荧光光谱法.ppt

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1、荧光光谱法现在学习的是第1页，共35页荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。荧光分析法的另一优点是选择性高。荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。荧光分析法也有它的不足之处。主要是指它比起其它方法来说应用范围还不够广泛。因为有许多物质本身不会产生荧光。现在学习的是第2页，共35页第一节第一节 荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。吸收与荧光密切相关，因为吸收必须先于荧光

2、发射。由于碰撞和热的耗散常使一部分吸收能丧失，剩余荧光的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长的波长发射。现在学习的是第3页，共35页一、荧光的产生一、荧光的产生 如果使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的的荧光通过单色器而照射于探测器上，移动单色器至各种不同波长并由探测器测得荧光强度，然后以荧光强度对照着荧光波长所绘成的曲线称为该荧光物质的荧光发射光谱荧光发射光谱，简称荧光光谱。荧光光谱表示在该物质所产生的荧光中各种不同波长组分的比较强度。现在学习的是第4页，共35页吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图现在学习的是第5页，共35页大多数的分子在吸收了光而被

3、激发至第一或以上的电子激发态的各个振动能级之后，通常急剧降落至第一电子激发态的最低振动能级，在达一过程中它们和同类分子或其它分子碰撞而消耗了相当于这些能级之间的能量，因而不发出光，即无辐射跃迁。由第一电子激发态的最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同振动能级时，则以光的形式发出，所产生的光即是荧光现在学习的是第6页，共35页荧光光谱和吸收光谱的荧光光谱和吸收光谱的“镜象对称镜象对称”关系关系蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）现在学习的是第7页，共35页现在学习的是第8页，共35页从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成从图可看出激发光谱同荧光光

4、谱大致成镜相对称镜相对称a.a.荧光光谱荧光光谱(发射光谱）形状与基态发射光谱）形状与基态S S0 0振能级振能级的分布情况（即能量间隔情况）有关的分布情况（即能量间隔情况）有关b.b.激发光谱激发光谱(吸收谱吸收谱)形状与激发态形状与激发态S S1 1振动能振动能级的分布有关级的分布有关c.c.S S0 0、S S1 1态态中中振振动动能能级级的的分分布布是是相相似似的的(说说明明峰形状相峰形状相 似）似）现在学习的是第9页，共35页d.d.根据根据FrankcondonFrankcondon原理，电子跃迁过程中核原理，电子跃迁过程中核的相对位置不变（近似的），若吸收光谱中的相对位置不变（近

5、似的），若吸收光谱中某一振动带的跃迁几率最大，则在荧光发射某一振动带的跃迁几率最大，则在荧光发射光谱中，其相反跃迁的几率也应最大光谱中，其相反跃迁的几率也应最大(说明说明高峰对高峰，低峰对低峰）非镜像对称的峰高峰对高峰，低峰对低峰）非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存在。出现，则表示有散射光或杂质存在。现在学习的是第10页，共35页二、产生荧光的过程和条件二、产生荧光的过程和条件 荧光物质产生荧光的过程可以分为这样四个步骤：1、处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；2、被激发到第一电子激发态的各个振

6、动能级的分子，通过无辐射跃迅降落到第一电子激发态的最低振动能级；现在学习的是第11页，共35页 3、降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；4、到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级。现在学习的是第12页，共35页分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：第一个必要条件是：该物质的分子必须具有与所照射的光线相同的频率，这与分子的结构密切有关。产生荧光的第二个必要条件是：吸收了与其本身特征频率相同的能量之后的分子，必须具有高的荧光效率。现在学习的是第13页，共35页强荧

7、光物质的结构特征强荧光物质的结构特征分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光或磷分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光或磷光也愈强。能强烈发光的分子几乎都是通过吸光也愈强。能强烈发光的分子几乎都是通过吸收收*跃迁而到达电子激发态的。因此，只跃迁而到达电子激发态的。因此，只有那些具有共轭双键，尤其是具有刚性、平面和有那些具有共轭双键，尤其是具有刚性、平面和多环结构的分子有利于发光。多环结构的分子有利于发光。现在学习的是第14页，共35页第二节第二节 荧光效率及影响因素荧光效率及影响因素一、荧光效率一、荧光效率表示物质发射荧光的能力表示物质发射荧光的能力 =发射荧光分子数发射荧光分子数/激发分子总数激发

8、分子总数或或 =发射荧光量子数发射荧光量子数/吸收光量子数吸收光量子数 现在学习的是第15页，共35页K Kc c、k kc c和和k kx x：非辐射去能量非辐射去能量过程的速度常数；过程的速度常数；k kf f和和k kp p依依次表示荧光和磷光过程速次表示荧光和磷光过程速度常数；凡是能使度常数；凡是能使k kf f 值升值升高而使其它高而使其它k ki i值降低的因素，值降低的因素，都可增强荧光。都可增强荧光。现在学习的是第16页，共35页荧光过程的量子效率荧光过程的量子效率f f:如如 k kf fkkc c和和k kx x，f f11。如如 k kc c或或k kx xkkf f，则

9、，则f f 0 0。k kf f,k kp p-决决定定于于分分子子结结构构;k;kx x-决决定定于于分分子子结结构构，受受环环境有一定影响境有一定影响 K Kc c，k kc c，-受环境影响强烈，而受分子结构影响较小受环境影响强烈，而受分子结构影响较小现在学习的是第17页，共35页k kf f_ _强强荧荧光光物物质质（k kf f值值大大）特特征征：有有大大的的共共轭轭双双键键、刚刚性性平平面面多多环环结结构构、最最低低单单重重激激发发态态S1S1，取取代代基基为为给给电电子子基基。这这均均由由分分子子的的性性质质和和结结构决定，即内因。构决定，即内因。k kf f是是S S*S S电

10、子跃迁几率的量度。这意味着影响分电子跃迁几率的量度。这意味着影响分子吸收带强度的因素也将影响子吸收带强度的因素也将影响k kf f，因此吸收带，因此吸收带的的最大最大能作能作k kf f的定性量度。当的定性量度。当最大最大降低时可降低时可看到看到k kf f相应地降低。相应地降低。现在学习的是第18页，共35页二、荧光猝灭二、荧光猝灭广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子产率降低的作用。产率降低的作用。狭义

11、的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分狭义的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。化学作用过程。荧荧光光猝猝灭灭剂剂：与与荧荧光光物物质质分分子子发发生生相相互互作作用用而而引起荧光强度下降的物质。引起荧光强度下降的物质。现在学习的是第19页，共35页1.1.动态猝灭动态猝灭 猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生的相互作用过程的相互作用过程(能量转移过程等），可生成瞬能量转移过程等），可生成瞬时激发态复合物（不发射荧光，或荧光的发射时激发态复合物（不发射荧光，或荧光的发射特性与原

12、先的荧光物质不同），从而引起荧光特性与原先的荧光物质不同），从而引起荧光猝灭现象。动态猝灭的效率受荧光物质激发态猝灭现象。动态猝灭的效率受荧光物质激发态分子的寿命和猝灭剂的浓度限制。分子的寿命和猝灭剂的浓度限制。1-1-萘胺的荧萘胺的荧光在碱性溶液中发生猝灭现象，但它的吸收光光在碱性溶液中发生猝灭现象，但它的吸收光谱并无变化，这是动态猝灭的一个例子。谱并无变化，这是动态猝灭的一个例子。现在学习的是第20页，共35页2.2.静态猝灭静态猝灭 猝灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合猝灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应，降低了荧光物质的荧光强度。动态猝灭反应，降低了荧光物质的荧光强度。动态猝灭中的

13、荧光量子产率由光反应动力学控制，静态中的荧光量子产率由光反应动力学控制，静态猝灭中的荧光量子产率只受基态的配位作用的猝灭中的荧光量子产率只受基态的配位作用的热力学所控制热力学所控制。现在学习的是第21页，共35页3.3.猝灭剂猝灭剂 氧能使多数荧光物质产生不同程度的荧氧能使多数荧光物质产生不同程度的荧光猝灭现象。胺类是大多数未取代的芳烃的光猝灭现象。胺类是大多数未取代的芳烃的有效猝灭剂。有效猝灭剂。卤素化合物、重金属离子以及硝基化合卤素化合物、重金属离子以及硝基化合物等，也是常见的猝灭剂。卤素离子对奎宁物等，也是常见的猝灭剂。卤素离子对奎宁有显著的猝灭作用。但对某些物质却无猝灭有显著的猝灭作用

14、。但对某些物质却无猝灭作用。作用。这表明猝灭剂和荧光物质分子之间的这表明猝灭剂和荧光物质分子之间的相互作用是有一定选择性的。相互作用是有一定选择性的。现在学习的是第22页，共35页4 4.自猝灭自猝灭 当荧光物质浓度超过当荧光物质浓度超过1 1g/Lg/L时，常发生荧光时，常发生荧光的自猝灭（浓度猝灭）现象。可能的原因：的自猝灭（浓度猝灭）现象。可能的原因：a.a.荧荧光光辐辐射射的的自自吸吸收收，这这在在荧荧光光物物质质的的吸吸收收光光谱和发射光谱有较大重叠时较严重。谱和发射光谱有较大重叠时较严重。b.b.荧荧光光物物质质的的激激发发态态分分子子M M*与与基基态态分分子子M M形形成成激激

15、发态的二聚体（发态的二聚体（M M*M M）。）。c.c.基基态态的的荧荧光光物物质质分分子子的的缔缔合合。荧荧光光自自猝猝灭灭是是与与浓浓度度有有关关的的效效应应，因因而而通通过过在在荧荧光光测测定定前前稀稀释释溶溶液液的的办办法法，可可避避免免这这一一现现象象的的发生，或减小它所产生的影响。发生，或减小它所产生的影响。现在学习的是第23页，共35页三、发光强度同浓度的关系三、发光强度同浓度的关系荧光强度荧光强度I If f正比于吸收的光量正比于吸收的光量I Ia a与荧光量子产与荧光量子产率率 。I If f =I Ia a据据BeerBeer定律：定律：I Ia a=I=I0 0-I-I

16、t t=I=I0 0(1-e(1-e-l C l C)代入上式得：代入上式得：I If f=I I0 0(1-10(1-10-l c l c)=I I0 0(1-e(1-e-2.3-2.3 l c l c)整理得：整理得：I If f =2.3=2.3 I I0 0 lclc在一定条件下：在一定条件下：I If f =K=K c c 荧光强度与荧光物质的浓度成之正比荧光强度与荧光物质的浓度成之正比现在学习的是第24页，共35页高浓度偏离线性关系的因素：高浓度偏离线性关系的因素：a.a.当当浓浓度度较较浓浓，不不满满足足abcabc0.050.05，公公式式近近似似处处理理误误差差大大。（如如果

17、果a=10a=104 4 b=1.0 b=1.0 代代入入abcabc0.05 0.05 得得c=5.010c=5.010-6-6mol/L)mol/L)b.b.自自熄熄灭灭（Self-quenchingSelf-quenching）由由荧荧光光分分子子间间以以及及荧荧光光分分子子同同溶溶剂剂分分子子间间的的碰碰撞撞产产生生的的。c c ，自自熄熄灭灭。c.c.自自吸吸收收（Self-absorptionSelf-absorption）发发生生在在荧荧光光发发射射波波长长同同化化合合物物的的吸吸收收峰峰重重迭迭的的情情况况下下，当当荧荧光光通通过溶液时便被吸收一部分。过溶液时便被吸收一部分。现

18、在学习的是第25页，共35页第三节第三节 荧光的测量荧光的测量一、荧光分光光度计一、荧光分光光度计现在学习的是第26页，共35页激发光源激发光源 作用：提供连续辐射，激发样品作用：提供连续辐射，激发样品 要求：光源（要求：光源（I I0 0）强度足够；强度与波长无关强度足够；强度与波长无关 种类：种类：汞弧灯、氢灯或氙灯。汞弧灯、氢灯或氙灯。激发单色器激发单色器-作用：用于选择激发光的波长作用：用于选择激发光的波长现在学习的是第27页，共35页样品池样品池 用用石石英英制制成成，形形状状:正正方方形形、长长方方形形、圆圆形形的的。低低温温测测定定时时在在石石英英液液槽槽外外套套一一个个盛盛放放

19、液液氮氮的的透透明石英真空瓶。明石英真空瓶。发射单色器发射单色器用于选择投射到检测器的荧光波长。用于选择投射到检测器的荧光波长。检测器检测器荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。现在学习的是第28页，共35页现在学习的是第29页，共35页二、二、荧光分析方法荧光分析方法1 1 标准曲线法标准曲线法 用用已已知知的的标标准准物物质质经经过过和和试试样样同同样样的的处处理理后后，配配成成一一系系列列标标液液。测测定定标标液液的的荧荧光光强强度度，用用荧荧光光强强度度对对标标液液浓浓度度绘绘制制标标准准曲曲线线，然然后后根根据据试试液液的的荧荧光光强强度

20、度，在在标标准准曲曲线线上上求求出出试试样样中中荧荧光光物质的含量。物质的含量。现在学习的是第30页，共35页2 2荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多，更适合于低浓度物比吸光法高得多，更适合于低浓度物质的分子。质的分子。这两种方法在灵敏度方面的差别主要是这两种方法在灵敏度方面的差别主要是由于同浓度相关的参数的测量方式不同。由于同浓度相关的参数的测量方式不同。在光度计中，同浓度相关的参数在光度计中，同浓度相关的参数A A是是I I0 0 、I I比的对数。在测低浓度液时，检测器必须比的对数。在测低浓度液时，检测器必须能区分能区分I I、I I0 0讯号的微小差别，故在低讯号的微

21、小差别，故在低A A时时测量的精确度迅速降低。测量的精确度迅速降低。现在学习的是第31页，共35页 而荧光强度而荧光强度F F（或磷光强度或磷光强度P P）直接同荧直接同荧光（磷光）物质的浓度成正比。光（磷光）物质的浓度成正比。同浓度相关同浓度相关的参数是在很小噪声背景上的荧光（磷光）的参数是在很小噪声背景上的荧光（磷光）发射讯号本身，可用增强入射光强度发射讯号本身，可用增强入射光强度I I0 0或增或增大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度。而在大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度。而在光度法中光度法中,若检测器放大倍数若检测器放大倍数 ，I I0 0及及I I同同时时，A A值不变。值不变。故荧光法

22、灵敏度常比相应光度法高故荧光法灵敏度常比相应光度法高2-42-4个个数量级。数量级。现在学习的是第32页，共35页在光度法中，在光度法中，表示方法的灵敏度。表示方法的灵敏度。，其测定灵敏度其测定灵敏度。在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的及及发射时的量子效率发射时的量子效率有关。荧光法绝对灵敏有关。荧光法绝对灵敏度理论定义为度理论定义为的乘积（的乘积（单位单位gg cmcm-2-2）,，荧光强度，荧光强度，测定灵敏度，测定灵敏度。荧。荧光法绝对灵敏度实际定义为光法绝对灵敏度实际定义为/H/H（H H发射发射光谱半峰宽度光谱半峰宽度mm-1-1）。现在学习的是第3

23、3页，共35页 一一般般情情况况下下，多多采采用用相相对对灵灵敏敏度度来来表表示示。相相对对灵灵敏敏度度是是以以喹喹啉啉硫硫酸酸氢氢盐盐的的0.050.05mol/Lmol/L硫硫酸酸溶溶液液为为标标准准，并并定定为为1 1，然然后后与与相相同同浓浓度度荧荧光光物物质质的的荧荧光光强强度度比比较较，可可求求该该物物质质的的相相对对灵敏度。灵敏度。现在学习的是第34页，共35页3.3.荧光分析法的选择性荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中很多分子在紫外可见区有吸收，但其中只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法固有干扰很少，选择性较好。固有干扰很少，选择性较好。现在学习的是第35页，共35页