细胞信号转导研究方法课件.ppt

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1、关于细胞信号转导研究方法现在学习的是第1页，共71页生物样品的处理生物样品的处理v组织样品组织样品采集：新鲜、未污染，剥去脂肪和筋皮等结缔组织采集：新鲜、未污染，剥去脂肪和筋皮等结缔组织若保存，液氮速冻，若保存，液氮速冻，-80冻存冻存v蛋白质成分的保护蛋白质成分的保护通常在生物样品中加入适量的蛋白酶抑制剂：通常在生物样品中加入适量的蛋白酶抑制剂：PMSF（苯甲磺酰氟）、（苯甲磺酰氟）、EDTA、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和亮抑蛋白酶肽。、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和亮抑蛋白酶肽。现在学习的是第2页，共71页v低温保存：根据蛋白质的用途决定保存温度：低温保存：根据蛋白质的用途决定保存温

2、度：4、-20还是还是-80，特殊要液氮，特殊要液氮v冻溶：冻溶：-20或或-804（一天）（一天）室温室温均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀v组织提取物的制备：提取可溶蛋白（尽可能选择组织提取物的制备：提取可溶蛋白（尽可能选择含目标蛋白高的组织）含目标蛋白高的组织）现在学习的是第3页，共71页v步骤及注意事项：步骤及注意事项：v1、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液（、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液（2倍体积）倍体积）v2、匀浆、匀浆1-3min，若较长时间，则间隔，若较长时间，则间隔1minv3、匀浆方法选择：有的组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；人

3、、匀浆方法选择：有的组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；人工匀浆工匀浆v4、缓冲液的选择：使用中性、缓冲液的选择：使用中性PH、离子强度适当、离子强度适当v5、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入（酶抑制、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入（酶抑制剂价格昂贵）剂价格昂贵）v6、低温高速或超速离心、低温高速或超速离心v7、超声的方法、超声的方法现在学习的是第4页，共71页细胞破碎与分离细胞破碎与分离v破碎方法：破碎方法：机械法：机械法：非机械法：非机械法：溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法v酶溶法：酶溶法：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解用生物酶将

4、细胞壁和细胞膜消化溶解常用：常用：溶菌酶、溶菌酶、-1,3-1,3葡聚糖酶、蛋白酶等；葡聚糖酶、蛋白酶等；缺点：缺点：价格高，通用性差价格高，通用性差现在学习的是第5页，共71页v化学渗透法：化学渗透法：化学药品改变细胞壁或膜的通透性化学药品改变细胞壁或膜的通透性有机溶剂（苯、甲苯）、表面活性剂（有机溶剂（苯、甲苯）、表面活性剂（SDS、TritonX-100）、金属螯合剂（）、金属螯合剂（EDTA）、变性剂（尿素）、变性剂（尿素）v微波加热法：微波加热法：适用于热稳定的产物适用于热稳定的产物v其他：其他：反复冻融法、渗透压法、干燥法反复冻融法、渗透压法、干燥法现在学习的是第6页，共71页信号

5、转导的研究方法信号转导的研究方法受体v突变株的筛选（遗传学方法）突变株的筛选（遗传学方法）受体提纯（亲和层析）受体提纯（亲和层析）标记配体法检测受体：标记配体法检测受体：现在学习的是第7页，共71页v受体与配体相互作用研究方法受体与配体相互作用研究方法：（1 1）饱和实验，用于测定放射性配体对受体的亲和力（）饱和实验，用于测定放射性配体对受体的亲和力（K K）以及结合位点的密度（）以及结合位点的密度（BmaxBmax）；）；（2 2）抑制实验，用于测定未标记的竞争配体与受体的亲和力）抑制实验，用于测定未标记的竞争配体与受体的亲和力（KiKi）；）；（3 3）动力学实验，用于测定放射性配体与受体

6、的结合）动力学实验，用于测定放射性配体与受体的结合速率常数（速率常数（K+1K+1）和解离速率常数（）和解离速率常数（k-1k-1）。）。现在学习的是第8页，共71页v饱和实验饱和实验常用于确定受体密度（受体的数目）在实验干预（如药物治疗）时的变化。保持受常用于确定受体密度（受体的数目）在实验干预（如药物治疗）时的变化。保持受体数不变而改变放射配体浓度可得到饱和曲线。从该实验中可估计受体最大结合量体数不变而改变放射配体浓度可得到饱和曲线。从该实验中可估计受体最大结合量（Bmax）和受体对放射性配体的解离常数（）和受体对放射性配体的解离常数（Ka）。）。v饱和实验的结果以结合配体数（与受体结合的

7、放射性配体的浓度）为饱和实验的结果以结合配体数（与受体结合的放射性配体的浓度）为y轴，游离配体轴，游离配体数（未与受体结合的放射性配体的浓度）为数（未与受体结合的放射性配体的浓度）为x轴作图。当放射性配体浓度增大时轴作图。当放射性配体浓度增大时结合配体数逐渐增加，当达到某一点以后，再增多放射性配体量也不引起结结合配体数逐渐增加，当达到某一点以后，再增多放射性配体量也不引起结合配体数的显著增加。合配体数的显著增加。v饱和曲线的最高趋近点所对应的饱和曲线的最高趋近点所对应的y值，亦可代表所研究组织中的受体密度。值，亦可代表所研究组织中的受体密度。Kd为占据受体为占据受体50结合位点时的配体浓度。结

8、合位点时的配体浓度。现在学习的是第9页，共71页v亲和标记法分离表面受体亲和标记法分离表面受体v亲和标记（亲和标记（affinitylabeling）是常用的分离细胞表面受体的方法）是常用的分离细胞表面受体的方法v原理：原理：将细胞与超量标记的激素（配体）混合，以饱和所有特异受将细胞与超量标记的激素（配体）混合，以饱和所有特异受体的激素结合位点。洗去多余的激素，然后加入能够与受体和配体体的激素结合位点。洗去多余的激素，然后加入能够与受体和配体结合的结合的共价交联剂共价交联剂将激素与受体进行共价交联。将激素与受体进行共价交联。现在学习的是第10页，共71页v亲和标记胰岛素受体亲和标记胰岛素受体现

9、在学习的是第11页，共71页v大多数交联剂含有两个可与蛋白质中自由氨基相互作用的基团，大多数交联剂含有两个可与蛋白质中自由氨基相互作用的基团，当表面受体与配体结合后，配体和受体上各自的自由氨基的距当表面受体与配体结合后，配体和受体上各自的自由氨基的距离靠近到足以被小分子的交联剂结合时，受体和配体就会被交离靠近到足以被小分子的交联剂结合时，受体和配体就会被交联在一起。联在一起。v与交联剂共价结合的配体和受体能够耐受去垢剂和变性剂的处理。与交联剂共价结合的配体和受体能够耐受去垢剂和变性剂的处理。v因而可用去垢剂和变性剂溶解细胞质膜，分离膜蛋白通过电泳因而可用去垢剂和变性剂溶解细胞质膜，分离膜蛋白通

10、过电泳进行分析。进行分析。现在学习的是第12页，共71页v交联剂的分子结构及与受体和配体的共价交联交联剂的分子结构及与受体和配体的共价交联与自由氨基反应的位点现在学习的是第13页，共71页v核受体作用的核受体作用的DNA元件研究方法元件研究方法ChiponChip纯化的受体制备抗体纯化的受体制备抗体CHIP特异核酸特异核酸序列与已知序列的基因芯片杂交序列与已知序列的基因芯片杂交受体结受体结合的核酸序列合的核酸序列现在学习的是第14页，共71页G蛋白v药理学激活剂及抑制剂药理学激活剂及抑制剂非水解的非水解的GTP类似物激活剂：类似物激活剂：-S-GTP、,-,-亚氨基亚氨基GTPGTP，与活化，

11、与活化G G蛋白混合，使蛋白混合，使G G蛋白持续活化状态蛋白持续活化状态细菌毒素细菌毒素-霍乱毒素激活剂：霍乱毒素激活剂：ADP核糖基共价结合核糖基共价结合亚基，不可逆修亚基，不可逆修饰，结合饰，结合GTPGTP，但不能水解，但不能水解GDP类似物抑制剂：类似物抑制剂：GDPS S，结合，结合亚基的鸟苷酸位点，广泛应用亚基的鸟苷酸位点，广泛应用现在学习的是第15页，共71页v生化实验检测生化实验检测GTP结合实验：结合实验：用用GTPGTP类似物类似物 -3232PGTPPGTP，检测，检测G G蛋白的存在，几种蛋白的存在，几种G G蛋白的特异性？蛋白的特异性？免疫印迹实验：免疫印迹实验：抗

12、体抗体GTPase活性实验：活性实验：不同反应底物：同位素标记法不同反应底物：同位素标记法（-3232PGTPPGTP）；级联反应荧光法）；级联反应荧光法（NADHNADH，GTPaseGTPase、丙酮酸激酶和、丙酮酸激酶和LDHLDH）v分子遗传学手段分子遗传学手段借助借助G蛋白突变株蛋白突变株（功能缺失突变株、显性负突变株、功能获得突变（功能缺失突变株、显性负突变株、功能获得突变株）株）现在学习的是第16页，共71页环核苷酸信使系统vcAMP/cGMP定性及定量测定定性及定量测定3H/125I标记标记cAMP/CGMP竞争结合分析系统竞争结合分析系统酶联免疫方法（酶联免疫方法（ELISA

13、)色谱分离色谱分离-质谱测定质谱测定细胞内实时测定：细胞内实时测定：荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRET）及生物分子荧光互补）及生物分子荧光互补（BIFC）现在学习的是第17页，共71页vcAMP3H分析系统，优点是放射性半衰期优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；长，可用于大量样品的分析；vcAMP125I分析系统，用于小量样品的分析；用于小量样品的分析；vcAMPELISA测定方法，测定简便、敏感性高测定简便、敏感性高（特异受体）（特异受体）。现在学习的是第18页，共71页vcAMP信号系统常用药理学试剂信号系统常用药理学试剂vcAMP类似物：类似物：竞争性结合竞争性结合PK

14、A调节亚基上的调节亚基上的cAMP结合位点，结合位点，PKA的竞争拮抗剂，的竞争拮抗剂，PDE不能水解，不能水解，Rp-cAMP、Sp-CAMPv与与PKA的底物结合位点竞争的抑制剂：的底物结合位点竞争的抑制剂：结合结合C亚基的亚基的ATP结合位结合位点，抑制专一性低，异喹啉衍生物点，抑制专一性低，异喹啉衍生物H89、KT5720v蛋白激酶抑制剂（蛋白激酶抑制剂（PKI）：）：结合结合C亚基的底物结合位点，细胞内源：亚基的底物结合位点，细胞内源：、三种亚型，人工合成三种亚型，人工合成PKAPKA抑制肽（高浓度时对抑制肽（高浓度时对PKGPKG的的影响）影响）现在学习的是第19页，共71页vcG

15、MP信号系统常用药理学试剂信号系统常用药理学试剂人工合成的人工合成的cGMP类似物：类似物：8-Br-cGMP，直接激活，直接激活PKGsGC抑制剂：抑制剂：NS2028PKG抑制剂：抑制剂：KT5823现在学习的是第20页，共71页脂质代谢的常用方法v同位素示踪：通过标记32Pv磷脂分子的定性和定量：色谱、质谱的应用脂组学现在学习的是第21页，共71页vDAG的测定的测定提取含提取含DAG的样品，用的样品，用DAG激酶催化底物激酶催化底物DAG，使之发，使之发生磷酸化，外源加入生磷酸化，外源加入32-ATP，最后将反应产物进行分离后，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样

16、品中测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量的含量（Amersham公司生产的公司生产的DAG分析系统）。分析系统）。现在学习的是第22页，共71页vIP3的测定的测定v采用采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱分离洗脱，收集分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。洗脱峰后进行液闪测定。vD-myo-IP33H分析系统直接测定粗提物中的分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此含量，此方法简易、敏感（方法简易、敏感（Amersh

17、am公司）。公司）。现在学习的是第23页，共71页钙信号v细胞内游离钙离子测定方法细胞内游离钙离子测定方法v方法选择：方法选择：1 1、使用、使用CaCa2+2+特异性指示剂时，指示剂与特异性指示剂时，指示剂与CaCa2+2+专一结合性强、亲和力专一结合性强、亲和力高，可以测定低浓度高，可以测定低浓度CaCa2+2+；2 2、尽可能获得、尽可能获得CaCa2+2+浓度绝对值；浓度绝对值；3 3、测定、测定CaCa2+2+水平的变化比细胞内水平的变化比细胞内CaCa信号引起的相关生理反应要快；信号引起的相关生理反应要快；4 4、指示剂与、指示剂与CaCa2+2+结合不损害细胞内正常生理生化过程；

18、结合不损害细胞内正常生理生化过程；5 5、容易进入细胞并在胞质内扩散；、容易进入细胞并在胞质内扩散；6 6、有可能显示胞内、有可能显示胞内CaCa2+2+分布。分布。现在学习的是第24页，共71页vCa2+i的测定的测定v细胞内细胞内Ca2+的测定方法有原子吸收光谱法、离子的测定方法有原子吸收光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。现在学习的是第25页，共71页荧光法v水母发光蛋白法水母发光蛋白法v钙离子荧光探针法（目前常用），标记靶细胞钙离子荧光探针法（目前常用），标记靶细胞钙离子荧光探针钙离子荧光探针常用的常用的有有Fluo-3AM、qu

19、in-2/Am、Fura-2/Am及及Indo-1等。等。现在学习的是第26页，共71页v荧光探针的装载方法：荧光探针的装载方法：显微注射：显微注射：水母发光蛋白和水母发光蛋白和Dextran偶联的探针偶联的探针酸化导入法：酸化导入法：离子型探针（有些细胞无法导入）离子型探针（有些细胞无法导入）常温孵育法：常温孵育法：AM酯化的探针（在动物细胞应用广泛酯化的探针（在动物细胞应用广泛）低温导入法：低温导入法：植物细胞，低温抑制细胞壁的酯酶植物细胞，低温抑制细胞壁的酯酶现在学习的是第27页，共71页v荧光测定仪器荧光测定仪器 荧光分光光度计：少用荧光分光光度计：少用 流式细胞仪：流式细胞仪：激光扫

20、描共聚焦显微镜术（激光扫描共聚焦显微镜术（LSCMLSCM）数字共聚焦显微镜数字共聚焦显微镜现在学习的是第28页，共71页vFluo3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子与钙离子Ca2+结合后荧光会增加结合后荧光会增加60至至80倍，最大激发波长为倍，最大激发波长为506nm，最大发射波长为，最大发射波长为526nm。是目前最常用的一种钙离子荧光探。是目前最常用的一种钙离子荧光探针。针。vFluo3-AM是是Fluo3的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。细胞中。Flu

21、o3-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo3，从而被滞留在细胞内。，从而被滞留在细胞内。v激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以Fluo3可被广泛使用于可被广泛使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品细胞的光损伤。细胞的光损伤。现在学习的是第29页，共71页v钙调素的定量测定钙调素的定量测定酶法：酶法：根据根据CaM依赖的酶（依赖的酶（PDE、NAD激酶、激酶、Ca-ATP酶等）激活的程度，使用广泛酶等）激活的程度，使用广泛免疫学法：免

22、疫学法：RIA和和ELISA（抗体，特异性强、测定（抗体，特异性强、测定CaM的总量，非活性）的总量，非活性）现在学习的是第30页，共71页磷酸化的信号转导分子v酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化v蛋白鉴定蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀,SDS-PAGE电泳，然而采用电泳，然而采用Westernblotting鉴定鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，其分子量，进一步利用分子生物

23、学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构和氨基酸序列。搞清其基因结构和氨基酸序列。现在学习的是第31页，共71页免疫学法v蛋白质印迹：蛋白质印迹：抗体（如抗抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加入蛋白酶）、样品匀浆液加入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂；目标蛋白印抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂；目标蛋白印迹发生移位迹发生移位v免疫组织化学：免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变化磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变化v流式细胞术：流式细胞术：荧光抗体荧光抗体现在学习的是第32页，共71页v磷酸化蛋白组学磷酸化蛋白组学 高分辨率质谱高分辨率质谱 磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷

24、酸酶）、冈田酸（丝磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田酸（丝/苏苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油磷酸钠（广谱、氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶）非特异磷酸酶）现在学习的是第33页，共71页激酶活性的测定激酶活性的测定v常见激酶活性的测定有常见激酶活性的测定有PTK、PKC及及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。等。均有商品化的试剂盒。v检测原理：检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入32-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算出样品酶的，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准

25、曲线推算出样品酶的活性。活性。vPKC从胞质向胞膜的转位是从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分离胞质和活化的一个重要指标，因而分离胞质和胞膜中的胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活性占总活性占总PKC活性的比活性的比例，从而判定例，从而判定PKC的活化程度。的活化程度。现在学习的是第34页，共71页蛋白质表达水平和细胞内定位研究蛋白质表达水平和细胞内定位研究v信号蛋白分子表达水平及分子量检测信号蛋白分子表达水平及分子量检测westernblotanalysisv信号蛋白分子在细胞内定位研究信号蛋白分子在细胞内定位研究immunohist

26、ochemistry/immunnocytochemistryImmunofluorescence（IF）Greenfluorescentprotein（GFP，livecells）现在学习的是第35页，共71页westernblotvSDS-PAGE转膜（转膜（PVDForNC）封闭封闭一抗一抗洗涤洗涤标记二抗标记二抗洗涤洗涤显色或化显色或化学发光显影学发光显影现在学习的是第36页，共71页vSDS-PAGE作用：作用：确定蛋白质纯度、确定蛋白质确定蛋白质纯度、确定蛋白质亚单位的分子量亚单位的分子量v考染：考染：检测含检测含0.1ug蛋白质条带蛋白质条带银染：银染：灵敏度高灵敏度高100倍倍

27、现在学习的是第37页，共71页v印迹膜上蛋白质染色：印迹膜上蛋白质染色：聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜v氨基黑染色：氨基黑染色：蛋白质测序和蛋白质原位切割，首选染料（检测最小量：蛋白质测序和蛋白质原位切割，首选染料（检测最小量：50ng）v考染：考染：除除NC膜外（膜外（50ng）v丽春红丽春红S：适用印迹膜用于二次检测（适用印迹膜用于二次检测（westernblot）（200ng），），条件摸索成熟后，不建议染色条件摸索成熟后，不建议染色v胶体金、胶体银、印度墨汁、荧光胺标记胶体金、胶体银、印度墨汁、荧光胺标记现在学习的是第38页，共71页v检测目标蛋白

28、：检测目标蛋白：结合结合PAGE的高分辨率和固相免疫反应的高特异性，可检测的高分辨率和固相免疫反应的高特异性，可检测1-5ng、中等分子、中等分子量的靶蛋白量的靶蛋白v上样量：上样量：目标蛋白量不应太低目标蛋白量不应太低v膜的选择：膜的选择：蛋白质的分子量（孔径）蛋白质的分子量（孔径）v封闭液：封闭液：20%BSA10%脱脂奶粉脱脂奶粉10%马血清马血清v抗体：抗体：内参内参v检测系统：检测系统：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶-ECLv结果分析：结果分析：背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封闭不充分；条带背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封闭不充分；条带过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短

29、、蛋白含量低过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短、蛋白含量低vStrippingbuffer漂洗，漂洗，去除一结合的一抗和二抗，多次使用去除一结合的一抗和二抗，多次使用现在学习的是第39页，共71页免疫荧光技术免疫荧光技术Immunofluorescence（IF）v利用某些荧光素如利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其他蛋白结合制备成荧光探等通过化学反应与抗体或其他蛋白结合制备成荧光探针，然后与待测抗原或配体发生特异性结合，形成的复合物在一定的波长光针，然后与待测抗原或配体发生特异性结合，形成的复合物在一定的波长光的激发下，可产生荧光，利用荧光显微镜对抗原进行定性或定位的检测。的

30、激发下，可产生荧光，利用荧光显微镜对抗原进行定性或定位的检测。v采用流式细胞免疫荧光技术（采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群的蛋白质）可从单细胞水平检测不同细胞亚群的蛋白质分子，用两种荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内检测分子，用两种荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内检测两种不同的分子（两种不同的分子（DoubleIF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子检测。），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子检测。现在学习的是第40页，共71页蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术vCo-IP（免疫共沉淀（免

31、疫共沉淀)vGSTpulldownassayvYeastormammaliantwohybridassayvFRET（fluorescenceresonanceenergytransferassay)现在学习的是第41页，共71页vIP是利用抗原蛋白质与抗体的特异结合以及细菌蛋白是利用抗原蛋白质与抗体的特异结合以及细菌蛋白“proteinA”能特异性地结合到免疫球蛋白的能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段而开发出来的方法。目片段而开发出来的方法。目前多用精制的前多用精制的proteinA预先结合固化在预先结合固化在agarose的的beads上，使上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，之与含有

32、抗原的溶液及抗体反应后，beads上的上的proteinA就能吸就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。AgarosebeadsproteinA抗原抗体现在学习的是第42页，共71页免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-IP）v当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果蛋白质蛋白质间的相互作用被保留下来。如果蛋白质x的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀x，那么与，那么与x在胞内结合的蛋白在胞内结合的蛋白y也能被沉淀下来。进一步通过也能被沉淀下来。进一步通过westernblot和

33、质谱分析。和质谱分析。v常用于测定两种目标蛋白在胞内是否结合常用于测定两种目标蛋白在胞内是否结合v用于确定一种特定蛋白的新的作用搭档用于确定一种特定蛋白的新的作用搭档v但可能测定不到低亲和力和瞬间的蛋白但可能测定不到低亲和力和瞬间的蛋白-蛋白相互作用。蛋白相互作用。现在学习的是第43页，共71页v优点：优点：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物）可以分离得到天

34、然状态的相互作用蛋白复合物。v缺点：缺点：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果。测不正确，实验就得不到结果。现在学习的是第44页，共71页v注意的问题：注意的问题：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在）细胞裂解

35、采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（定。不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。各种酶抑制剂。（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：）使用对照抗体：现在学习的是第45页，共71页染色体免疫共沉淀技术（染色体免疫共沉淀技术（ChIP）v染色质免疫

36、沉淀技术（染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）是）是目前唯一研究体内目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。与蛋白质相互作用的方法。v基本原理：在活细胞状态下固定蛋白质基本原理：在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质

37、与质与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。vChIP不仅可以检测体内不仅可以检测体内反式因子与反式因子与DNA的动态作用的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。共价修饰与基因表达的关系。vChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围与其他方法的结合，扩大了其应用范围：现在学习的是第46页，共71页Chip-on-chipvChIP与基因芯片相结合建立的与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。现在学习的是第47页，共71页细胞核转录因子细胞核转录因

38、子v电泳迁移率改变分析电泳迁移率改变分析:根据核转录因子可与一些特定的核苷根据核转录因子可与一些特定的核苷酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，来酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，来鉴定信号转导中的核转录因子。鉴定信号转导中的核转录因子。v并且采用足迹法并且采用足迹法(footprinting)分析新发现核转录因子结合分析新发现核转录因子结合DNA的位置和核苷酸序列。的位置和核苷酸序列。vChip现在学习的是第48页，共71页采用基因克隆技术发现了越来越多的信号蛋白分子；嵌合分子的构建及基因转染等技术的应用为细胞因子的信号转导研究提供了有效的手段；点突变、肽竞争等技

39、术使信号蛋白中某些功能区的作用的研究变得更为精确。现在学习的是第49页，共71页细胞信号转导与疾病细胞信号转导与疾病现在学习的是第50页，共71页信号转导异常发生的环节和机制信号转导异常发生的环节和机制v一信息分子异常一信息分子异常v不足：不足：如胰岛素生成减少，体内产生抗胰岛素抗体或胰岛素拮抗因子等，如胰岛素生成减少，体内产生抗胰岛素抗体或胰岛素拮抗因子等，均可导致胰岛素的相对或绝对不足，引起高血糖。均可导致胰岛素的相对或绝对不足，引起高血糖。v过量：过量：脑缺血、缺氧或创伤时谷氨酸释放增加，各氨酸在脑内大量脑缺血、缺氧或创伤时谷氨酸释放增加，各氨酸在脑内大量聚集。导致谷氨酸天冬氨酸受体聚集

40、。导致谷氨酸天冬氨酸受体(NMDA(NMDA受体受体)的过度激活。使的过度激活。使Ca2+Ca2+大量内流，可激活脂酶和蛋白酶等，导致细胞死亡。大量内流，可激活脂酶和蛋白酶等，导致细胞死亡。（由谷氨酸增多对神经系统产生的兴奋性毒性作用：脑的缺血性损伤，由谷氨酸增多对神经系统产生的兴奋性毒性作用：脑的缺血性损伤，癫痫形成以及神经退行性变等）。癫痫形成以及神经退行性变等）。现在学习的是第51页，共71页v病理性或损伤性刺激病理性或损伤性刺激 v病原体及其产物的刺激：如脂多糖病原体及其产物的刺激：如脂多糖(Lps)(Lps)通过其受体启动细胞的信通过其受体启动细胞的信号转导通路号转导通路 ：a.a.

41、激活转录因子激活转录因子NF-NF-；b.b.激活激活MAPKMAPK家族成员：家族成员：JNKJNK和和P38MAPKP38MAPK。现在学习的是第52页，共71页v1 1、遗传性受体病、遗传性受体病v受体缺陷导致的疾病：受体缺陷导致的疾病：如家族性肾性尿崩症是如家族性肾性尿崩症是ADHADH受体基因突受体基因突变导致变导致ADHADH受体合成减少或结构异常。受体合成减少或结构异常。v受体过度激活导致的疾病：受体过度激活导致的疾病：TSHR TSHR与与TSHTSH结合后。能激活结合后。能激活G G-AC-AC-cAMP-PKAcAMP-PKA通路、通路、GqPLCDAGPKCGqPLCDA

42、GPKC通路及通路及ERKERK通路等，导致通路等，导致甲状腺紊分泌和促进甲状腺增殖效应。甲状腺紊分泌和促进甲状腺增殖效应。二、受体信号转导异常二、受体信号转导异常现在学习的是第53页，共71页v2 2、自身免疫性受体病：、自身免疫性受体病：GraveGrave病，重症肌无力患者体内发现有抗病，重症肌无力患者体内发现有抗N N型型乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体(nAChR(nAChR的抗体）能阻断运动终板上的的抗体）能阻断运动终板上的nAChRnAChR与乙酰胆碱与乙酰胆碱结合，导致肌肉收缩障碍。结合，导致肌肉收缩障碍。v3 3、继发性受体异常：、继发性受体异常：心衰时血中去甲肾上腺素浓度过高可使受

43、体心衰时血中去甲肾上腺素浓度过高可使受体下调以及受体与下调以及受体与G G蛋白解偶联，使细胞内蛋白解偶联，使细胞内cAMPcAMP生成减少，导致去甲生成减少，导致去甲肾上腺素的正性肌力作用减弱肾上腺素的正性肌力作用减弱 二、受体信号转导异常二、受体信号转导异常现在学习的是第54页，共71页v如如霍乱肠毒素能选择性催化小肠黏膜上皮细胞中的霍乱肠毒素能选择性催化小肠黏膜上皮细胞中的G G亚基精氨酸亚基精氨酸ADPADP核糖基化，核糖基化，导致导致GTPGTP酶活性丧失使酶活性丧失使G G 处于不可逆性激活状态，持续刺激腺苷酸环化酶处于不可逆性激活状态，持续刺激腺苷酸环化酶(Ac)-(Ac)-cAM

44、P-PKAcAMP-PKA，使水分不断进入肠腔，引起严重的腹泻和脱水。，使水分不断进入肠腔，引起严重的腹泻和脱水。三、三、G G蛋白信号转导异常蛋白信号转导异常v如在组织缺血如在组织缺血-再灌注损伤过程中，胞浆再灌注损伤过程中，胞浆Ca2+Ca2+浓度升高，通过下游的信号转导浓度升高，通过下游的信号转导途径引起组织损伤。途径引起组织损伤。四、细胞内信号的转导异常四、细胞内信号的转导异常 现在学习的是第55页，共71页v在疾病的发生和发展过程中，可涉及多个信息分子影响多个信号转导途径，在疾病的发生和发展过程中，可涉及多个信息分子影响多个信号转导途径，导致复杂的网络调节失衡。导致复杂的网络调节失衡

45、。五、多个环节细胞信号转导异常五、多个环节细胞信号转导异常v如感染性休克发病过程中，在同一刺激源（内毒素）作用下使交感神经兴奋，若作用于如感染性休克发病过程中，在同一刺激源（内毒素）作用下使交感神经兴奋，若作用于受体，则引起动脉收缩表现为冷休克受体，则引起动脉收缩表现为冷休克;若交感神经兴奋激活若交感神经兴奋激活受体，使动、静脉受体，使动、静脉短路开放，则表现为暖休克。短路开放，则表现为暖休克。v如心肌肥大的发病过程中，心肌负荷过重引起的机械刺激，神经体液调节产生的去如心肌肥大的发病过程中，心肌负荷过重引起的机械刺激，神经体液调节产生的去甲肾上腺素、血管紧张素等，通过不同的信号转导蛋白的传递，

46、最终引起相同的病甲肾上腺素、血管紧张素等，通过不同的信号转导蛋白的传递，最终引起相同的病理反应理反应心肌肥大。心肌肥大。六、同一刺激引起不同的病理反应六、同一刺激引起不同的病理反应七、不同刺激引起相同的病理反应七、不同刺激引起相同的病理反应 现在学习的是第56页，共71页某些某些疾病的异常信号转导疾病的异常信号转导v胰岛素受体胰岛素受体(IR)(IR)为酪氨酸蛋白激酶为酪氨酸蛋白激酶(PTK)(PTK)型受体。型受体。PTKPTK激活通过激活通过胰岛素受体底物胰岛素受体底物(IRS)(IRS)激活激活PIPI一一3K3K及及RasRafRasRaf一一MEKERKMEKERK等多条信等多条信号

47、转导通路，号转导通路，v促进葡萄糖转运蛋白促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)4(GLUT4)转位到膜上，从而增加外周组织转位到膜上，从而增加外周组织摄取葡萄糖的能力；摄取葡萄糖的能力；使无恬性的糖原合酶转为激括的形式增使无恬性的糖原合酶转为激括的形式增加糖原的合成；加糖原的合成；使基因表达增强蛋白质合成增加、促进细胞使基因表达增强蛋白质合成增加、促进细胞的增殖等的增殖等。一、胰岛素抵抗性糖尿病一、胰岛素抵抗性糖尿病现在学习的是第57页，共71页1、遗传性胰岛素抵抗性糖尿病、遗传性胰岛素抵抗性糖尿病v一般有家族史，已报道了发生在该病患者中约一般有家族史，已报道了发生在该病患者中约5050多种胰岛

48、索受体的基因多种胰岛索受体的基因突变，突变呈明显的异质性，以点突变为主，分布于受体的胞外区和突变，突变呈明显的异质性，以点突变为主，分布于受体的胞外区和PTKPTK区。区。v突变可导致受体合成障碍、受体往细胞膜运输受阻、受体与胰突变可导致受体合成障碍、受体往细胞膜运输受阻、受体与胰岛素亲和力下降、岛素亲和力下降、PTKPTK活性降低及受体降解加快等。活性降低及受体降解加快等。现在学习的是第58页，共71页2、自身免疫性胰岛素抵抗性糖尿病、自身免疫性胰岛素抵抗性糖尿病v患者多为女性，合并其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮等。患者多为女性，合并其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮等。血中可测到抗

49、胰岛素受体的抗体血中可测到抗胰岛素受体的抗体v以阻断型为主，与受体结合后可阻断胰岛素与受体的结合及效应。以阻断型为主，与受体结合后可阻断胰岛素与受体的结合及效应。现在学习的是第59页，共71页3、继发性胰岛素抵抗、继发性胰岛素抵抗v肥胖患者通常摄人过量，使餐后血糖浓度明显增高，进而引起血中胰岛肥胖患者通常摄人过量，使餐后血糖浓度明显增高，进而引起血中胰岛素浓度升高，长时间增高的胰岛素可通过下调作用使素浓度升高，长时间增高的胰岛素可通过下调作用使IR减少，导致靶细减少，导致靶细胞对胰岛素的敏感性降低胞对胰岛素的敏感性降低v严重的创伤、应激、感染时，大量产生的应激激素严重的创伤、应激、感染时，大量

50、产生的应激激素(如糖皮质激素如糖皮质激素)和细和细胞因子胞因子(如如TNF)等可通过干扰胰岛素受体后的信号转导途径及细等可通过干扰胰岛素受体后的信号转导途径及细胞内的代谢高血糖和运动不足等也可引起胰岛素抵抗性糖尿病。胞内的代谢高血糖和运动不足等也可引起胰岛素抵抗性糖尿病。现在学习的是第60页，共71页二、肿瘤二、肿瘤 v肿瘤的早期主要是与增殖、分化、凋亡有关的基因改变肿瘤的早期主要是与增殖、分化、凋亡有关的基因改变v晚期则是控制细胞黏附和运动性的基因发生变化使晚期则是控制细胞黏附和运动性的基因发生变化使肿瘤细胞获得了转移性。肿瘤细胞获得了转移性。现在学习的是第61页，共71页(一一)促细胞增殖