葡聚糖凝胶层析脱盐精选PPT.ppt

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1、葡聚糖凝胶层析脱盐第1页，此课件共23页哦学习凝胶层析的工作原理和操作方法；学习凝胶层析的工作原理和操作方法；掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。目目 的的第2页，此课件共23页哦原原 理理凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛或排阻层析。凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛或排阻层析。凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛或排阻层析。凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。凝胶过滤的主要装置是填

2、充有层析介质的层析柱。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。凝凝凝凝胶胶胶胶是是是是一一一一种种种种具具具具有有有有多多多多孔孔孔孔、网网网网状状状状结结结结构构构构的的的的分分分分子子子子筛筛筛筛。利利利利用用用用这这这这种种种种凝凝凝凝胶胶胶胶分分分分子子子子筛筛筛筛对对对对大大大大小小小小、形形形形状状状状不不不不同同同同的的的的分分分分子子子子进进进进行行行行层层层层析析析析分分分分离离离离，称称称称凝凝凝凝胶胶胶胶层层层层析析析析 。第3页，此课件共23页哦原原 理理1 1、层析介质的特点、层析介质的特点、层析介质的特点、层析介质的特点 （1 1）遇水为不溶解的固相；）遇水为不

3、溶解的固相；）遇水为不溶解的固相；）遇水为不溶解的固相；（2 2）是化学惰性物质；）是化学惰性物质；）是化学惰性物质；）是化学惰性物质；（3 3）离子基团含量少；）离子基团含量少；）离子基团含量少；）离子基团含量少；（4 4）颗粒大小和网眼均匀；）颗粒大小和网眼均匀；）颗粒大小和网眼均匀；）颗粒大小和网眼均匀；（5 5）机械强度较强；）机械强度较强；）机械强度较强；）机械强度较强；（6 6）具有可选择的多种孔径。）具有可选择的多种孔径。）具有可选择的多种孔径。）具有可选择的多种孔径。第4页，此课件共23页哦原原 理理O 目目前前使使用用较较多多的的是是葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺

4、凝凝胶胶、琼琼脂糖凝胶及其衍生物。脂糖凝胶及其衍生物。葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶（商商品品名名称称Sephadex）是是最最常常用用的的层层析析介介质质。它它是是由由一一定定平平均均分分子子量量的的葡葡聚聚糖糖和和交交联联剂剂1-氯氯-2,3-环环氧丙烷（氧丙烷（CH2-CH-CH2Cl）交联成的具有三维结构不溶水）交联成的具有三维结构不溶水的的的的高高高高分分分分子子子子化化化化合合合合物物物物。调调调调节节节节葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖和和和和交交交交联联联联剂剂剂剂配配配配比比比比，可可可可以以以以获获获获得得得得网网网网眼眼眼眼大小不同，型号各异的凝胶。大小不同，型号各异的凝胶。大小不同，型号

5、各异的凝胶。大小不同，型号各异的凝胶。第5页，此课件共23页哦原原 理理当当当当葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖分分分分子子子子量量量量越越越越小小小小，交交交交联联联联剂剂剂剂用用用用量量量量越越越越大大大大，则则则则交交交交联联联联度度度度越越越越大大大大，凝凝凝凝胶网眼越小，吸水量越小，胶网眼越小，吸水量越小，胶网眼越小，吸水量越小，胶网眼越小，吸水量越小，GG值也越小。值也越小。值也越小。值也越小。GG值表示每克干胶吸水量（值表示每克干胶吸水量（值表示每克干胶吸水量（值表示每克干胶吸水量（mLmL）的十倍。）的十倍。）的十倍。）的十倍。例如例如例如例如Sephadex G-25Sephadex

6、 G-25其吸水量应为其吸水量应为其吸水量应为其吸水量应为2.5mL/g2.5mL/g干胶。干胶。干胶。干胶。常常常常用用用用的的的的葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶有有有有多多多多种种种种规规规规格格格格，如如如如G-10G-10、G-15G-15、G-25G-25、G-50G-50、G-75G-75、G-100G-100等。等。等。等。第6页，此课件共23页哦原原 理理2 2、分离原理、分离原理、分离原理、分离原理 当当当当混混混混合合合合样样样样液液液液加加加加到到到到凝凝凝凝胶胶胶胶柱柱柱柱上上上上，随随随随着着着着洗洗洗洗脱脱脱脱剂剂剂剂而而而而通通通通过过过过凝凝凝凝胶胶胶

7、胶柱柱柱柱时时时时，分分分分子子子子大大大大小不同的物质受到不同的阻滞作用小不同的物质受到不同的阻滞作用小不同的物质受到不同的阻滞作用小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗颗颗颗粒粒粒粒接接接接近近近近或或或或大大大大于于于于网网网网眼眼眼眼的的的的分分分分子子子子，不不不不能能能能进进进进入入入入凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的网网网网眼眼眼眼中中中中，在在在在重重重重力力力力作作作作用用用用下下下下它它它它们们们们随随随随着着着着溶溶溶溶剂剂剂剂在在在在凝凝凝凝胶胶胶胶颗颗颗颗粒粒粒粒之之之之间间间间沿沿沿沿较较较较短短短短流流流流程程程程向向向向下下下下流流流流动动动动，受受受受到到到到的的的的阻阻

8、阻阻滞滞滞滞作作作作用用用用小小小小，移移移移动动动动速速速速度度度度快快快快，先先先先出出出出层层层层析析析析柱柱柱柱（此此此此现现现现象象象象叫叫叫叫作作作作被被被被排排排排阻阻阻阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；颗颗颗颗粒粒粒粒小小小小于于于于网网网网眼眼眼眼的的的的分分分分子子子子可可可可渗渗渗渗入入入入凝凝凝凝胶胶胶胶网网网网眼眼眼眼之之之之中中中中，它它它它们们们们被被被被洗洗洗洗脱脱脱脱时时时时不不不不断断断断地地地地从从从从一

9、一一一个个个个网网网网眼眼眼眼穿穿穿穿到到到到另另另另一一一一个个个个网网网网眼眼眼眼，逐逐逐逐层层层层扩扩扩扩散散散散，阻阻阻阻滞滞滞滞作作作作用用用用大大大大，流流流流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。程长，移动速度慢，因而后出层析柱。程长，移动速度慢，因而后出层析柱。程长，移动速度慢，因而后出层析柱。第7页，此课件共23页哦原原 理理第8页，此课件共23页哦原原 理理第9页，此课件共23页哦原原 理理第10页，此课件共23页哦操作步骤操作步骤1 1、层析柱的准备、层析柱的准备、层析柱的准备、层析柱的准备（1 1）清清清清 洗洗洗洗：每每每每 组组组组 取取取取 一一一一 支支支支 层层层

10、层 析析析析 柱柱柱柱，用用用用 清清清清 水水水水 冲冲冲冲 洗洗洗洗 干干干干 净净净净。（2 2）安安安安装装装装与与与与检检检检查查查查：检检检检查查查查出出出出口口口口装装装装置置置置中中中中尼尼尼尼龙龙龙龙绸绸绸绸或或或或烧烧烧烧结结结结滤滤滤滤板板板板是是是是否否否否完完完完好好好好干干干干净净净净。安安安安装装装装层层层层析析析析柱柱柱柱，让让让让其其其其垂垂垂垂直直直直固固固固定定定定于于于于滴滴滴滴定定定定台台台台架架架架上上上上。对对对对准准准准出出出出口口口口处处处处，放放放放一一一一只只只只250mL250mL烧烧烧烧杯杯杯杯。向向向向层层层层析析析析柱柱柱柱内内内内

11、灌灌灌灌洗洗洗洗脱脱脱脱剂剂剂剂，打打打打开开开开出出出出口口口口螺螺螺螺旋旋旋旋夹夹夹夹，检检检检查查查查有有有有无无无无渗渗渗渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。漏、出口乳胶管是否通畅等情况。漏、出口乳胶管是否通畅等情况。漏、出口乳胶管是否通畅等情况。（3 3）排排排排气气气气泡泡泡泡：保保保保持持持持柱柱柱柱内内内内一一一一定定定定的的的的水水水水位位位位，用用用用手手手手指指指指弹弹弹弹击击击击柱柱柱柱壁壁壁壁，部部部部分分分分气气气气泡泡泡泡会会会会从从从从溶溶溶溶液液液液中中中中上上上上浮浮浮浮排排排排出出出出。出出出出口口口口处处处处的的的的小小小小气气气气泡泡泡泡易易易易停停停停留

12、留留留在在在在螺螺螺螺旋旋旋旋夹夹夹夹附附附附近近近近的的的的乳乳乳乳胶胶胶胶管管管管内内内内，要要要要想想想想法法法法排排排排尽尽尽尽，否否否否则则则则会会会会影影影影响响响响分分分分离离离离结结结结果果果果，排排排排气气气气完完完完毕毕毕毕，保留柱内保留柱内保留柱内保留柱内1 12cm2cm高水位，关紧螺旋夹。高水位，关紧螺旋夹。高水位，关紧螺旋夹。高水位，关紧螺旋夹。（4 4）标标标标记记记记高高高高度度度度：在在在在距距距距顶顶顶顶端端端端8 810cm10cm处处处处做做做做一一一一标标标标记记记记，作作作作为为为为衡衡衡衡量量量量灌灌灌灌装装装装层析介质床体高度（层析介质床体高度（

13、层析介质床体高度（层析介质床体高度（151517cm17cm）的依据。）的依据。）的依据。）的依据。第11页，此课件共23页哦操作步骤操作步骤2 2、装柱、装柱、装柱、装柱 每每每每组组组组用用用用50mL50mL烧烧烧烧杯杯杯杯取取取取溶溶溶溶胀胀胀胀的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶悬悬悬悬浆浆浆浆252530mL30mL，静静静静置置置置片片片片刻刻刻刻，观观观观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为察凝胶沉淀与水的体积之比，约为察凝胶沉淀与水的体积之比，约为察凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:11:1即可，否则应作调整。即可，否则应作调整。即可，否则应作调整。即可，否则应作调整。轻轻轻轻轻轻轻轻搅搅搅搅匀

14、匀匀匀杯杯杯杯中中中中凝凝凝凝胶胶胶胶，用用用用玻玻玻玻璃璃璃璃棒棒棒棒引引引引流流流流入入入入柱柱柱柱，打打打打开开开开出出出出水水水水口口口口，并并并并不不不不断断断断地地地地向向向向柱柱柱柱内内内内补补补补充充充充凝凝凝凝胶胶胶胶，直直直直到到到到凝凝凝凝胶胶胶胶沉沉沉沉淀淀淀淀高高高高度度度度位位位位于于于于标标标标记记记记上上上上方方方方约约约约2cm2cm为为为为止止止止，凝凝凝凝胶胶胶胶柱柱柱柱内内内内若若若若有有有有气气气气泡泡泡泡和和和和断断断断层层层层或或或或柱柱柱柱床床床床表表表表面面面面干干干干水水水水和和和和歪歪歪歪斜斜斜斜，都都都都将将将将影影影影响响响响分分分分离

15、效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。第12页，此课件共23页哦操作步骤操作步骤3 3、平衡、平衡、平衡、平衡 取取取取15mL15mL洗洗洗洗脱脱脱脱剂剂剂剂，用用用用滴滴滴滴管管管管沿沿沿沿柱柱柱柱内内内内壁壁壁壁旋旋旋旋转转转转着着着着缓缓缓缓缓缓缓缓流流流流下下下下，不不不不可可可可冲冲冲冲动动动动胶胶胶胶平平平平面面面面，打打打打开开开开出出出出水水水水口口口口，经经经经洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液的的的的流流流流动动动动，一一一一方方方方面面面面清清清清洗洗洗洗内内内内壁壁壁

16、壁，另另另另一一一一方方方方面面面面使使使使胶胶胶胶床床床床收收收收紧紧紧紧。洗洗洗洗脱脱脱脱平平平平衡衡衡衡完完完完毕毕毕毕，胶胶胶胶床床床床上上上上方方方方保保保保留留留留约约约约4cm4cm高高高高水位，关闭出水口。此时，胶床高度水位，关闭出水口。此时，胶床高度水位，关闭出水口。此时，胶床高度水位，关闭出水口。此时，胶床高度 15cm15cm为宜。为宜。为宜。为宜。4 4、准备收集、准备收集、准备收集、准备收集 取取取取6 6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），1

17、16 6编号，并在试管编号，并在试管编号，并在试管编号，并在试管2mL2mL处作一标记。处作一标记。处作一标记。处作一标记。第13页，此课件共23页哦操作步骤操作步骤5、上样与收集、上样与收集 打打开开出出口口排排水水，当当胶胶床床与与上上方方水水层层的的弯弯月月面面相相切切时时，加加入入0.6mL混混合合样样液液。上上样样完完毕毕，开开始始收收集集一一号号管管。每每管管收收集集洗洗脱液脱液2mL。当当样样液液进进入入胶胶床床，其其弯弯月月面面与与胶胶平平面面相相切切时时，暂暂停停排排液液，用用滴滴管管将将洗洗脱脱剂剂沿沿柱柱内内壁壁旋旋转转着着加加入入1cm高高水水位位，然然后后排排液液，至

18、至其其弯弯月月面与胶平面相切，再缓缓注入面与胶平面相切，再缓缓注入35cm高的洗脱剂。高的洗脱剂。6、洗脱、洗脱 不不断断向向柱柱内内加加洗洗脱脱剂剂，保保持持胶胶床床上上水水位位35cm。出出口口流流速控制在每速控制在每6秒秒1滴，直至收集到滴，直至收集到6号管达号管达2mL。第14页，此课件共23页哦操作步骤操作步骤7、鉴定、鉴定 另另取取6只只干干净净试试管管，按按收收集集顺顺序序将将洗洗脱脱液液一一分分为为二二。第第一一排排每每管管加加2滴滴BaCl2，根根据据白白色色沉沉淀淀多多少少，判判断断SO42-在在各各管管中的浓度。中的浓度。第第二二排排每每管管加加1mL考考马马斯斯亮亮蓝蓝

19、G-250试试剂剂，根根据据蓝蓝色色情情况况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若若鉴鉴定定的的第第6号号管管中中，仍仍有有样样品品，表表明明洗洗脱脱和和收收集集不不够够，需需增增加加7号、号、8号号第15页，此课件共23页哦操作步骤操作步骤 管号管号项目项目1234567891011白色沉淀量白色沉淀量+蓝色深浅蓝色深浅+8 8、再生、再生、再生、再生 鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱

20、剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。洗脱后关闭出口，以备下次使用。洗脱后关闭出口，以备下次使用。洗脱后关闭出口，以备下次使用。第16页，此课件共23页哦1 1、根根根根据据据据实实实实验验验验结结结结果果果果，在在在在同同同同一一一一坐坐坐坐标标标标系系系系中中中中，以以以以收收收收集集集集的的的的管管管管号号号号为为为为横横横横坐坐坐坐标标标标，检检检检测测测测物物物物质质质质的的的的量量量量为为为为纵纵纵纵坐坐坐坐标标标标，绘绘绘绘制制制制二二二二条条条条（蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质及及及及（NH4NH4）2 2SOSO4 4）洗脱曲线。）洗脱曲线。）洗脱曲线。）洗脱曲线。2 2、分析混合

21、样品分离效果。、分析混合样品分离效果。、分析混合样品分离效果。、分析混合样品分离效果。结果处理结果处理第17页，此课件共23页哦 检查胶平面是否水平；检查胶平面是否水平；检查胶平面是否水平；检查胶平面是否水平；加样品及洗脱液时勿冲到胶平面；加样品及洗脱液时勿冲到胶平面；加样品及洗脱液时勿冲到胶平面；加样品及洗脱液时勿冲到胶平面；控制流速；控制流速；控制流速；控制流速；注意事项注意事项第18页，此课件共23页哦思考题思考题 半透膜透析半透膜透析半透膜透析半透膜透析超滤超滤超滤超滤离子交换色谱等离子交换色谱等离子交换色谱等离子交换色谱等蛋白质脱盐的方法：蛋白质脱盐的方法：蛋白质脱盐的方法：蛋白质脱

22、盐的方法：第19页，此课件共23页哦思考题思考题 1 1、凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的选选选选择择择择：视视视视分分分分离离离离混混混混合合合合物物物物的的的的组组组组成成成成而而而而定定定定，是是是是大大大大分分分分子子子子物物物物质质质质与与与与小小小小分分分分子子子子物物物物质质质质分分分分开开开开，即即即即组组组组别别别别分分分分离离离离；还还还还是是是是相相相相对对对对分分分分子子子子质质质质量量量量比比比比较较较较接接接接近近近近的的的的物质进行分离，即分级分离。物质进行分离，即分级分离。物质进行分离，即分级分离。物质进行分离，即分级分离。选选选选择择择择凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的另另另

23、另一一一一方方方方面面面面是是是是凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的颗颗颗颗粒粒粒粒大大大大小小小小。颗颗颗颗粒粒粒粒小小小小，分分分分辨辨辨辨率率率率高高高高，但但但但流流流流速速速速慢慢慢慢，实实实实验验验验时时时时间间间间长长长长，有有有有时时时时会会会会造造造造成成成成扩扩扩扩散散散散严严严严重重重重；颗粒大，分辨率低。但条件得当，也可以得到满意的结果。颗粒大，分辨率低。但条件得当，也可以得到满意的结果。颗粒大，分辨率低。但条件得当，也可以得到满意的结果。颗粒大，分辨率低。但条件得当，也可以得到满意的结果。影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的

24、因素：第20页，此课件共23页哦思考题思考题 2 2、柱柱柱柱子子子子的的的的影影影影响响响响：柱柱柱柱的的的的长长长长短短短短粗粗粗粗细细细细对对对对层层层层析析析析效效效效果果果果都都都都会会会会产产产产生生生生影影影影响响响响。一一一一般般般般柱柱柱柱内内内内径径径径为为为为1cm1cm，如如如如果果果果样样样样品品品品较较较较多多多多，最最最最好好好好用用用用2-3cm2-3cm。直直直直径径径径太太太太小小小小时时时时会会会会发发发发生生生生“管管管管壁壁壁壁效效效效应应应应”。即即即即柱柱柱柱管管管管中中中中心心心心组组组组分分分分移移移移动动动动较较较较慢慢慢慢，管管管管壁壁壁壁

25、周周周周围围围围移移移移动动动动较较较较快快快快。进进进进行行行行脱脱脱脱盐盐盐盐时时时时，柱柱柱柱高高高高50cm50cm比比比比较较较较合合合合适适适适；分分分分级级级级分分分分离离离离时时时时，100cm100cm就足够了。就足够了。就足够了。就足够了。3 3、凝胶的装填、凝胶的装填、凝胶的装填、凝胶的装填：要均匀，不能有断路或气泡。：要均匀，不能有断路或气泡。：要均匀，不能有断路或气泡。：要均匀，不能有断路或气泡。4 4、加加加加样样样样：样样样样品品品品浓浓浓浓度度度度和和和和黏黏黏黏度度度度合合合合适适适适。一一一一般般般般样样样样品品品品所所所所用用用用体体体体积积积积为为为为柱

26、柱柱柱体体体体积的积的积的积的1-4%1-4%。影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：第21页，此课件共23页哦思考题思考题 5 5、洗洗洗洗脱脱脱脱：洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液只只只只要要要要能能能能溶溶溶溶解解解解被被被被洗洗洗洗脱脱脱脱物物物物质质质质并并并并不不不不使使使使其其其其变变变变性性性性就就就就可可可可以以以以了了了了。洗洗洗洗脱脱脱脱速速速速度度度度要要要要恒恒恒恒定定定定且且且且合合合合适适适适。一一一一般般般般来来来来讲讲讲讲，洗洗洗洗脱脱脱脱速速速速度度度度慢慢慢慢，一一一一些些些些样样样样品品品品可可可可以以以

27、以与与与与凝凝凝凝胶胶胶胶基基基基质质质质充充充充分分分分平平平平衡衡衡衡，分分分分离离离离效效效效果果果果好好好好。但但但但洗洗洗洗脱脱脱脱速速速速度度度度过过过过慢慢慢慢会会会会造造造造成成成成样样样样品品品品扩扩扩扩散散散散加加加加剧剧剧剧，区区区区带带带带变变变变宽宽宽宽，切切切切实实实实验验验验时时时时间间间间大大大大大延长。大延长。大延长。大延长。6 6、分配系数、分配系数、分配系数、分配系数KavKav ：KKd d=（Ve-VoVe-Vo）/（Vt-VoVt-Vo）影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：影响凝胶分离效果的因素：第22页，此课件共

28、23页哦相关知识相关知识VtVt：床的总体积：床的总体积：床的总体积：床的总体积=外水体积外水体积外水体积外水体积+内水体积内水体积内水体积内水体积+颗粒自身体积颗粒自身体积颗粒自身体积颗粒自身体积VeVe：洗脱体积：洗脱体积：洗脱体积：洗脱体积VoVo：外水体积：外水体积：外水体积：外水体积大大大大分分分分子子子子（大大大大于于于于孔孔孔孔径径径径上上上上限限限限）全全全全部部部部在在在在外外外外水水水水体体体体积积积积中中中中，它它它它在在在在胶胶胶胶床床床床中中中中的的的的洗洗洗洗脱脱脱脱体体体体积等于外水体积。（积等于外水体积。（积等于外水体积。（积等于外水体积。（KKd d=0=0）小小小小分分分分子子子子（小小小小于于于于孔孔孔孔径径径径下下下下限限限限）自自自自由由由由出出出出入入入入网网网网孔孔孔孔，它它它它在在在在胶胶胶胶床床床床中中中中的的的的洗洗洗洗脱脱脱脱体体体体积积积积等等等等于床体积。（于床体积。（于床体积。（于床体积。（KKd d=1=1）KKd d=（Ve-VoVe-Vo）/（Vt-VoVt-Vo）第23页，此课件共23页哦