色谱分析第五章 (2).ppt

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1、色谱分析第五章1现在学习的是第1页，共25页 离子对色谱离子对色谱1.原理和分离对象原理和分离对象 将将一一种种或或者者多多种种与与组组分分离离子子电电荷荷相相反反的的离离子子(称称为为配配对对离离子子或或反反离离子子、平平衡衡离离子子)加加到到流流动动相相中中,使使其其与与组组分分离离子子结结合合成成极极性弱的性弱的离子对离子对:样品样品+配对离子配对离子 样品样品+-配对离子配对离子离子对离子对样品样品 配对离子配对离子+样品样品-配对离子配对离子+离子对离子对离子对在含水相中不易离解离子对在含水相中不易离解,迅速转移到有机固定相中迅速转移到有机固定相中:（有机相为固定相时有机相为固定相时

2、-称为称为反相离子对色谱反相离子对色谱有机相为流动相时有机相为流动相时-称为称为正相离子对色谱正相离子对色谱）2现在学习的是第2页，共25页 A+水相水相B水相水相 (A+,B-)有机相有机相平衡常数称为提取常数平衡常数称为提取常数,用用E E 表示表示在一定的流动相的在一定的流动相的pH 值、值、离子强度离子强度、流动相中、流动相中有机改有机改善剂的类型和浓度善剂的类型和浓度、以及一定的、以及一定的操作温度操作温度下下,对各个离子对各个离子对色谱体系对色谱体系EA,B 均为常数均为常数.3现在学习的是第3页，共25页反相离子对色谱反相离子对色谱中：中：A A+的分配系数为的分配系数为分配比分

3、配比(容量因子容量因子)为为反相离子对色谱的分配比反相离子对色谱的分配比k与配对离子的浓度成正比与配对离子的浓度成正比,调整调整配对离子的浓度可以控制被分离组分的保留值配对离子的浓度可以控制被分离组分的保留值4现在学习的是第4页，共25页正相离子对色谱正相离子对色谱中中,A+的分配系数和分配比的分配系数和分配比(容量因子容量因子)分分别为别为 k与配对离子的浓度成反比与配对离子的浓度成反比,增加配对离子的浓度增加配对离子的浓度,组组分的保留值减小分的保留值减小.5现在学习的是第5页，共25页离子对色谱法的分离对象离子对色谱法的分离对象:极性化合物极性化合物(碱、碱、酸类酸类)、离子、带有可离解

4、的多官能团化合物等。、离子、带有可离解的多官能团化合物等。例如，羟基或氨基的磺酸盐例如，羟基或氨基的磺酸盐,用其它方法很难用其它方法很难获得满意的分离效果；洗涤剂中表面活性剂；获得满意的分离效果；洗涤剂中表面活性剂；生理体液分析：甾族化合物和中药等。生理体液分析：甾族化合物和中药等。6现在学习的是第6页，共25页2.离子对色谱法的主要类型离子对色谱法的主要类型正相离子对分配色谱法正相离子对分配色谱法流动相为有机相，固定相为吸有配对离子缓冲流动相为有机相，固定相为吸有配对离子缓冲(水水)溶液的多溶液的多孔硅胶或纤维素孔硅胶或纤维素.(2)反相离子对分配色谱法反相离子对分配色谱法 化学键合反相色谱

5、固定相都可以作为反相离子对分化学键合反相色谱固定相都可以作为反相离子对分配色谱的载体。配色谱的载体。C C1818是用得最多的一种载体，戊醇作固定相是用得最多的一种载体，戊醇作固定相就是获得应用的最早的例子之一就是获得应用的最早的例子之一.7现在学习的是第7页，共25页键合相反相离子对色谱法键合相反相离子对色谱法直直接接用用非非极极性性的的化化学学键键合合相相(例例如如,C8、C18等等)作作为为离离子子对对色色谱谱的的固固定定相相，配配对对离离子子直直接接加加到到流流动动相相中中，大大大大简简化了离子对色谱的操作。化了离子对色谱的操作。当当分分离离酸酸时时,把把有有机机碱碱配配对对离离子子(

6、如如磷磷酸酸四四丁丁胺胺)加加入入到到流流动动相中；相中；分离分离碱碱时，加入有机酸配对离子时，加入有机酸配对离子(如如辛基磺酸盐辛基磺酸盐)。8现在学习的是第8页，共25页3.影响离子对色谱分离因素影响离子对色谱分离因素一一反相离子对色谱分离的影响因素反相离子对色谱分离的影响因素（1 1）平衡离子）平衡离子平衡离子的种类和浓度影响流动相的溶剂强度，平衡离子的种类和浓度影响流动相的溶剂强度，(k)与一价平衡离子的浓度成正比，与一价平衡离子的浓度成正比，(k)随随着着平平衡衡离离子子的的疏疏水水性性增增加加(极极性性减减小小)而而增增加加;(例例如如平衡离子同系物每增加一个次甲基，平衡离子同系物

7、每增加一个次甲基，k增加增加2.5倍倍)9现在学习的是第9页，共25页平平衡衡离离子子的的结结构构不不同同，形形成成的的离离子子对对性性质质有有极极大大差差异异，提取常数提取常数E的差别可能达到的差别可能达到1010（最终反映在（最终反映在k上）上）.平平衡衡离离子子应应有有足足够够的的溶溶解解度度，溶溶解解度度太太小小，会会在在色色谱谱体系内产生沉淀，管道堵塞。体系内产生沉淀，管道堵塞。因此选择合适的平衡离子最重要。因此选择合适的平衡离子最重要。（2 2）溶剂强度和选择性）溶剂强度和选择性流流动动相相中中有有机机溶溶剂剂（甲甲醇醇、乙乙腈腈等等）增增加加(疏疏水水性性增增加加)，溶溶剂强度增

8、大，剂强度增大，k 减小。减小。10现在学习的是第10页，共25页（3 3）pHpH值的影响值的影响组组分分离离子子、平平衡衡离离子子、离离子子对对的的形形成成都都与与pH有有关关。流流动动相相的的pH值值应应能能使使不不同同组组分分有有各各自自合合适适的的离离解解度度，同同时时提提供供平平衡衡离离子子的的物物质质能能完完全离解全离解。因因此此，提提供供平平衡衡离离子子的的化化合合物物最最好好是是强强酸酸盐盐（烷烷基基磺磺酸酸盐盐）或或强强碱碱盐盐（季季铵铵盐盐）。因因为为这这些些盐盐在在较较宽宽的的pH范范围围内内保保持持完完全全离离解解。从从而而可可以以选选择择有有利利于于组组分分电电离离

9、的的pH条件。条件。pHkmax241011现在学习的是第11页，共25页和和离离子子交交换换色色谱谱类类似似：在在中中等等pH范范围围内内，组组分分具具有有最最大大的的k。当当pH降降低低时时，阴阴离离子子开开始始形形成成酸酸分分子子，进进入入固固定定相相的离子对减少，的离子对减少，k减小。减小。当当pH较较高高时时，OH-离离子子很很多多，它它们们与与组组分分离离子子争争夺夺平平衡离子形成离子对，使组分形成离子对减少，衡离子形成离子对，使组分形成离子对减少，k减小。减小。如如用用弱弱碱碱盐盐提提供供平平衡衡离离子子，随随着着流流动动相相pH增增加加，离离解解度度下下降降，提提供供平平衡衡离

10、离子子的的数数目目减减少少，生生成成离离子子对对数数目目减减少少，k下下降降。（因此，弱碱盐提供平衡离子时，有效的（因此，弱碱盐提供平衡离子时，有效的pH范围缩小）范围缩小）12现在学习的是第12页，共25页（4）离子强度的影响）离子强度的影响除除平平衡衡离离子子外外，若若流流动动相相中中还还存存在在其其它它辅辅助助离离子子，使使离离子子强强度度增增加加，组组分分k下下降降。（离离子子强度增加一倍，强度增加一倍，k减小减小2-3倍）：倍）：若若共共存存离离子子与与组组分分离离子子具具有有相相同同电电荷荷，则则会会与组分离子争夺平衡离子与组分离子争夺平衡离子若若共共存存离离子子与与平平衡衡离离子

11、子具具有有相相同同电电荷荷，则则会会与平衡离子争夺组分离子与平衡离子争夺组分离子这两种情况都会使组分形成的离子对减少这两种情况都会使组分形成的离子对减少k下降下降。13现在学习的是第13页，共25页二、正相离子对色谱分离的影响因素二、正相离子对色谱分离的影响因素（1 1）平衡离子）平衡离子平衡离子存在于固定相中，只有重平衡离子存在于固定相中，只有重新制备色谱柱才能改变平衡离子的浓度新制备色谱柱才能改变平衡离子的浓度（2 2）溶剂强度和选择性）溶剂强度和选择性改改变变溶溶剂剂强强度度和和选选择择性性的的一一般般原原则则与与反反相相离离子子对色谱相同对色谱相同14现在学习的是第14页，共25页（3

12、 3）pHpH值的影响值的影响与与反反相相离离子子对对色色谱谱相相反反，在在较较低低或或较较高高的的pH下下，k很很大大强强烈烈保保留留在在固固定定相相内内，在在中中等等pH下下，组组分分的的k有有最最小小值值。pHkmin241015现在学习的是第15页，共25页（4 4）离子强度的影响）离子强度的影响流流动动相相离离子子强强度度增增加加，共共存存离离子子妨妨碍碍组组分分形形成成离离子子对对，不不容容易进入有机流动相，易进入有机流动相，k增加增加。三、离子对色谱峰拖尾的现象三、离子对色谱峰拖尾的现象除除了了固固定定相相表表面面存存在在残残余余活活性性中中心心外外，离离子子对对在在有有机机相相

13、中中离离解解，缓缓冲冲溶溶液液不不当当，也也会会引引起起拖拖尾尾。可可考考虑虑改改变变平平衡衡离离子子品品种种、浓浓度度、缓缓冲冲溶溶液的液的pHpH值等来改善分离效果。值等来改善分离效果。16现在学习的是第16页，共25页 排阻色谱法排阻色谱法1.原理和分离对象原理和分离对象用于分离有分子量分布的用于分离有分子量分布的大分子混合物大分子混合物柱内总死体积柱内总死体积Vm=V0+Vp样品分子按大小筛分样品分子按大小筛分,大小是指分子在流动相中的液相半径大小是指分子在流动相中的液相半径.固定相颗粒微孔中固定相颗粒微孔中含有含有“孔容流动相孔容流动相”体积为体积为Vp空隙空隙-含有含有流动相体积流

14、动相体积为为V017现在学习的是第17页，共25页用色谱基本理论来讨论排阻色谱过程用色谱基本理论来讨论排阻色谱过程色谱基本保留方程色谱基本保留方程：VR=Vm(1+k)=Vm(1+K/)=Vm +KVS非滞留组分的保留值非滞留组分的保留值=空隙流动相的保留值空隙流动相的保留值=V0固定相体积固定相体积=孔孔容容VP当组分分子全部不能进入固定相颗粒孔容内时当组分分子全部不能进入固定相颗粒孔容内时,VR=V0,K=0当组分分子全部都可进入固定相颗粒孔容内时当组分分子全部都可进入固定相颗粒孔容内时,VR=Vm,K=118现在学习的是第18页，共25页因此排阻色谱排阻色谱：0 =K=1：组分流出色谱柱

15、的组分流出色谱柱的 tR=流动相流动相 tm 保留体积保留体积VR=Vm色谱柱死体积色谱柱死体积=V0+VP=F tm K=0：组分流出色谱柱的组分流出色谱柱的 tR=空隙流动相流出时间空隙流动相流出时间 t0 0 ：tR=空隙流动相流出时间空隙流动相流出时间t0+因有部分分子进入孔容中因有部分分子进入孔容中被滞留的平均时间被滞留的平均时间K tp19现在学习的是第19页，共25页响应响应tmtR进进样样tmt0tP 保留值保留值（时间或流动相体积）排阻色谱图排阻色谱图普通色谱图20现在学习的是第20页，共25页2.排阻色谱分离特性排阻色谱分离特性(选择性选择性-相对保留值相对保留值 r)组组

16、分分与与固固定定相相没没有有相相互互作作用用,流流动动相相只只起起样样品品运运载载作作用用.其其它它色谱柱改善选择性的办法不能用于排阻色谱法色谱柱改善选择性的办法不能用于排阻色谱法.排排阻阻色色谱谱法法的的选选择择性性,只只能能依依靠靠选选择择合合适适孔孔隙隙大大小小和和孔孔径径分分布布的的固固定定相相来来实实现现.即即按按照照被被分分离离物物质质的的分分子子量量范范围围选选择择凝凝胶胶.当当被被分分离离化化合合物物保保留留体体积积处处于于给给出出的的固固定定相相分分离离范范围围中中段段时时分分离效果最好离效果最好.考考虑虑流流动动相相的的组组成成(pH(pH、离离子子强强度度等等),),是是

17、为为了了消消除除组组分分与与固固定定相相之之间间可可能能产产生生的的任任何何作作用用力力(如如离离子子交交换换、离离子子排排除除作作用用、吸吸附附、氢氢键键力力).有有低低的的粘粘度度（改改善善传传质质、和和对对样样品品的的溶溶解解能能力力）.对对排排阻阻分离效果没有影响分离效果没有影响.21现在学习的是第21页，共25页排阻色谱的特点排阻色谱的特点:保留值很小保留值很小,峰形都比较好峰形都比较好:峰宽比较窄峰宽比较窄;不同的不同的峰有大致相同的峰宽峰有大致相同的峰宽,较大的峰高较大的峰高,可以用示差可以用示差折光检测器进行测定折光检测器进行测定.所有的所有的组分全部在短时组分全部在短时间内洗

18、脱间内洗脱,不需要梯度淋洗不需要梯度淋洗.固定相和流动相的固定相和流动相的选择相对简单选择相对简单.分子量校正曲线分子量校正曲线 组分的分子量的对数与保留体积作图组分的分子量的对数与保留体积作图,就是排就是排阻色谱的校正曲线阻色谱的校正曲线,也称分子量校正曲线也称分子量校正曲线.22现在学习的是第22页，共25页kk”1VmV0VPlgMVR 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1.0.0.5 0 0 0.5 1.0 1.5 0 0.5 K=1.0排阻色谱的分子排阻色谱的分子量校正曲线量校正曲线23现在学习的是第23页，共25页用排阻色谱法测定分子量时，对分子量的标定用排阻色谱法测定分子量

19、时，对分子量的标定排阻色谱法测定分子量都需要进行标定排阻色谱法测定分子量都需要进行标定分子量的标定一般采用系列分子量的标定一般采用系列聚苯乙烯聚苯乙烯或不同亲水取代基的或不同亲水取代基的标准分子量化合物。原则上，标准物质的分子量应与需标定的标准分子量化合物。原则上，标准物质的分子量应与需标定的样品分子量相近，而且最宜使用的流动相溶剂种类、浓度、样样品分子量相近，而且最宜使用的流动相溶剂种类、浓度、样品的疏水性、卷曲程度等都应类似。否则会产生较大的误差。品的疏水性、卷曲程度等都应类似。否则会产生较大的误差。24现在学习的是第24页，共25页3.固定相选择固定相选择排排阻阻色色谱谱对对固固定定相相

20、的的要要求求是是:孔孔径径要要有有确确定定的的范范围围,能能承承受受高高压压,能被流动相浸润能被流动相浸润,残余的吸附活性中心极残余的吸附活性中心极少少.由由于于排排阻阻色色谱谱主主要要是是分分离离大大分分子子组组分分,大大分分子子的的扩扩散散系系数数小小,固固定定相相的的粒粒度度d dP P的的影影响响比比其其它它色色谱谱法法要要大大得得多多(理理论论塔塔板板高高度度H H 是是d dP P2 2 的的函函数数),),最最好好选选择择颗颗粒粒度度小小的的全全多多孔孔形形微微粒粒固固定相定相.排阻色谱固定相有排阻色谱固定相有:凝胶、半硬有机胶和硬质材料凝胶、半硬有机胶和硬质材料.25现在学习的是第25页，共25页