免疫测定放射免疫测定 蛋白印迹蛋白印迹 免疫共沉淀免疫共沉淀 亲和力测定亲和力测定亲和力测定亲和力测定 第四页，讲稿共四十四页哦 酶联免疫吸附测定实验酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)Enzyme linked immunosorbent assay 第五页，讲稿共四十四页哦 基于NP30抗独特型抗体可替代虫源性抗原率先应用生物技术制备抗原代替传统虫源抗原血吸虫抗体属短程抗体，治疗后阴转较快，具有疗效考核价值 该试剂盒的诊断效能多项指标均已达到或超过经典抗体检测法，较以前病原学检查和免疫学检测方法，更为简便快速优点：仅用一滴血，20分钟即可判读结果，不需其他仪器设备，便于在基层

4、、现场使用本试剂盒已在血吸虫流行区已应用近120万人次 第六页，讲稿共四十四页哦管晓虹（管晓虹（1946-20121946-2012），女，汉族，江苏丹阳），女，汉族，江苏丹阳人，博士，教授，博士生导师。农工民主党员。人，博士，教授，博士生导师。农工民主党员。农工民主党第十二、十三届中央常委，第九、农工民主党第十二、十三届中央常委，第九、十届全国人大代表，江苏省妇联副主席。十届全国人大代表，江苏省妇联副主席。l19701970年毕业于中国协和医科大学；年毕业于中国协和医科大学；19811981和和19851985年先后在原南京医学院年先后在原南京医学院获医学硕士和医学博士学位；获医学硕士和医学

5、博士学位；19881988年在美国布朗大学作博士后研究。年在美国布朗大学作博士后研究。l曾任寄生虫学教研室副主任、江苏省医学分子生物学重点实验室曾任寄生虫学教研室副主任、江苏省医学分子生物学重点实验室主任、卫生部抗体技术重点实验室主任。主任、卫生部抗体技术重点实验室主任。l承担国家承担国家“七五七五”、“八五八五”、“九五九五”科技攻关项目各科技攻关项目各1 1项（血吸虫项（血吸虫病免疫诊断）；国家病免疫诊断）；国家“863”863”计划项目计划项目1 1项和国家自然科学基金项目项和国家自然科学基金项目6 6项；项；发表论文发表论文100100余篇；主编或参编卫生部规划教材余篇；主编或参编卫生

6、部规划教材6 6部；获部省级科技进步部；获部省级科技进步二等奖二等奖2 2项、三等奖项、三等奖2 2项；获国家发明专利授权项；获国家发明专利授权6 6项。获项。获“全国优秀教师全国优秀教师”、“国家级有突出贡献的中青年专家国家级有突出贡献的中青年专家”等荣誉称号。享受国务院政府特殊等荣誉称号。享受国务院政府特殊津贴。津贴。第七页，讲稿共四十四页哦实验原理实验原理l是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫技术免疫技术l此项技术自此项技术自7070年代初问世以来年代初问世以来,发展十分迅速发展十分迅速l优点：微量、特异、高效、经济、方便、安全等优

7、点：微量、特异、高效、经济、方便、安全等l广泛用于生物学和医学科学的许多领域广泛用于生物学和医学科学的许多领域第八页，讲稿共四十四页哦实验原理实验原理 ELISAELISAELISAELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体度敏感性检测抗原或抗体度敏感性检测抗原或抗体度敏感性检测抗原或抗体1.1.1.1.使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性疫活性2.2.2.2.使抗原或抗体与某种酶连接

8、成酶标抗原或抗体，这种酶使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性3.3.3.3.按一定步骤进行抗原抗体反应按一定步骤进行抗原抗体反应按一定步骤进行抗原抗体反应按一定步骤进行抗原抗体反应4.4.4.4.加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析加底物显色，根据颜色反应

9、的深浅进行定性或定量分析加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析第九页，讲稿共四十四页哦方法类型方法类型 ELISAELISA既可测抗原又可测抗体，根据试剂既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标本性状以及检测的具体条件，可设来源、标本性状以及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法：计出不同类型的检测方法：1.1.直接法直接法 2.2.间接法间接法 3.3.双抗体夹心法双抗体夹心法 4.4.双夹心间接法双夹心间接法第十页，讲稿共四十四页哦第十一页，讲稿共四十四页哦第十二页，讲稿共四十四页哦一、试剂及仪器准备一、试剂及仪器准备（一）（一）免疫吸附剂免疫吸附剂1.固相载体固相载体 要求：

10、要求：吸附力强吸附力强 能保持能保持Ag或或Ab活性活性 不参与化学反应不参与化学反应 第十三页，讲稿共四十四页哦 载体性能比较载体性能比较 要求要求：载体材料载体材料+、-结果差别大结果差别大结果差别大结果差别大 检测方法检测方法：10ug/L IgG10ug/L IgG包被包被包被包被,加酶标抗加酶标抗IgGIgG，显色后，显色后，显色后，显色后，测测测测2020孔的孔的孔的孔的OD，要求，要求，要求，要求CV10%CV10%常用载体：常用载体：材料材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等等 形状形状：小试管、小珠、微量反应板小试管、小珠、微量反应板第十四页，讲稿共四十四

11、页哦2.Ag或或Ab：纯度高、效价高、结合力高纯度高、效价高、结合力高3.免疫吸附剂免疫吸附剂(固相固相Ag或或Ab)：l 包被包被：将将Ag或或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被固相化的过程包被缓冲液、包被方法方法l 封闭封闭：包被后在用包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰以消除非特异吸附的干扰第十五页，讲稿共四十四页哦 酶结合物：酶结合物：1.要求：要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定来源

12、丰富、标记后稳定来源丰富、标记后稳定来源丰富、标记后稳定2.常用酶常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶等 3.底物：底物：lHRPHRP可溶性底物及呈色：可溶性底物及呈色：邻苯二胺邻苯二胺(OPD)(OPD)：橙红：橙红(492nm)(492nm)；四甲基联苯胺；四甲基联苯胺(TMB)(TMB)：蓝色：蓝色(450nm)(450nm)5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸(5-ASA)(5-ASA)：棕色：棕色(550nm)(550nm)鲁咪诺鲁咪诺+H2O2+H2O2：荧光：荧光lHRPHRP不可溶性底物及呈色：不可溶性底物及呈色：DABDAB：棕黄色：棕黄色 -萘酚：红色萘酚：红色 3-3

13、-氧基氧基-9-9-乙基卡唑：红色乙基卡唑：红色 4-4-氯氯-1-1-萘酚：灰蓝萘酚：灰蓝色色lAPAP可溶性底物及呈色：可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯(P-NPP)(P-NPP)：黄色：黄色(405nm)4-(405nm)4-甲基伞基磷酸酯甲基伞基磷酸酯(4-MuP)(4-MuP)：荧光：荧光lAPAP不可溶性底物及呈色：不可溶性底物及呈色：NBTNBT和和BCIPBCIP混合液：紫色混合液：紫色 坚固红和萘酚坚固红和萘酚ASMXASMX混合液：红色混合液：红色l -半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：4-4-甲基伞基甲基伞基-半乳糖苷：荧光半乳糖苷：荧光第十六页，讲稿共四十四页哦4.

14、酶结合物的制备：酶结合物的制备：l 戊二醛交联法戊二醛交联法l 过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法第十七页，讲稿共四十四页哦（三）设备：（三）设备：（三）设备：（三）设备：酶标比色仪酶标比色仪简称简称酶标仪酶标仪 l l指测读指测读ELISAELISAELISAELISA光度计；针对固相载体形式的不同，各有特光度计；针对固相载体形式的不同，各有特光度计；针对固相载体形式的不同，各有特光度计；针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计制的适用于板、珠和小试管的设计制的适用于板、珠和小试管的设计制的适用于板、珠和小试管的设计l l 性能指标性能指标性能指标性能指标：测读速度、读数的准确

15、性、重复性、精确：测读速度、读数的准确性、重复性、精确：测读速度、读数的准确性、重复性、精确：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性度和可测范围、线性度和可测范围、线性度和可测范围、线性l l 优良的酶标仪的读数一般可精确优良的酶标仪的读数一般可精确优良的酶标仪的读数一般可精确优良的酶标仪的读数一般可精确0.0010.0010.0010.001，准确性为，准确性为1%1%1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%0.5%0.5%l l操作操作：室温宜在：室温宜在：室温宜在：室温宜在15-3015-3015-3015-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器，

16、使用前先预热仪器15-15-30min30min，测读结果更稳定。测读，测读结果更稳定。测读，测读结果更稳定。测读，测读结果更稳定。测读A A A A值时，要选用产物的值时，要选用产物的值时，要选用产物的值时，要选用产物的敏感吸收峰，如敏感吸收峰，如敏感吸收峰，如敏感吸收峰，如OPDOPDOPDOPD用用492nm492nm492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长。有的酶标仪可用双波长。有的酶标仪可用双波长。有的酶标仪可用双波长式测读波长式测读波长式测读波长式测读第十八页，讲稿共四十四页哦第十九页，讲稿共四十四页哦二、操作步骤二、操作步骤（间接（间接ELISA法）法）1.样本的收集样本的

17、收集2.包被抗原包被抗原3.封闭封闭4.加稀释的待检样品加稀释的待检样品5.加酶标抗抗体加酶标抗抗体6.加底物显色加底物显色7.终止反应终止反应第二十页，讲稿共四十四页哦（一）样品的收集和保存：（一）样品的收集和保存：1.溶血标本可增加非特异性显色溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用作用 于于HRP的辅基的辅基)；2.细菌污染标本因菌体内源性酶而假细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏破坏Ag或或Ab)或假或假“+”(非特异蛋白非特异蛋白)；3.反复冻融可使抗体效价下降而假反复冻融可使抗体效价下降而假“-”；4.陈旧标本可使陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本聚集，引起间接法本 底增加；底

18、增加；5.标本中含标本中含NaN3，可出现假，可出现假“-”。第二十一页，讲稿共四十四页哦（二）包被（二）包被l 包被包被(coating)(coating)：将抗原或抗体固定在固相载体的：将抗原或抗体固定在固相载体的过程过程l 原理：原理：物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用；这种物理吸附是非特异性的用；这种物理吸附是非特异性的l 影响因素影响因素：受蛋白质分子量、等电点、浓度等：受蛋白质分子量、等电点、浓度等 大分子蛋白质大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的较小分子

19、蛋白质通常含有更多的疏水基团疏水基团，故更易吸附到固相载体表面，故更易吸附到固相载体表面第二十二页，讲稿共四十四页哦包被条件l pH9.6 pH9.6 碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液l pH7.2 pH7.2 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液l pH7-8 Tris-HClpH7-8 Tris-HCl缓冲液。缓冲液。l 方法方法：加入包被液后，在：加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜或冰箱中放置过夜或3737中保温中保温2 2小时。小时。l 浓度浓度：随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材：随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。料需通过实验与酶结合物的浓度

20、协调选定。一般蛋白质一般蛋白质的包被浓度为的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml第二十三页，讲稿共四十四页哦 最适工作浓度的选择最适工作浓度的选择 可用棋盘滴定法在夹心可用棋盘滴定法在夹心ELISAELISAELISAELISA法中选择包被抗体法中选择包被抗体和酶标抗体工作浓度，即利用棋盘滴定，将包被抗和酶标抗体工作浓度，即利用棋盘滴定，将包被抗体和酶标抗体稀释成一系列浓度，反应后显色。阳体和酶标抗体稀释成一系列浓度，反应后显色。阳性值在性值在0.80.80.80.8左右，阴性值小于左右，阴性值小于左右，阴性值小于左右，阴性值小于0.10.1为最适，可据此选择

21、包为最适，可据此选择包为最适，可据此选择包为最适，可据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度被抗体和酶标抗体的工作浓度被抗体和酶标抗体的工作浓度被抗体和酶标抗体的工作浓度第二十四页，讲稿共四十四页哦 方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度滴定法选择包被抗原的工作浓度滴定法选择包被抗原的工作浓度滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释用包被液将抗原作一系列稀释用包被液将抗原作一系列稀释用包被液将抗原作一系列稀释(1:50l:800)l:800)后，按行进后，按行进后，按行进后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液行包被、洗涤。按列分别加入用稀释

22、液行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:1001:100稀释的强稀释的强稀释的强稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照作空白对照作空白对照作空白对照)，保，保，保，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取加酸终止反应后读取加酸终止反应后读取加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清值。选择强阳性参考血清A值；

23、值；为为0 08 8左右，阴性参考血清左右，阴性参考血清左右，阴性参考血清左右，阴性参考血清A值值值值01 1的包被抗原稀释的包被抗原稀释的包被抗原稀释的包被抗原稀释度为工作浓度度为工作浓度度为工作浓度度为工作浓度第二十五页，讲稿共四十四页哦（三）封闭l封闭封闭(blocking)(blocking)：是继包被之后用高浓度的无关是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥白质充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物后的步骤中干扰物质的再吸附。质的再吸附。l常用封闭剂常用封闭

24、剂：0.05%-0.5%的的BSA;10%的小牛血的小牛血清或清或1%明胶明胶;脱脂奶粉脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用比较价廉，可以高浓度使用（5%）。）。第二十六页，讲稿共四十四页哦（四）加样（抗原或抗体）抗原或抗体）l纯化抗原纯化抗原/抗体抗体：天然但干扰多天然但干扰多l合成抗原合成抗原/抗体抗体：多肽分子较小，常有空间位阻多肽分子较小，常有空间位阻l基因抗原基因抗原：与片段的选择和制备水平有关与片段的选择和制备水平有关第二十七页，讲稿共四十四页哦对照设定l l阳性对照品阳性对照品(positive control)l l阴性对照品阴性对照品(negative control)目的目的

25、:是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。要求：要求：l l阳性对照品阳性对照品：基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应

26、与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量可以估计标本物质的量可以估计标本物质的量可以估计标本物质的量l l阴性对照品阴性对照品：须先行检测确定不含待测物质须先行检测确定不含待测物质须先行检测确定不含待测物质须先行检测确定不含待测物质第二十八页，讲稿共四十四页哦（五）加酶标抗体 酶标记的抗体（原）：酶标记的抗体（原）：ELISA中关键的试剂中关键的试剂要求：要求：1.纯度高，催化反应的转化率高，专一性

27、强，性质稳定，来源纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶2.酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等廉，有色产物易于测定等3.在在ELISA中，中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲半乳糖苷酶和脲酶等酶等第二十九页，讲稿共四十四页哦（六）显色l显色：显色：酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。l影响因素：影响因素：温度、时间温度、时间

28、在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。lTMB：受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退

29、至无色。第三十页，讲稿共四十四页哦（七）结果判定 l操作方法：操作方法：拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算

30、。l 结果判定：结果判定：光密度（光密度（oplical densityoplical density，ODOD），现按规定），现按规定用吸光度（用吸光度（absorbenceabsorbence，A A），两者含义相同。通常的表示方），两者含义相同。通常的表示方法是将吸收波长写于法是将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为AA492nm492nm 或或ODOD492nm492nm。第三十一页，讲稿共四十四页哦1.1.定性测定定性测定 定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回

31、答，分别用的回答，分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义阳性、弱阳性更具定量意义 在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法争法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性

32、孔中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔第三十二页，讲稿共四十四页哦2.2.定量测定定量测定 ELSIAELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法测定大分子量物质的夹心法ELISAELISA，标准曲线的范围一般较，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈宽，曲线的值逐点连接，

33、所得曲线一般呈S S形，其头、尾部曲线形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。第三十三页，讲稿共四十四页哦第三十四页，讲稿共四十四页哦三、基本操作注意事项（一）加样（一）加样:l一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。l方法：方法：加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。第三十五页，讲稿共四十四页哦（二）孵育孵育 ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用的结合只在固相表面上发生。温育常采用的温

34、度有温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）（冰箱温度）等。等。3737是实验室中常用的孵育温度，也是实验室中常用的孵育温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。是大多数抗原抗体结合的合适温度。第三十六页，讲稿共四十四页哦（三）洗涤（三）洗涤 洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。定着实验的成败。l洗涤目的：洗涤目的：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。

35、聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。l 可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。第三十七页，讲稿共四十四页哦第三十八页，讲稿共四十四页哦第三十九页，讲稿共四十四页哦四、实验中常出现的问题1.ELISA1.ELISA1.ELISA1.ELISA出现出现出现出现“一片黄一片黄一片黄一片黄”的原因：的原因：的原因：的原因：l l 酶结合物浓度过高酶结合物浓度过高酶结合物浓度过高酶结合物浓度过

36、高l l 底物不新鲜底物不新鲜底物不新鲜底物不新鲜l l 洗涤不干净洗涤不干净洗涤不干净洗涤不干净2.ELISA2.ELISA2.ELISA2.ELISA出现出现出现出现“一片白一片白一片白一片白”的原因：的原因：的原因：的原因：l l 载体吸附性能差载体吸附性能差载体吸附性能差载体吸附性能差 l l 底物错底物错底物错底物错l l 稀释液作包被液稀释液作包被液稀释液作包被液稀释液作包被液l l 加错试剂加错试剂加错试剂加错试剂l l 包被时间过短包被时间过短包被时间过短包被时间过短l l 酶活力低或下降酶活力低或下降酶活力低或下降酶活力低或下降l l 样品含有样品含有样品含有样品含有NaNN

37、aNNaNNaN3 3 3 3第四十页，讲稿共四十四页哦间接ELISA法操作步骤1.样本的收集；2.包被抗原；3.封闭；4.加稀释的待检样品；5.加酶标抗抗体；6.加底物显色；7.终止反应第四十一页，讲稿共四十四页哦实验报告l内容：实验目的、实验原理、实验材料、实内容：实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、讨论与分析验步骤、实验结果、讨论与分析l要求：只接受要求：只接受纸质、手写体纸质、手写体报告。报告。l递交时间：递交时间：2011年年11月月12日，张晓老师。日，张晓老师。第四十二页，讲稿共四十四页哦样本收集包被抗原封 闭加入待检样品，10min洗涤3次加入酶标二抗，10min洗涤3次洗涤3次加入显色液3、4液各一滴洗涤8次已完成未完成第四十三页，讲稿共四十四页哦感谢大家观看第四十四页，讲稿共四十四页哦