多聚酶链式反应扩增片段讲课精.ppt

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1、多聚酶链式反应扩增片段讲课第1页，本讲稿共19页第2页，本讲稿共19页第3页，本讲稿共19页第4页，本讲稿共19页细胞内和细胞外细胞内和细胞外DNADNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内DNADNA的复制的复制体外的模拟体外的模拟模板（母链）模板（母链）细胞内源细胞内源外源加入外源加入引物引物引物合成酶引物合成酶外源加入外源加入底物底物dNTPdNTP细胞内源细胞内源外源加入外源加入聚合酶聚合酶细胞内源细胞内源外源加入外源加入反应环境反应环境细胞内环境细胞内环境缓冲液缓冲液第5页，本讲稿共19页PCRPCR仪仪第6页，本讲稿共19页微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器第7页，本讲稿共1

2、9页靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性第8页，本讲稿共19页靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火第9页，本讲稿共19页靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3

3、5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸第10页，本讲稿共19页靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的：得到两个拷贝的靶序列靶序列第11页，本讲稿共19页循环循环次数次数DNADNA数量数量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243 3、3030次循环后靶序列扩增的数量次

4、循环后靶序列扩增的数量第12页，本讲稿共19页循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸第一次第一次9494C C，10min10min3030次次44，30s30s5555，30s30s 7272，1min1min最后一次最后一次7272，10min10min第13页，本讲稿共19页计算计算DNADNADNADNA含量（含量（含量（含量（g g g g ）50 x (260nm50 x (260nm50 x (260nm50 x (260nm的读数）的读数）的读数）的读数）x x x x 稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g/ml/ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1c

5、m比色杯中比色杯中的吸光值为的吸光值为0.020.02第14页，本讲稿共19页比色杯比色杯第15页，本讲稿共19页葡萄葡萄葡萄葡萄RSRSRSRS基因的基因的基因的基因的RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR扩增扩增扩增扩增葡萄葡萄RSRS基因的基因的RT-PCRRT-PCR扩增图谱扩增图谱M.DNA Marker 2000M.DNA Marker 2000；1.1.RSRS 基因基因约约1300bp第16页，本讲稿共19页第17页，本讲稿共19页第18页，本讲稿共19页实验小结实验小结 PCRPCR仪仪加加热热使使（）变变性性,复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（）,延延

6、伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温(),),在在（）的的作作用用下下,以以 （）为为原原料料,以以（）为为复复制制的的起起点点,合合成成新新链链。如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度,经经（）三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍;将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能能见见到到扩扩增增特特异区段的异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸7272第19页，本讲稿共19页