细菌内毒素经典简介及检测方法课件.ppt

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1、关于细菌内毒素经典关于细菌内毒素经典简介及检测方法简介及检测方法现在学习的是第1页，共34页内内 容容v基本概念基本概念v实验方法实验方法v操作注意事项操作注意事项现在学习的是第2页，共34页一、概念及相关知识一、概念及相关知识v热原反应：病人在静脉给药热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、分钟后发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等症状。症状。v热原：任何可以导致肌体发热的物质。热原：任何可以导致肌体发热的物质。v机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。外源性外源性热原质热原质吞噬性吞噬

2、性白细胞白细胞内源性内源性热原质热原质体温调节体温调节中心中心发发 热热新蛋白新蛋白合成合成新新mRNA翻翻译译现在学习的是第3页，共34页v1942年，美国药典首次收载热原检查法，中年，美国药典首次收载热原检查法，中国药典自第一版（国药典自第一版（1953年版）起收载。年版）起收载。v所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检查。要经过热原检查。v热原检查法的局限性：热原检查法的局限性：1、重现性差。、重现性差。2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。、不同细菌产生的热

3、原质的致热域有差别。4、非定量反应。、非定量反应。v虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内毒素是最主要的热原物质。毒素是最主要的热原物质。现在学习的是第4页，共34页v细胞壁结构：细胞壁结构：肽聚糖肽聚糖 脂蛋白脂蛋白革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 外膜外膜细菌细胞壁外膜中的脂多糖（细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。当细胞）。当细胞磷壁酸磷壁酸 脂多糖脂多糖v细菌内毒素：革兰氏阴性壁外膜结构完整时细菌内毒素：革兰氏阴性壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。脱

4、落才显示出内毒素活性。v脂多糖结构：多糖脂多糖结构：多糖O抗原核心多糖抗原核心多糖类脂类脂A致热活性部分现在学习的是第5页，共34页v内毒素的量值：内毒素的量值：1 1、内毒素单位（、内毒素单位（EUEU）19821982年年FDAFDA将当时美国代号为将当时美国代号为ECEC2 2的内毒的内毒素标准品规定为素标准品规定为5EU/ng5EU/ng。19831983年内毒素单位年内毒素单位（EUEU）被）被USPUSP正式引用。正式引用。2 2、国际单位（、国际单位（IUIU）WHOWHO先后两次组织协作标定，建立内毒素先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品国际标

5、准品，其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法，且明确适用于所有内毒素检查法，且明确1IU1IU1EU1EU。现在学习的是第6页，共34页v鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。两广的沿海一带。v鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程

6、特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。敏感试剂。现在学习的是第7页，共34页现在学习的是第8页，共34页鲎试剂与内毒素反应机理鲎试剂与内毒素反应机理内毒素内毒素C因子因子活化的活化的C因子因子凝胶凝胶B因子因子凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶活化的活化的B因子因子凝固蛋白原凝固蛋白原鲎凝血系统酶联反应鲎凝血系统酶联反应现在学习的是第9页，共34页细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法 凝胶法凝胶法 浊度法浊度法 光度法光度法 显色基质法显色基质法 重现性好重现性好 能定量能定量 能控制药物的增强能控制药物的增强/抑制干

7、扰抑制干扰 操作简便。节省时间操作简便。节省时间方法方法分类分类方法方法特点特点现在学习的是第10页，共34页二、细菌内毒素检测之凝胶法二、细菌内毒素检测之凝胶法v实验程序实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品内毒素限量检查、供试品内毒素限量检查现在学习的是第11页，共34页v实验材料及用具实验材料及用具1、仪器、仪器名称要求天平感量0.1mg以下电热干燥箱300恒温水浴箱371 水银

8、或酒精温度计100 1 漩涡混合器/计时器60min1min2、器具、器具器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径1075mm）、试管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔现在学习的是第12页，共34页v试剂试剂1 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号2 2、内毒素工作标准品、内毒素工作标准品3 3、内毒素检查用水、内毒素检查用水4 4、三效热原灭火剂、三效热原灭火剂5 5、7575乙醇乙醇v常用英文缩写常用英文缩写BETBET：细菌内毒素检查：细菌内毒素检查 BETBET水水：细菌内毒

9、素检查用水：细菌内毒素检查用水 MVDMVD：供试品最大有效稀释倍数：供试品最大有效稀释倍数 NCNC：阴性对照：阴性对照MVCMVC：供试品最低有效浓度：供试品最低有效浓度 PCPC：阳性对照：阳性对照：鲎试剂灵敏度：鲎试剂灵敏度 L L：供试品细菌内毒素限值：供试品细菌内毒素限值现在学习的是第13页，共34页v灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。灵敏度复核。试验举例：内毒素工作标准品为试验举例：内毒素工作标准品为100EU/支；支；待测鲎试剂灵敏度待测鲎试剂灵敏度0.25EU/ml0.25EU/ml。1 1、制备内毒素标准

10、溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用7575酒精擦拭后启酒精擦拭后启开，加开，加1mlBET1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min15min后进行稀释，步骤如下后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入箭头下方为加入BETBET水量水量)：100EU/ml100EU/ml10EU/ml10EU/ml1EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU

11、/ml0.0625EU/ml0.0625EU/ml0.2ml0.2ml1.8ml1.8ml0.2ml0.2ml1.8ml1.8ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml现在学习的是第14页，共34页0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml水水水水溶溶解解后后的的标标准准品品水水水水水水水水100100EU/mlEU/ml1010EU/mlEU/ml1 1EU/mlEU/ml0.50.5EU/ml

12、EU/ml0.250.25EU/mlEU/ml0.1250.125EU/mlEU/ml0.06250.0625EU/mlEU/ml（2）（）（0.5）（0.25）现在学习的是第15页，共34页2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取装量，则取18支，每支，每支加入支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取，则取若干支，按标示量加入若干支，按标示量加入 BET水溶解，再取水溶解，再取0.1ml分装于标分装于标准玻璃试管（准玻璃试管（10mm75mm），将试管按如下形状排列。），将试管按如下形状排列。3、加样：每列每支加入相应

13、浓度的内毒素标准品溶液各、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入，第五列加入BET水水0.1ml。1 1222 23 30.50.54 40.250.25BETBET水水22220.50.50.50.50.250.250.250.25现在学习的是第16页，共34页v反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置轻振动混匀，置37 水浴中保温水浴中保温602min602min，将，将每管拿出缓缓倒转每管拿出缓缓倒转180180，凝胶不变形为，凝胶不变形为“”，凝胶不能保持完整为，凝胶不能保持完整为“”。当当2.02.0

14、四支管都为阳性，四支管都为阳性，0.25四支管都为阴四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度敏度c c：c clglg-1-1(X/4)(X/4)（X:X:反应终点浓度的对数值。）反应终点浓度的对数值。）当当0.5c c 2.02.0时，鲎试剂灵敏度复核合格，时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度检测时仍以标示灵敏度为准。为准。现在学习的是第17页，共34页举例：举例：设待复核的鲎试剂标示灵敏度设待复核的鲎试剂标示灵敏度为为0.125EU/ml0.125EU/ml:平行管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终点浓度CX(lg

15、C)0.250.1250.060.031+-0.06-1.222+-0.125-0.9033+-/0.125-0.9034+-/0.125-0.903clg-1(X/4)lg-1（-1.22）（）（-0.903）（）（-1.22）（）（-1.22）/4 0.104（EU/ml）cc在在0.50.52.02.0范围内，符合规定。范围内，符合规定。现在学习的是第18页，共34页v样品内毒素检查样品内毒素检查1、供试品最大有效稀释倍数的计算：、供试品最大有效稀释倍数的计算：CLCL MVD MVD ：测试用鲎试剂灵敏度标示值：测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)(EU/ml)。L L：供试品细菌内

16、毒素限值。：供试品细菌内毒素限值。C C：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。当当L L单位为单位为EU/mlEU/ml（溶液）时，（溶液）时，C C的单位为的单位为1ml/ml1ml/ml；当当L L单位为单位为EU/mgEU/mg或者或者EU/uEU/u时（抗生素原料），时（抗生素原料），C C的的单位为单位为mg/mlmg/ml或者或者u/mlu/ml。现在学习的是第19页，共34页2、供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数为、供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数为MVDMVD。含含2内毒素标准品的供试品溶液（内毒素标准品的供试品溶液（PPCP

17、PC）的制备：）的制备：3 3、加样：取鲎试剂、加样：取鲎试剂8 8支，每支加入支，每支加入BETBET水水0.1ml0.1ml溶解。溶解。2 2支为支为样品管，加入样品液样品管，加入样品液0.1ml0.1ml；2 2支加入阴性对照管，加入支加入阴性对照管，加入BETBET水水0.1ml0.1ml；2 2支为阳性对照管，加入支为阳性对照管，加入2 2 2浓度的内毒浓度的内毒素标准品溶液素标准品溶液0.1ml0.1ml；2 2支为样品阳性管，加入支为样品阳性管，加入0.1ml0.1ml含含2内毒素标准品的样品溶液。内毒素标准品的样品溶液。373711水浴中保温水浴中保温601min601min。

18、稀释稀释0.5MVD0.5MVD倍倍的供试品的供试品1.0ml1.0ml44浓度的内毒素浓度的内毒素标准品溶液标准品溶液1.0ml1.0ml混合混合含含2内毒素的内毒素的供试品溶液供试品溶液现在学习的是第20页，共34页示意图：示意图：v结果判断：结果判断：阳性对照为阳性阳性对照为阳性 阴性对照为阴性阴性对照为阴性 试验结果成立试验结果成立 样品阳性对照为阳性样品阳性对照为阳性 2支样品管均为阴性时，样品符合规定；支样品管均为阴性时，样品符合规定；2支样品管均为阳性时，样品不符合规定；支样品管均为阳性时，样品不符合规定；样品管样品管1支为阳性支为阳性1支为阴性时，需复试。支为阴性时，需复试。复

19、试时做复试时做4支样品管，有支样品管，有1支为阳性则样品不符合规定。支为阳性则样品不符合规定。样品样品阳性阳性阴性阴性样品阳性样品阳性现在学习的是第21页，共34页例：硫酸庆大霉素注射液例：硫酸庆大霉素注射液 规格：规格：4000U/ml4000U/ml内毒素限值内毒素限值L L：参考兽药典：参考兽药典“每每10001000庆大霉素单位含庆大霉素单位含内毒素的量应小于内毒素的量应小于0.5EU”0.5EU”，即，即 L L0.5EU/1000U=0.0005EU/U0.5EU/1000U=0.0005EU/U鲎试剂标示灵敏度鲎试剂标示灵敏度：0.125EU/U0.125EU/U供试品最大稀释倍

20、数供试品最大稀释倍数 CL 4000U/ml0.0005EU/UCL 4000U/ml0.0005EU/U MVD MVD 160160（倍）（倍）0.125EU/U 0.125EU/U 现在学习的是第22页，共34页供试品溶液制备：供试品溶液制备：含含2内毒素标准品的供试品溶液的制备：内毒素标准品的供试品溶液的制备：取取500U/ml500U/ml的样品溶液的样品溶液1.0ml1.0ml0.5EU/ml0.5EU/ml的内毒的内毒素标准品溶液混合。素标准品溶液混合。供试品供试品4000U/ml4000U/ml1000U/ml1000U/ml500U/ml500U/ml250U/ml250U/

21、ml0.4ml3.6ml1.0ml3.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml稀释稀释1010倍倍稀释稀释4040倍倍稀释稀释8080倍倍稀释稀释160160倍倍用量多现在学习的是第23页，共34页结果判断：结果判断：结果判断样 品 管阴性对照阳性对照样 品 阳性 对 照符合规定 不符合规定 需复试 符合规定 不符合规定 现在学习的是第24页，共34页三、操作注意事项三、操作注意事项v试验前准备：试验前准备：1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。清洗操作方便。洗净洗净 去污去内毒素去污去内毒素 去洗涤剂去洗涤剂 精洗精洗 除外源

22、性热原：除外源性热原：250250 干烤至少干烤至少1小时。小时。2、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水冲洗后冲洗后250250 干烤至少干烤至少1小时。小时。3、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。现在学习的是第25页，共34页v实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。行，保证环境温度、湿度及通风稳定。v实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用实验人员：用适宜的洗涤剂洗手

23、，用7575酒酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。精棉球消毒，戴工作帽和口罩。v实验过程：实验过程：1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。不再保存。2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振荡、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振荡器上混匀器上混匀15min15min；进一步稀释时每稀释一步均；进一步稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀应在漩涡混合器上混匀30s30s。现在学习的是第26页，共34页现在学习的是第27页，共34页振荡前振荡前振荡后振荡后内毒素分子在水溶

24、液中的状态内毒素分子在水溶液中的状态现在学习的是第28页，共34页3、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉使用。使用。4、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，避免产生气泡。避免产生气泡。5、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实验结果，故操作应尽量熟练、快速。验结果，故操作应尽量熟练、快速。6、恒温器的温度变化应、恒温器的温度变化应1，鲎试剂与样品混，鲎试剂与样品混匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在602min602min，保

25、温期间不得移动试管架，桌面保，保温期间不得移动试管架，桌面保持平稳，周围不能有振颤因素。持平稳，周围不能有振颤因素。7 7、使用的试管为、使用的试管为10mm75mm10mm75mm，1010为试管外径。为试管外径。现在学习的是第29页，共34页v结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶缓缓倒转缓缓倒转180，不从管壁脱落为阳性，不能，不从管壁脱落为阳性，不能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。v其他：试剂购买。其他：试剂购买。现在学习的是第30页，共34页现在学习的是第31页，共34页现在学习的是第32页，共34页现在学习的是第33页，共34页感谢大家观看现在学习的是第34页，共34页