色谱法分离原理讲稿.ppt
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1、关于色谱法分离原理1第一页,讲稿共一百六十三页哦 色谱法早在色谱法早在19031903年由俄国植物学家年由俄国植物学家茨维特茨维特分分离植物色素时采用。离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时,将植他在研究植物叶的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果结果色素中各组分互相分离形成各种不同色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带颜色的谱带。这种方法因此得名为。这种方法因此得名为色谱法色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,以后此法逐渐应用于无色物质的分离,“色色谱
2、谱”二字虽已失去原来的含义,但仍被人们二字虽已失去原来的含义,但仍被人们沿用至今。沿用至今。第二页,讲稿共一百六十三页哦ts第三页,讲稿共一百六十三页哦1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论;1952 James和Martin发展了气相色谱;1956 Van Deemter提出速率理论;1967 Kirkland等研制高效液相色谱法;80年代以后年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。谱等一系列新的色谱分析方法。第四页,讲稿共一百六十三页哦 n在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相(
3、固体或液体)称为内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相固定相 ;n自上而下运动的一相(一般是气体或自上而下运动的一相(一般是气体或液体)称为液体)称为流动相流动相 ;n装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)称为称为色谱柱色谱柱 。第五页,讲稿共一百六十三页哦n当流动相中样品混合物经过固定相时,当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,互作用的类型、强弱也有差异,因此因此在同一推动力的作用下,不同组分在固在同一推动
4、力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。同的次序从固定相中流出。第六页,讲稿共一百六十三页哦从不同角度,可将色谱法分类如下:从不同角度,可将色谱法分类如下:1.按两相状态分类按两相状态分类n气气体体为为流流动动相相的的色色谱谱称称为为气气相相色色谱谱(GC)根根据据固固定定相相是是固固体体吸吸附附剂剂还还是是固固定定液液(附附着着在在惰惰性性载载体体上上的的一一薄薄层层有有机机化化合合物物液液体体),又又可可分分为为气气固固色色谱谱(GSCGSC)和和气气液液色色谱谱(GLCGLC)。第七页,讲稿共一百六十三页哦液体为
5、流动相的色谱称液体为流动相的色谱称液相色谱(液相色谱(LCLC)同理液相色谱亦可分为同理液相色谱亦可分为液固色谱(液固色谱(LSCLSC)和和液液色谱(液液色谱(LLCLLC)。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色超临界流体色谱(谱(SFCSFC)。随着色谱工作的发展,通过化学反应将固定随着色谱工作的发展,通过化学反应将固定液键合到载体表面,这种化学键合固定相的液键合到载体表面,这种化学键合固定相的色谱又称色谱又称化学键合相色谱(化学键合相色谱(CBPCCBPC)。第八页,讲稿共一百六十三页哦2.2.按分离机理分类按分离机理分类n利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附利
6、用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法,称为能力强弱不同而得以分离的方法,称为吸附色谱法吸附色谱法。n利用组分在固定液(固定相)中溶解度利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法称为不同而达到分离的方法称为分配色谱法分配色谱法。n利用组分在离子交换剂(固定相)上的利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法,称亲和力大小不同而达到分离的方法,称为为离子交换色谱法离子交换色谱法。第九页,讲稿共一百六十三页哦利用大小不同的分子在多孔固定相中的选利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法,称为择渗透而达到分离的方法,称为凝胶色谱凝
7、胶色谱法或尺寸排阻色谱法。法或尺寸排阻色谱法。最近,又有一种新分离技术,利用不同组最近,又有一种新分离技术,利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分离的技术称为和力进行分离的技术称为亲和色谱法亲和色谱法,常,常用于蛋白质的分离。用于蛋白质的分离。第十页,讲稿共一百六十三页哦3.3.按固定相的外型分类按固定相的外型分类n固定相装于柱内的色谱法,称为固定相装于柱内的色谱法,称为柱色谱柱色谱。n固固定定相相呈呈平平板板状状的的色色谱谱,称称为为平平板板色色谱谱,它又可分为它又可分为薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱。第十一页,讲稿共一百六十三页哦4.
8、4.按照展开程序分类按照展开程序分类 按按照照展展开开程程序序的的不不同同,可可将将色色谱谱法法分分为为洗洗脱法脱法、顶替法顶替法、和迎头法和迎头法。n 洗脱法也称冲洗法洗脱法也称冲洗法。工作时,首先将样品。工作时,首先将样品加到色谱柱头上,加到色谱柱头上,然后用吸附或溶解能力比试然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同,被冲洗剂分在固定相上的吸附或溶解能力不同,被冲洗剂带出的先后次序也不同,从而使组分彼此分离。带出的先后次序也不同,从而使组分彼此分离。流出曲线下图流出曲线下图第十二页,讲稿共一
9、百六十三页哦AB 这种方法能使样品的各组分获得良好的分这种方法能使样品的各组分获得良好的分离,色谱峰清晰。此外,除去冲洗剂后,可获离,色谱峰清晰。此外,除去冲洗剂后,可获得纯度较高的物质。目前,这种方法是色谱法得纯度较高的物质。目前,这种方法是色谱法中中最常用最常用的一种方法。的一种方法。第十三页,讲稿共一百六十三页哦顶替法是将样品加到色谱柱头后顶替法是将样品加到色谱柱头后,在惰性流,在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂(或直接用顶有试样组分强的物质为顶替剂(或直接用顶替剂作流动相),通过色谱柱,将各组分按替剂作流动相)
10、,通过色谱柱,将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序,依次顶替出固吸附或溶解能力的强弱顺序,依次顶替出固定相。定相。很明显,吸附或溶解能力最弱的组分最先流出,很明显,吸附或溶解能力最弱的组分最先流出,最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图第十四页,讲稿共一百六十三页哦 此法适于制备纯物质或浓缩分离某此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分;其一组分;其缺点是经一次使用后,柱子缺点是经一次使用后,柱子就被样品或顶替剂饱和就被样品或顶替剂饱和,必须更换柱子,必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后,才能再使或除去被柱子吸附的物质后,才能再使用。用。AB第十五页,讲稿共一百
11、六十三页哦迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱,吸,吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出,其次则以第一组分和吸附或溶解能态流出,其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物,以此类推。流出力较弱的第二组分混合物,以此类推。流出曲线如下图曲线如下图 该法在分离多组分混合物时,除第一组分外,其该法在分离多组分混合物时,除第一组分外,其余均非纯态,因此仅适用于从含有微量杂质的混合物余均非纯态,因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分(组分中切割出一个高纯组分(组分A A),),而不适用于对混合而不适
12、用于对混合物进行分离。物进行分离。第十六页,讲稿共一百六十三页哦分类分类按流动相分按流动相分气相色谱(GC)液相色谱(LC)超临界流体色谱(SFC)按机理分按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱第十七页,讲稿共一百六十三页哦按固定相在支持按固定相在支持体中的形状分体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱第十八页,讲稿共一百六十三页哦第二节第二节 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语(一)色谱流出曲线和色谱峰(一)色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的信号强度对时间作图,由检测器输出的信号强度对时间作图,所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上
13、突起所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。部分就是色谱峰。如果进样量很小,浓度很低,在吸附如果进样量很小,浓度很低,在吸附等温线(气固吸附色谱)或分配等温线等温线(气固吸附色谱)或分配等温线(气液分配色谱)的线性范围内,则色谱(气液分配色谱)的线性范围内,则色谱峰是对称的。峰是对称的。第十九页,讲稿共一百六十三页哦第二十页,讲稿共一百六十三页哦(二)基线(二)基线 在实验操作条件下,在实验操作条件下,色谱柱后没有样色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线品组分流出时的流出曲线称为基线,稳,稳定的基线应该是一条水平直线。定的基线应该是一条水平直线。(三)峰高(三)峰高 色谱峰顶
14、点与基线之间的垂直距离,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以(以(h h)表示。表示。第二十一页,讲稿共一百六十三页哦 n色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰n基线(基线(a)n峰高(峰高(h)信信号号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱流出曲线色谱峰色谱峰第二十二页,讲稿共一百六十三页哦(四)保留值(四)保留值 1.1.死时间死时间t tM M 不不被被固固定定相相吸吸附附或或溶溶解解的的物物质质进进入入色色谱谱柱柱时时,从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值所所需需的的时时间间称称为为死死时时间间,它它正正比比于于色色谱谱柱柱的的空空隙体积,如下图隙体积,如下图。信号进样tM第二十三页,讲稿
15、共一百六十三页哦因为这种物质不被固定相吸附或溶解,因为这种物质不被固定相吸附或溶解,故故其流动速度将与流动相流动速度相近。其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速测定流动相平均线速 时,可用柱长时,可用柱长L L与与t tM M的的比值计算,即比值计算,即=L/tM第二十四页,讲稿共一百六十三页哦2.保留时间保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间,称为保留时间,如下图。经过的时间,称为保留时间,如下图。信信号号进样进样tR第二十五页,讲稿共一百六十三页哦3.3.调整保留时间调整保留时间t tR R 某组分的保留时间扣除死时间后,称某组
16、分的保留时间扣除死时间后,称为该组分的为该组分的调整保留时间调整保留时间,即即 tR=tR tM 由由于于组组分分在在色色谱谱柱柱中中的的保保留留时时间间t tR R包包含含了了组组分分随随流流动动相相通通过过柱柱子子所所需需的的时时间间和和组组分分在在固固定定相相中中滞滞留留所所须须的的时时间间,所所以以t tR R实实际际上是组分在固定相中保留的总时间。上是组分在固定相中保留的总时间。第二十六页,讲稿共一百六十三页哦保保留留时时间间是是色色谱谱法法定定性性的的基基本本依依据据,但但同同一一组组分分的的保保留留时时间间常常受受到到流流动动相相流流速速的的影影响响,因因此此色色谱谱工工作作者者
17、有有时时用用保保留留体积来表示保留值。体积来表示保留值。第二十七页,讲稿共一百六十三页哦4.4.死体积死体积V V0 0 指色谱柱在填充后,柱管内固定指色谱柱在填充后,柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时,总和。当后两项很小可忽略不计时,死死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速速F Fcoco(cmcm3 3minmin-1-1)计算计算。第二十八页,讲稿共一百六十三页哦V0=tMFco式中式中Fco为扣除饱和水蒸气压并为
18、扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。经温度校正的流速。仅适用于气相色仅适用于气相色谱谱,不适用于液相色谱,不适用于液相色谱。第二十九页,讲稿共一百六十三页哦5.5.保留体积保留体积V VR R 指从进样开始到被测组分在指从进样开始到被测组分在柱后出柱后出现浓度极大点现浓度极大点时所通过的流动相的体积。时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系:保留时间与保留体积关系:VR=tR Fco 第三十页,讲稿共一百六十三页哦6.6.调整保留体积调整保留体积V VR R 某组分的保留体积扣除死体积后,称为该某组分的保留体积扣除死体积后,称为该组分的调整保留体积。组分的调整保留体积。VR=VR V0=
19、tR Fco第三十一页,讲稿共一百六十三页哦7.7.相对保留值相对保留值r r2,12,1 某组分某组分2 2的调整保留值与组分的调整保留值与组分1 1的调整的调整保留值之比,称为相对保留值。保留值之比,称为相对保留值。r2,1=tR2/tR1=VR2/VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,因此,它在色谱法中,特别相流速无关,因此,它在色谱法中,特别是在气相色谱法中,广泛是在气相色谱法中,广泛用作定性的依据用作定性的依据。第三十二页,讲稿共一百六十三页哦 在定性分析中,通常
20、固定一个色谱峰在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(作为标准(s s),),然后再求其它峰(然后再求其它峰(i i)对对这个峰的相对保留值,此时可用符号这个峰的相对保留值,此时可用符号 表表示,即示,即 =tR(i)/tR(s)式中式中t tR R (i)(i)为后出峰的调整保留时间,为后出峰的调整保留时间,所以所以 总是大于总是大于1 1的。相对保留值往往可作的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标,又称选择因为衡量固定相选择性的指标,又称选择因子。子。第三十三页,讲稿共一百六十三页哦(五五)区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参
21、数之一,用于衡量柱效率及反映色谱操要参数之一,用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有通常有三种方法三种方法。第三十四页,讲稿共一百六十三页哦1.1.标准偏差标准偏差-即即0.6070.607倍峰高处色谱峰倍峰高处色谱峰宽的一半。宽的一半。2.2.半半峰峰宽宽Y Y1/21/2-即即峰峰高高一一半半处处对对应应的的峰峰宽宽。它与标准偏差的关系为它与标准偏差的关系为 Y Y1/21/2=2.354=2.354 3.3.峰峰底底宽宽度度Y Y-即即色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上的的切切线线在在基基线线上上截截距距间间的的距距离离
22、。它它与与标标准准偏偏差差 的关系是的关系是 Y=4 Y=4 第三十五页,讲稿共一百六十三页哦第三十六页,讲稿共一百六十三页哦从色谱流出曲线中,可得许多重要信息:从色谱流出曲线中,可得许多重要信息:(i)i)根根据据色色谱谱峰峰的的个个数数,可可以以判判断断样样品品中中所所含含 组分的最少个数;组分的最少个数;(ii)ii)根根据据色色谱谱峰峰的的保保留留值值,可可以以进进行行定定性性分分析;析;(iii)iii)根根据据色色谱谱峰峰的的面面积积或或峰峰高高,可可以以进进行行定定量分析;量分析;(iv)iv)色色谱谱峰峰的的保保留留值值及及其其区区域域宽宽度度,是是评评价价色谱柱分离效能的依据
23、;色谱柱分离效能的依据;(v)v)色色谱谱峰峰两两峰峰间间的的距距离离,是是评评价价固固定定相相(或或流动相)选择是否合适的依据。流动相)选择是否合适的依据。第三十七页,讲稿共一百六十三页哦 色谱分析的色谱分析的目的目的是将样品中是将样品中各组分彼此分离各组分彼此分离,组分,组分要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间的要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色谱过距离是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色谱过程的热力学性质有关。程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离,如果每个峰都很宽,以致彼但是两峰间虽有一定距离,如果每个峰都很宽
24、,以致彼此重叠,还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱此重叠,还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的,即与色谱过程的动力学性质柱中传质和扩散行为决定的,即与色谱过程的动力学性质有关。因此,有关。因此,要从热力学和动力学两方面来研究色谱要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。行为。第三十八页,讲稿共一百六十三页哦(一)分配系数(一)分配系数K K和分配比和分配比k k1.1.分配系数分配系数K K 分分配配色色谱谱的的分分离离是是基基于于样样品品组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间反反复复多多次次的的分分配配过过程程,而而吸吸附附色色谱谱的的分分离离是
25、是基基于于反反复复多多次次的的吸吸附附-脱脱附附过过程。程。这这种种分分离离过过程程经经常常用用样样品品分分子子在在两两相相间间的的分分配配来来描描述述,而而描描述述这这种种分分配配的的参参数数称称为为分配系数分配系数K K。第三十九页,讲稿共一百六十三页哦 它它(K K)是是指指在在一一定定温温度度和和压压力力下下,组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间分分配配达达平平衡衡时时的的浓浓度度之之比比值值,即即 K=K=溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 =Cs/Cm 第四十页,讲稿共一百六十三页哦 分配系数是由组分和固定相的热力分配系数
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