细胞基因组的提取课件.ppt

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1、细胞基因组的提取第1页，此课件共24页哦n分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。n核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则一、实验原理一、实验原理第2页，此课件共24页哦n核酸制备时应注意的事项核酸制

2、备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过程。尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。3、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则一、实验原理一、实验原理第3页，此课件共24页哦l核酸制备的步骤：核酸制备的步骤：破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞提取提取提取提取纯化纯化纯化纯化I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核

3、酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中第4页，此课件共24页哦n核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。4、核酸制备的一般方法和原理、核酸制备的一般方法和原理一、实验原理一、实验原理第5页，此课件共24页哦l核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制

4、加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。第6页，此课件共24页哦l核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。第7页，此课件共24页哦l核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNase、DNase有一

5、定的抑制作用。如：如：SDSSDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-4-氨基水杨酸钠、萘氨基水杨酸钠、萘-1.5-1.5-二磺酸钠、三异二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠丙基萘磺酸钠第8页，此课件共24页哦l核酸制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用：蛋白质变性剂的作用：1.1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。染。2.2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制RNaseRNase活性和

6、破裂细胞的作用。活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPCDEPC第9页，此课件共24页哦l核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNaseDNase RNase RNase 蛋白酶蛋白酶K K 溶菌酶溶菌酶 第10页，此课件共24页哦l核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程1 1）破碎细胞）破碎细胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用）微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。高等植物高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。冰冻法：反复冻融

7、或液氮冻后组织捣碎。动物动物：液氮处理后用匀浆器破碎。：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器细胞器DNADNA：首先纯化细胞器。：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂第11页，此课件共24页哦l核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程2 2）破碎抽提核酸除去杂质）破碎抽提核酸除去杂质 1 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其其它成分分离它成分分离 2 2使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离 3 3除去脂类除去脂类 4 4多糖的除去多糖的除去第12页，此课件共24页哦l核酸提取的一般过程核酸提取的一般

8、过程 3 3）核酸的纯化）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。最后得到均一的核酸样品。第13页，此课件共24页哦4 4）核酸样品的保存）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质 温度温度：44（55）最佳和最简单）最佳和最简单 -70-70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20-20保存保存 保存介质保存介质：TETE缓冲溶液缓冲溶液(最常用最常

9、用)10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0第14页，此课件共24页哦实验目的第15页，此课件共24页哦材料与试剂第16页，此课件共24页哦实验操作与注意事项,1000rpm,5min离心第17页，此课件共24页哦第18页，此课件共24页哦第19页，此课件共24页哦四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项材料准备材料准备材料准备材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保存低温保存的样品材料不要反复冻融的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DN

10、ADNA时，要选时，要选择有核细胞（白细胞）择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否组培细胞培养时间不能过长，否则会造成则会造成DNADNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，含量较少，提取前先富集提取前先富集第20页，此课件共24页哦四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNADNA量少，纯量少，纯度低度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液

11、氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡第21页，此课件共24页哦四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNADNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中

12、辅以相应的去杂针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法质的方法第22页，此课件共24页哦四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分分沉淀时加入沉淀时加入1/101/10体积的体积的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M），有利于充），有利于充分沉淀分沉淀沉淀后应用沉淀后应用7070的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNADNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（

13、不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TETE缓冲液溶解缓冲液溶解TETE中的中的EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑制离子，抑制DNaseDNasepHpH值为值为8.08.0，可防止，可防止DNADNA发生酸解发生酸解第23页，此课件共24页哦1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒精在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶残留，酒精抑制后续酶解反应解反应3.3.DNADNA中残留有金属离子中残留有金属离子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除，去除蛋白、多糖、多酚等杂蛋白、多糖、多酚等杂质质2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）五、五、五、五、DNADNADNADNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原因因对对策策第24页，此课件共24页哦