聚丙烯酰胺凝胶电泳课件.ppt

《聚丙烯酰胺凝胶电泳课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚丙烯酰胺凝胶电泳课件.ppt（42页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳第1页，此课件共42页哦1 1、作用、作用 分离蛋白质、核酸分离蛋白质、核酸2 2、概念、概念 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pHpH和温度和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。的电泳支持介质。第2页，此课件共42页哦 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（聚

2、丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂）和交联剂N,NN,N-亚甲基双丙烯酰胺（亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。）在催化剂作用下合成。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。应、分子筛效应。电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致）大小形状不同所致）3、原理、原理第3页，此课件共42页哦v（1）丙烯酰胺结构式第4页，此课件共42页哦（2）亚甲双丙烯酰胺）亚甲双丙烯酰胺第5页，此课件共42页哦

3、第6页，此课件共42页哦PAGE 的的 聚聚 合合v需要催化剂需要催化剂氧化还原系统作用，使氧化还原系统作用，使Acr单体单体带有游离基，从而与带有游离基，从而与Bis进行聚合。进行聚合。v（1）化学聚合：）化学聚合：AP-TEMED系统系统v过硫酸胺过硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。为加速剂。vAP在水溶液中能产生游离基在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离然后游离Acr和和B

4、is作用就能聚合形成凝胶。作用就能聚合形成凝胶。vTEMED的游离碱基能促进的游离碱基能促进AP的形成的形成SO42-。第7页，此课件共42页哦v注意：注意：v TEMED量多少都会影响催化作用，量多少都会影响催化作用，须在碱性须在碱性条件下聚合条件下聚合v 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧绝氧v 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合第8页，此课件共42页哦（2）光聚合：核黄素）光聚合：核黄素-TEMED系统系统v核黄素核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外在光照下（可见光或紫外光）分解，

5、其黄素部分被还原成无色型，但在有光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使其也能使Acr和和Bis聚合形成凝胶。聚合形成凝胶。v注意：注意：v分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。第9页，此课件共42页哦非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（变

6、性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）（根据亚基分子量分离蛋白质）（根据亚基分子量分离蛋白质）第10页，此课件共42页哦SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳第11页，此课件共42页哦 概述概述v1967年由年由Shapiro建立。建立。v1969年由年由Weber和和Osborn进一步完善。进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（去污剂（SDS）以后以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于要取决于亚基分子量的

7、大小亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。电荷因素可以忽视。第12页，此课件共42页哦基本原理基本原理1.1.蛋白质分子的解聚蛋白质分子的解聚(1)SDS(1)SDS（十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate,SDS)阴离子去污剂阴离子去污剂变性剂变性剂助溶性试剂助溶性试剂断裂分子内和分子间的氢键断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构破坏蛋白质分子的二级和三级结构第13页，此课件共42页哦v(2)强还原剂强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的使半胱氨酸残基之间的

8、二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。谱带即为蛋白质亚基。第14页，此课件共42页哦实验原理实验原理第15页，此课件共42页哦第16页，此课件共42页哦-第17页，此课件共42页哦SDSSDS和还原剂的作用：和还原剂的作用：（1）分子被解聚成组成它们的多肽链）分子被解聚成组成它们的多肽链（2）氨基酸侧链与）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。的电荷差异。第1

9、8页，此课件共42页哦蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束的特点：胶束的特点：（1）形状像一个长椭圆棒）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的胶束基本上是相同的（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。胶束在胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于椭系统中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。第19页，此课件共42页哦 2.2.凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 由于由于SDSSDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只电

10、泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后取决于分子解聚后SDS-SDS-蛋白质复合物的大小，因此凝蛋白质复合物的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。胶浓度的选择会直接影响分辨率。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。蛋白质的分子量在蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率与之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，因此分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅可以分不仅可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量。基的分子量。第20页，此课

11、件共42页哦PAGE的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系vPAGE孔径的大小主要由孔径的大小主要由Acr和和Bis这两种单体的这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。择合适的单体浓度。vAcr/Bis：2040 完全透明且有弹性；完全透明且有弹性；v 10 很脆，易碎，不透明；很脆，易碎，不透明；v 100 糊状不成形，易破碎。糊状不成形，易破碎。第21页，此课件共42页哦凝胶总浓度凝胶总浓度凝胶总浓度凝胶总浓度T T 100ml 100ml凝胶溶液中含有凝胶溶液中含有凝胶溶液中含有凝胶溶液中含有AcrAcr和和和和Bi

12、sBis的总克数。的总克数。的总克数。的总克数。T=T=（a+ba+b）/m100%/m100%T T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。CBisCBisCBisCBis占单体与交联剂总量的百分比。占单体与交联剂总量的百分比。占单体与交联剂总量的

13、百分比。占单体与交联剂总量的百分比。C=b/C=b/C=b/C=b/（a+ba+ba+ba+b）100%100%100%100%当当当当T T T T固定时，固定时，固定时，固定时，BisBisBisBis浓度在浓度在浓度在浓度在5%5%5%5%时孔径最小。时孔径最小。时孔径最小。时孔径最小。第22页，此课件共42页哦3、分类、分类按具体操作分按具体操作分 垂直板形电泳垂直板形电泳 圆盘电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分按凝胶系统的均匀性分 连续连续PAGEPAGE 不连续不连续PAGEPAGE 第23页，此课件共42页哦电泳体系中所用的缓冲液成分、电泳体系中所用的缓冲液成分、pHpH、凝胶浓度

14、相同、凝胶浓度相同缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pHpH、凝胶浓度、凝胶浓度及电位梯度呈不连续性及电位梯度呈不连续性不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好，分不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好，分辨率高，是最常用的体系。辨率高，是最常用的体系。电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应浓缩效应：不连续性所致浓缩效应：不连续性所致连续电泳连续电泳不连续电泳不连续电泳PAGE电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应第24页，此课件共42页哦不连续不连续SDS-PAGESDS-PAGE 1.1.原理原理凝胶的不连续性凝胶的不连续性缓冲离子的不连续性缓冲离子的不连续性 pH的不连续性的不连续性电位梯度的不

15、连续性电位梯度的不连续性分离胶分离胶pH8.9浓缩胶浓缩胶pH6.7第25页，此课件共42页哦 凝胶的不连续性：凝胶的不连续性：浓缩胶：浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。分离胶：分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处

16、就会使样品浓缩，取带变窄。品浓缩，取带变窄。第26页，此课件共42页哦 缓冲离子的不连续性缓冲离子的不连续性 pHpH的不连续性的不连续性 电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性制胶缓冲液：制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶浓缩胶 pH6.7 分离胶分离胶pH8.9电泳缓冲液：电泳缓冲液：Tris-甘氨酸甘氨酸 在浓缩胶中，在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电场作用下泳动效率低，而场作用下泳动效率低，而Cl却很高，两者之间形成却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间泳动。导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间泳动。第27页，此课件共

17、42页哦 由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。浓缩为一狭窄的区带。样品进入分离胶（样品进入分离胶（pH8.9pH8.9）后，由于胶中）后，由于胶中pHpH的增的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随Cl-Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。之后，样品不再受离子界面的影响。第28页，此课件共42页哦第29页，此课件共42页哦实验过程实验过程凝胶制备凝胶制备样品处理与加样样品处理与加样电泳电泳剥胶与

18、固定剥胶与固定染色与脱色染色与脱色安装电泳槽安装电泳槽第30页，此课件共42页哦实验步骤实验步骤一、制胶一、制胶 1.1.配胶配胶 配胶应根据所测蛋配胶应根据所测蛋 白质相对分子质量范白质相对分子质量范 围选择适宜的分离胶围选择适宜的分离胶 浓度。由于浓度。由于SDS-PAGESDS-PAGE 有连续体系和不连续有连续体系和不连续 体系两种，两者各有体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而不同缓冲体系，因而 有不同的配制方法有不同的配制方法。（以不连续体系为例）。（以不连续体系为例）蛋白蛋白质质的相的相对对分子量分子量的范的范围围分离胶的分离胶的浓浓度度10420%30%1104410415%2

19、0%4104110510%15%110551055%10%51052%5%第31页，此课件共42页哦试剂名称试剂名称配制配制20ml不同浓度分离胶不同浓度分离胶所需各种试剂用量所需各种试剂用量/ml配制配制10ml浓缩胶浓缩胶所需试剂用量所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分离胶缓冲液分离胶缓冲液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液浓缩胶贮液（10%Acr-0.5%Bis）-3.0浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液（pH6.8Tris-HCl）-1.2510%SDS 0.20

20、0.200.200.200.101%TEMED 2.002.002.002.002.00重蒸馏水重蒸馏水 11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.100.100.100.05第32页，此课件共42页哦2.2.分离胶的制备分离胶的制备 胶灌至距梳子齿下端胶灌至距梳子齿下端1 1cmcm灌毕灌毕封上一层水加速封上一层水加速 聚合聚合当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。3.3.浓缩胶的制备浓缩胶的制备 用滤纸吸干水用滤纸吸干水倒入倒入 浓缩胶浓缩胶插入梳子插入梳子静置，聚合。静

21、置，聚合。第33页，此课件共42页哦二、二、样品处理与加样样品处理与加样 1.1.样品处理样品处理 2.2.加样加样 小心拔出梳子小心拔出梳子 上下槽上下槽 注入电极缓冲液注入电极缓冲液 用用 微量进样器点样微量进样器点样三、电泳三、电泳 接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开 开关，保持恒压进行电泳。开关，保持恒压进行电泳。样品样品样品样品 溶解溶解溶解溶解 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴 冷却冷却冷却冷却加样加样样品样品迁移迁移方向方向样品溶解液样品溶解液样品溶解液样品溶解液第34页，此课件共42页哦 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞电

22、泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子第35页，此课件共42页哦流程图流程图第36页，此课件共42页哦结果分析结果分析1.1.相对迁移率的计算相对迁移率的计算 相对迁移率相对迁移率mR=mR=蛋白质样品距加样端迁移距离蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)

23、(cm)标准蛋白在标准蛋白在SDS-SDS-凝胶上的示意图凝胶上的示意图第37页，此课件共42页哦 2.2.标准曲线的绘制标准曲线的绘制 以每条以每条MarkerMarker带的相对迁移率为横坐标，相应分带的相对迁移率为横坐标，相应分 子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图 分分子子量量相对迁移率相对迁移率第38页，此课件共42页哦3.未知蛋白质样品分子量的测算未知蛋白质样品分子量的测算 计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量

24、。如图如图第39页，此课件共42页哦在一定的凝胶浓度下，多在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量线求未知多肽链分子量。标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白 相对迁移率相对迁移率SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量示意图测定蛋白质分子量示意图第40页，此课件共42页哦注意事项注意事项1.SDS1.SDS的纯度：的纯度：市售市售SDS(A.R.)SDS(A.R.)需重结晶后再用。需重结晶后再用。2.SDS2.SDS与蛋白质的结合量：与蛋白质的结

25、合量：大多数大多数1.4g SDS/g蛋白质蛋白质 影响蛋白质和影响蛋白质和SDSSDS结合的因素主要有以下结合的因素主要有以下3 3个：个：(1)(1)溶液中溶液中SDSSDS单体的浓度单体的浓度 (2)(2)样品缓冲液的离子强度样品缓冲液的离子强度 (3)(3)二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原3.3.凝胶浓度：凝胶浓度：应根据位置样品估计相对分子质量，应根据位置样品估计相对分子质量，选择适当的凝胶浓度。选择适当的凝胶浓度。测定蛋白质相对分子量时，测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线，不能利用这次的标准曲线必须同时作标准曲线，不能利用这次的标准曲线 作为下次用。作为下次用。第4

26、1页，此课件共42页哦4.4.多亚基蛋白的分子量：多亚基蛋白的分子量：有许多蛋白质，是由亚有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋胰凝乳蛋白酶）组成的，白酶）组成的，SDS-PAGESDS-PAGE测定的只是它们的亚基或测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。5.5.特殊蛋白质的相对分子质量：特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白不是所有的蛋白质都能用质都能用SDS-PAGESDS-PAGE测定其分子量。包括：电荷异常或测定其分子量。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。6.6.对样品的要求：对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。应采纳低离子强度的样品。第42页，此课件共42页哦